ספקטרומטר מסה (MS) התפתחה כלי חשוב החקירה של מבנה, הדינמיקה של הרכבות macromolecular. כאן, אנחנו משלבים גישות MS לחקור היווצרות מורכבות חלבון ואיגוד ליגנד.
חלבונים הם מחלקה חשובה של מקרומולקולות ביולוגיות לשחק תפקידים מרכזיים רבים תאיים כולל ביטוי גנים, ותזרז תגובות חילוף החומרים, תיקון ה-DNA, שכפול. לכן, הבנה מפורטת של תהליכים אלה מספק מידע חיוני על איך תאים פונקציה. שיטות MS מבניים אינטגרטיבית מציע מידע דינמיות מבניים על מכלול מורכבים חלבון, קישוריות מורכבים, יחידת משנה סטויכיומטריה, חלבון oligomerization ואיגוד ליגנד. התפתחויות אחרונות MS מבניים אינטגרטיבית אפשרו עבור אפיון מערכות ביולוגיות מאתגר כולל גדול DNA מחייבת חלבונים וחלבונים ממברנה. פרוטוקול זה מתאר את אופן שילוב נתונים MS מגוונים כגון MS מקורית, יון ניידות-ספקטרומטריית (IM-MS) עם דינמיקה מולקולרית סימולציות לקבלת תובנות לתוך ה-DNA נוקלאז הליקאז תיקון החלבונים. הגישה המתקבלת מספקת מסגרת ללימודי מפורט של ליגנד מחייב מתחמי חלבונים אחרים המעורבים בתהליכים ביולוגיים חשובים.
ניתוח המוני spectrometric מקורית של חלבונים שלמים, מתחמי שלהם מתבצעת באמצעות ספקטרומטריית electrospray ו ננו-ספקטרומטריית electrospray יינון (נאסי), המשמרים קיפול חלבונים ואינטראקציות שאינם קוולנטיות במהלך תהליך יינון1, 2. ב- MS מקורית, המבנה של חלבונים, מתחמי שלהם נשמרות במצב קרובה לשפת אם3,גז-שלב4. MS יליד מזהה יונים חלבון טעונה מרובים, אשר מופרדים על-פי מסת לחייב יחס (מ/z) המאפשר את המסה של חלבון או חלבון-ליגנד מורכבים לחשב. מידע זה מאפשר קביעת של חלבון שלם סטויכיומטריה, יחידת משנה הרכב, איגוד ליגנד ו אינטראקציה רשתות3,4,5,6. MS מקורי יש כמה יתרונות לעומת טכניקות אחרות כגון קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה5. ראשית, יליד MS הוא טכניקה מהירה, רגישה מאוד, המחייב רק כמה microliters (2-3 µL) מדגם בריכוזים מורכבות נמוכה יחסית הסופי ב- nM גבוהה מיקרומטר נמוכה בטווח6. שנית, יליד MS יכול לשמש כדי לחקור דגימות חלבון הטרוגנית בכך ניתן לנתח מספר חלבונים ומדינות oligomeric בו זמנית. שלישית, יליד MS לא דורשת דגימות חלבון כדי להיות שונה לפני ניתוח על-ידי crosslinking כימי או חלבון תוויות. יתרונות אלה הפכו מבניים MS כלי רב עוצמה עבור החקירה מבנית של מתחמי חלבון.
MS מקורית ניתן לשלב עם יון ניידות (IM), טכניקה המודד את הזמן שיון חלבון לוקח לנסוע דרך שדה חשמלי, המאפשר את חתך collisional (מיליגרם) נקבע. CCS מספקת מידע מבניים ברזולוציה נמוכה, המאפשרת טופולוגיה ומידע הסתגלותי הטרוגניות של חלבונים כדי להתקבל. יתר על כן, היא מאפשרת הבחינה של מודלים מבניים חלבון שנוצר על ידי גישות חישובית.
יציבות גז-פאזי חלבון יכול ייחקרו באמצעות התנגשות המושרה התגלגלות (ciu לקדם) נמדד מאת IM-MS. במהלך תהליך ciu לקדם, חלבון יונים מואצת, מופעלת באמצעות מוגברת מאיץ התנגשויות גז אינרטי מאגר בתוך ספקטרומטר מסה7,8,9. תהליך ההפעלה collisional זה גורם החלבון להתגלות חלקית, אשר מיתרגם עלייה מיליגרם. שינוי זה CCS, האנרגיה הדרושה כדי לגולל את החלבון יכול להיות נמדד באמצעות IM-גב’ בגישה זו, ההשפעה של ליגנד מחייב על יציבות חלבון יכול להיות נמדדו10. ניתן להפיק subcomplexes בתמיסה בשיטות הפרעה בפתרונות כגון התוספת של ממיסים אורגניים לפקח טופולוגיות כמו מקורי של מתחמי חלבון. שיבוש מתחמי חלבון הוא בעיקר עקב שיבוש אינטראקציות אי-קוולנטיות “אינטרה”. מתחמי משנה לשמור על ילידים דמויי טופולוגיות, זיהוי MS, לחשוף מידע אודות קישוריות בין יחידה משנית.
גישות אינטגרטיבית בביולוגיה מבנית לשלב שיטות מגוונות כדי ללמוד את המבנה ואת הדינמיקה של חלבונים ו שלהם מתחמי3,4,5,6. יליד MS ו- IM-MS שימשו לגלות את הפרטים המולקולרי של מערכות ביולוגיות מאתגר. היו מספר דוגמאות של יישומים כולל המחקר של חלבון הרכבה מסלולים11,12,13,14, לומד רשתות אינטראקציית חלבון-חלבון15 , 16 , 17קרום חלבונים6,18,19,20,21, אינטראקציות חלבון-ליגנד כגון חומצות גרעין22,23 ,24.
עם זאת, יליד MS יש גם המגבלות. יליד MS מדידות מבוצעות לעתים קרובות במאגרי נדיפים כגון אמוניה מימית אצטט שבו כמה חלבונים לא ישמרו שלהם במצב מקופל יליד3,25. בכל זאת, העבודה האחרונה הראו כי מגבלה זו ניתן להתגבר על ידי אופטימיזציה של ריסוס בקוטר קצה המחט (טיפים 0.5 מ מ) כך חלבון ו יונים מורכבים חלבון יכול להיווצר ישירות מתוך מאגרי לא נדיף עם יונית-חזקה יותר לחקות סביבה פיזיולוגיים26. בנוסף, יליד MS משתמשת ספקטרומטריית electrospray ionize ולהעביר את הרכבות קשרי ערכיות מהפתרון לשלב גז; לכן, שפע יחסי של מתחמי שאותרו לא מלאה מייצג זה פתרון5,27. יתר על כן, לשם השוואה כדי בתמיסה, אינטראקציות הידרופוביות שלב גז הפך חלש יותר, אלקטרוסטאטיות להתחזק, ולכן העדיף3,28.
במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקולים, ניתוח נתונים, פרשנות עבור זיהוי חלבונים וליגנד איגוד באמצעות MS מקורית, IM-MS, ciu לקדם, הפרעה בפתרונות, ו דוגמנות. המתחם תיקון ה-DNA, הרה-נורא, משמשת כמערכת מודל. מעברי כפול גדילי הדנ א (DSBs) הם אחת הצורות ביותר ציטוטוקסיות, ברישול של נזק לדנ א, וכתוצאה מכך לחוסר יציבות גנטית, ההתפתחות של סרטן בבני אדם. רקומבינציה הומולוגית היא מנגנון תיקון אשר משורשה DSBs, תהליך אשר הוא בניצוחו של ה ATP הליקאז התלויים-נוקלאז מתחם הרה-נורא22.
שילוב מקורי MS ו- IM-MS עם מבחני פונקציונלי, דגמי מותר החקירה של: i) את התפקיד של נורה הרכבה, קונפורמציה ולאחר היציבות של המתחם, ii) האינטראקציה בין dsDNA לבין המתחם והשפעתו על הכולל יציבות של המתחם, ו- iii) סטויכיומטריה וההשפעה של ATP מחייב מכלול22. בסך הכל, הוביל להבנה משופרת הבסיס המולקולרי של המתחם הרה-נורה על-ידי קישור חלבונים מורכבים שינויים הסתגלותי ויציבות עם נוקלאוטיד מחייב. פרוטוקול זה הוא כללי עבור כל complex(es) חלבון אשר מקיים אינטראקציה עם אחד או מספר סוגי ligand(s).
MS משחק תפקיד חשוב יותר ויותר באפיון סטויכיומטריה, אינטראקציות ואדריכלות יחידת משנה של מתחמי חלבון. IM-MS נתונים יכול לשמש להגדרת סידורים טופולוגי של subunits בתוך מתחמי. MS, לעומת שיטות אחרות-ביולוגיה מבנית קיים, יש מספר יתרונות. MS מקורית היא טכניקה מהירה, רגישה מאוד והוא יכול לשמש כדי לחקור דגימות חלבון הטרוגנית. כאשר משולב עם הפרעה בפתרון ניסויים, ניתן לנטר דיסוציאציה מסלולים של חלבון הרכבות. יחד עם מבנים קריסטל או מודלים הומולוגיה, המידע המוצעים על ידי MS מבניים מציע כלי עבור חוקרים אינטראקציות חלבון-ליגנד ומספקים הרכבה מסלולים11ומודלים קרובה לשפת אם.
כאן, אנו מתארים נהלי ניסיוני הצורך לנתח את סטויכיומטריה והרכב של אינטראקציות חלבון-ליגנד, עם ליגנדים אחד או יותר, באמצעות MS אינטגרטיבית. זה כולל הכנת הדוגמא MS, חדרי קירור והקפאה, ניתוח נתונים, השילוב של נתונים MS באמצעות כלים חישוביים. כדי לעשות זאת, השתמשנו החלבון הטרו-oligomeric DNA-כריתה הרה-נורא מורכבת, מאוגדים ליגנדים שלוש (דנ א, ATP ו ADP), כמערכת מודל שלנו. הפרוטוקול מראה את השימוש בתוכנה זמין כעת כדי לסייע לניתוח נתונים והצגה.
רכישת ספקטרה באיכות גבוהה חשוב לניתוח איגוד ליגנד, לכן, צעדים הכנה מדגם זהיר הם קריטיים, כולל טיהור חלבון, ליגנד טיטור מאגר exchange. מגבלה אחת של נאסי MS יליד כשלמדתי ליגנד מחייב הוא מחייב שאינם ספציפיים. איגוד שאינו ספציפי מתרחשת במהלך droplet desolvation לאורך כל התהליך ספקטרומטריית electrospray. זה מגביר ריכוז ליגנד ומשנה ולכן יחס חלבון/ליגנד29. הכריכה של נוקלאוטידים יוצרת הבדל מסה קטנה יחסית בין אפו נוקלאוטיד מכורך חלבון אשר אינו משנה את יעילות יינון50,51.
השתמשנו במערכת Synapt G2-סי MS עבור העבודה שלנו, אבל הפרוטוקולים הינם ישימים עבור חקירות שונים של מתחמי חלבון-ליגנד אחרים באמצעות ספקטרומטרים המונים אחרים זמינים מסחרית ננו-ספקטרומטריית electrospray. MS מבניים אינטגרטיבית יותר ויותר משחק תפקיד חשוב בטיפול בעיות ביולוגיות מורכבות גדולה יותר. זרימת העבודה והטכניקות המתוארים כאן הם מתאים היטב להבנת ההשלכות מבנית, בניית מנגנונים של חלבונים מורכבים, היווצרות חלבון-ליגנד אשר אחרת קשה ללמוד באמצעות טכניקות מבניים קונבנציונלי .
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות. פיטר קארל Hopfner, רוברט תומאס ביירן בחביבות לספק הרה הרה-נורא חלבון דגימות, על עזרתם עם עיצוב ניסיוני. אנו מודים גם ד ר איימון הקריאה שלו לבדיקה של כתב היד. אנו בתודה להכיר את גופנו מימון: טרסט [109854/Z 15 Z] והחברה המלכותית [RG150216 על אקולוגיה].
Adenosine 5′-(3-thiotriphosphate) tetralithium salt | Merck Millipore | 119120-25MG | |
Adenosine 5′-diphosphate | Sigma-Aldrich | 20398-34-9 | |
Ammonium acetate solution | Sigma-Aldrich | A2706 | |
Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 7326204 | |
Vivaspin concentrator | Sartorius | Z614041-25EA | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
Water TraceSelect | Sigma-Aldrich | 95305 | |
Borosilicate Capillaries | Harvard Apparatus | 300060 |