Massespektrometri (MS) har dukket opp som en viktig verktøy for å undersøke strukturen og dynamikken i macromolecular samlinger. Her integrere vi-baserte tilnærminger til å forhøre protein kompleks dannelse og ligand binding.
Proteiner er en viktig biologiske makromolekyler spiller mange viktige roller i cellulære funksjoner inkludert genuttrykk, utløse metabolske reaksjoner, DNA-reparasjon og replikering. Derfor en grundig forståelse av disse prosessene gir viktig informasjon om hvordan celler funksjon. Integrerende strukturelle MS metoder tilbyr strukturelle og dynamiske informasjon om protein kompleks sammenstilling, komplekse tilkobling, delenhet støkiometri, protein oligomerization og ligand binding. Nylige fremskritt innen integrerende strukturelle MS har tillatt for karakterisering av utfordrende biologiske systemer inkludert store DNA bindende proteiner og membran proteiner. Denne protokollen beskriver hvordan å integrere ulike MS data som opprinnelig MS og ion mobilitet-massespektrometri (IM-MS) med molekylære dynamikk simuleringer å få innsikt i en helicase-nuclease DNA reparasjon protein kompleks. Den resulterende tilnærmingen gir et rammeverk for detaljerte studier av ligand binding til andre protein komplekser involvert i viktige biologiske prosesser.
Opprinnelige masse spectrometric analyse av intakt proteiner og deres komplekser er utført med electrospray og nano-electrospray ionization (het nESI), som bevare proteinfolding og ikke-kovalente interaksjoner under ionisering prosessen1, 2. I native MS, proteiner og deres komplekser beholdes i en nær-innfødt stat i gassfase-3,4. Native MS oppdager flere ladet protein ioner, som skilles etter masse deres å lade forholdet (m/z) slik at massen av protein- eller protein-ligand komplekse skal beregnes. Denne informasjonen kan fastsettelse av en intakt protein støkiometri, delenhet komposisjon, ligand binding og samhandling, nettverk,3,,4,,5,,6. Native MS har flere fordeler sammenlignet med andre teknikker slik Røntgenkrystallografi og kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi5. Først er innfødt MS en rask og svært følsom teknikk, krever bare noen microliters (2-3 µL) eksempel på relativt lav siste komplekse konsentrasjoner i den høye nM lav µM utvalg6. Dernest kan innfødt MS brukes til å forhøre heterogene protein prøver gjør det mulig å analysere flere proteiner og oligomeric USA samtidig. For det tredje, krever ikke innfødt MS protein prøver endres før analyse av kjemiske crosslinking eller protein merking. Disse fordelene har gjort strukturelle MS et kraftig verktøy for strukturelle etterforskningen av protein komplekser.
Native MS kan kombineres med ion mobilitet (IM), en teknikk som måler tiden et protein ion tar reise gjennom et elektrisk felt, slik at det collisional tverrsnittet (CCS) skal fastsettes. CCS gir lav strukturinformasjon, som muliggjør topologi og conformational heterogenitet informasjon proteiner innhentes. Videre tillater undersøkelse av protein strukturelle modeller generert av computational tilnærminger.
Protein gassfase-stabilitet kan undersøkes med kollisjon indusert unfolding (CIU) målt av IM-MS. Under CIU prosessen, er protein ioner akselerert og aktivert via økt akselererende kollisjoner med en inert buffer gass i en masse spectrometer7,8,9. Denne collisional aktiveringsprosessen fører protein til delvis utfolder seg, noe som resulterer i en økning i CCS. Denne endringen i CCS og energien som kreves for å utfolde protein kan være målt IM-MS. med denne tilnærmingen, effekten av ligand binding på protein stabilitet kan være målt10. Subcomplexes kan genereres i løsning ved hjelp av i-løsning avbrudd metoder som tillegg av organiske løsemidler for å overvåke native-lignende topologier av protein komplekser. Avbrudd av protein komplekser er hovedsakelig på grunn av avbrudd i intra ikke-kovalente interaksjoner. Sub komplekser opprettholde native-lignende topologier og på MS gjenkjenning, avslører informasjon om Inter delenhet tilkobling.
Integrerende tilnærminger i strukturell biologi kombinere ulike metoder for å studere strukturen og dynamikken i proteiner og deres komplekser3,4,5,6. Native MS og IM-MS har blitt brukt til å avdekke molekylær detaljer om utfordrende biologiske systemer. Det har vært flere eksempler på programmer inkludert studiet av protein montering trasé11,12,13,14, studere protein-protein samhandling nettverk15 , 16 , 17og membran proteiner6,18,19,20,21protein-ligand interaksjoner som nukleinsyrer22,23 ,24.
Native MS har imidlertid også sine begrensninger. Native MS målinger er ofte utført i flyktige buffere som vandig ammonium acetate der noen proteiner ikke beholde sine foldet opprinnelig tilstand3,25. Likevel har nylig arbeid vist at denne begrensningen kan overvinnes ved optimalisering av sprøyting nål tuppens diameter (0,5 mm tips) slik at protein og protein kompleks ioner kan dannes direkte fra permanente buffere med høy-ioniske-styrke som bedre etterligne den fysiologiske miljø26. I tillegg bruker innfødt MS electrospray ionisere og overføre ikke-kovalente samlinger fra løsning til gassform; Derfor kan den relative overfloden av oppdaget komplekser ikke helt representere som i løsning5,27. Videre i forhold til i løsningen, gass fase hydrofobe samhandlingene bli svakere og elektrostatiske interaksjoner bli sterkere og dermed foretrakk3,28.
I denne artikkelen gir vi protokoller, dataanalyse og tolkning for protein identifikasjon og ligand binding bruke native MS, IM-MS, CIU, i-løsning avbrudd, og modellering. DNA reparasjon komplekset, HerA-NurA, brukes som et modellsystem. DNA double-strandet bryter (DSBs) er en av de mest cytotoksiske og skadelige formene for DNA skade, genetisk ustabilitet og en eventuell utvikling av kreft hos mennesker. Homologe rekombinasjon er reparasjon mekanismen som eradicates DSBs, en prosess som er organisert av ATP avhengige helicase-nuclease komplekset, HerA-NurA22.
Kombinere innfødt MS og IM-MULTIPLE Sclerosis med funksjonell analyser og modellering tillatt etterforskningen av: i) rollen Nura i samlingen, konformasjon og stabilitet av komplekset, ii) samspillet mellom dsDNA og komplekset og dens innflytelse på samlet stabilitet i komplekset og iii) støkiometri og virkningen av ATP bindende montering22. Samlet dette arbeidet førte til en bedre forståelse av molekylære grunnlaget for HerA-NurA komplekset ved å koble protein kompleks conformational endringer og stabilitet med nukleotid binding. Denne protokollen er generiske for noen protein complex(es) som samhandler med en eller flere ligand(s).
MS spiller en stadig viktigere rolle i karakteriserer støkiometri, samhandling og delenhet arkitektur av protein komplekser. IM-MS data kan brukes til å definere topologisk arrangementer av underenheter innen multicomponent komplekser. Sammenlignet med andre eksisterende strukturell biologi metoder, har MS flere fordeler. Native MS er en rask og svært følsom teknikk og kan brukes å undersøke heterogene protein prøver. Når kombinert med i-løsning avbrudd eksperimenter, kan dissosiasjon veier av protein samlinger overvåkes. Crystal strukturer eller homologi modeller, informasjonen som tilbys av strukturelle MS tilbyr et verktøy for å undersøke protein-ligand interaksjoner og gir nær-innfødt modeller og montering trasé11.
Her beskriver vi de nødvendige eksperimentelle prosedyrene for å analysere støkiometri og sammensetningen av protein-ligand samhandling, med én eller flere ligander, med integrerende MS. Dette inkluderer MS utvalg forberedelse, datainnsamling, analyse og integrering av MS data ved hjelp av beregningsorientert verktøy. Dette gjør brukte vi DNA-resection HerA-NurA hetero-oligomeric protein kompleks, bundet til tre ligander (DNA, ATP og ADP), som vår modell. Protokoll viser bruken av tilgjengelig programvare for å hjelpe analyse og presentasjon.
Anskaffe høykvalitets spectra er viktig for ligand binding analyse, derfor nøye utvalg forberedelsene er kritisk, inkludert protein rensing, ligand titrering og buffer exchange. En begrensning av het nESI innfødte MS når studere ligand binding er uspesifisert bindende. Non-spesifikke bindingen skjer under dråpe desolvation gjennom hele electrospray prosessen. Dette øker ligand konsentrasjonen og derfor endrer protein/Ligand forholdet29. Binding av nukleotider resulterer i en relativt liten masse forskjell mellom Oslo og nukleotid-bundet protein som ikke endrer ionisering effektivitet50,51.
Vi brukte Synapt G2-Si MS systemet for vårt arbeid, men protokollene gjelder for ulike undersøkelser av andre protein-ligand komplekser bruker andre tilsvarede nano-electrospray masse spektrometre. Integrerende strukturelle MS spiller stadig en viktig rolle i å håndtere biologiske problemer av større kompleksitet. Arbeidsflyt og teknikker som er beskrevet her er velegnet for å forstå de strukturelle konsekvensene og bygge mekanismer av protein kompleks og protein-ligand formasjon som er vanskelig å studere med konvensjonelle strukturelle teknikker .
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Karl-Peter Hopfner og Robert Thomas Byrne vennlige gi HerA og HerA-NurA protein prøver og deres hjelp med eksperimentell design. Vi takker også Dr. Eamonn Reading for sin gjennomgang av manuskriptet. Vi erkjenner takknemlig finansiering kroppen: Wellcome Trust [109854/Z/15/Z] og Royal Society [RG150216 til A.P.].
Adenosine 5′-(3-thiotriphosphate) tetralithium salt | Merck Millipore | 119120-25MG | |
Adenosine 5′-diphosphate | Sigma-Aldrich | 20398-34-9 | |
Ammonium acetate solution | Sigma-Aldrich | A2706 | |
Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 7326204 | |
Vivaspin concentrator | Sartorius | Z614041-25EA | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
Water TraceSelect | Sigma-Aldrich | 95305 | |
Borosilicate Capillaries | Harvard Apparatus | 300060 |