Massespektrometri (MS) er opstået som et vigtigt redskab for undersøgelse af strukturen og dynamikken i makromolekylære forsamlinger. Her, integrere vi MS-baserede tilgange til at afhøre protein kompleks dannelse og ligand bindende.
Proteiner er en vigtig klasse af biologiske makromolekyler, der spiller mange vigtige roller i cellulære funktioner herunder genekspression, katalysere metaboliske reaktioner, DNA reparation og replikeringsdata. Derfor, en detaljeret forståelse af disse processer indeholder vigtige oplysninger om, hvordan celler funktion. Integrativ strukturelle MS metoder giver strukturelle og dynamiske oplysninger om protein kompleks samling, komplekse connectivity, subunit støkiometrisk, protein oligomerisering og ligand bindende. De seneste fremskridt i Integrativ strukturelle MS har tilladt for karakterisering af udfordrende biologiske systemer, herunder store DNA-bindende proteiner og Membranproteiner. Denne protokol beskriver hvordan man kan integrere forskellige MS data såsom indfødte MS og ion mobilitet-massespektrometri (IM-MS) med molecular dynamics simulationer for at få indblik i en helicase-nukleasen DNA reparation proteinkompleks. Den resulterende tilgang giver en ramme for detaljerede undersøgelser af ligand binding til andre proteinkomplekser involveret i vigtige biologiske processer.
Native massespektrometrisk analyse af intakt proteiner og deres komplekser er udført ved hjælp af electrospray og nano-electrospray Ionisation (Petras), som bevarer proteinfoldning og non-kovalente interaktioner under ionisering proces1, 2. I native MS bevares strukturen af proteiner og deres komplekser i en nær-naturlig tilstand i gas-fase3,4. Native MS registrerer flere opladet protein ioner, som er adskilt efter deres masse til at oplade ratio (m/z) giver mulighed for masse af protein eller protein-ligand komplekse skal beregnes. Disse oplysninger gør det muligt for bestemmelse af en intakt proteiner støkiometrisk, subunit sammensætning, ligand bindende og interaktion netværk3,4,5,6. Native MS har flere fordele sammenlignet med andre teknikker disse røntgenkrystallografi og Kernemagnetisk resonans-spektroskopi5. For det første er indfødte MS en hurtig og meget følsomme teknik, der kræver kun et par microliters (2-3 µL) prøve ved relativt lave endelige komplekse koncentrationer i de høje nM til lav µM range6. For det andet, native MS kan bruges til at afhøre heterogene protein prøver at gøre det muligt at analysere flere proteiner og oligomere stater samtidigt. For det tredje, native MS ikke kræver protein prøver skal ændres før analyse af kemiske crosslinking eller protein mærkning. Disse fordele har foretaget strukturelle MS et kraftfuldt værktøj til den strukturelle undersøgelse af proteinkomplekser.
Native MS kan kombineres med ion mobilitet (IM), en teknik, der måler den tid, en protein ion tager for at rejse gennem et elektrisk felt, så collisional tværsnit (CCS) bestemmes. CCS giver lav opløsning strukturelle oplysninger, som muliggør topologi og konformationelle heterogenitet oplysninger af proteiner der skal indhentes. Desuden, det giver mulighed for undersøgelse af protein strukturelle modeller genereret af beregningsmæssige metoder.
Protein gas-fase stabilitet kan undersøges ved hjælp af kollision induceret udfoldning (CIU) målt ved IM-MS. Undervejs CIU er protein ioner accelereres og aktiveret gennem øget accelererende kollisioner med en inert buffer gas inden for et massespektrometer7,8,9. Denne collisional aktiveringsprocessen forårsager protein til delvist udfolde, som udmønter sig i en stigning i CCS. Denne ændring i CCS og energi, der kræves til at udfolde proteinet kan være målt ved IM-MS. ved hjælp af denne fremgangsmåde, effekten af ligand bindende protein stabilitet kan være målt10. Subcomplexes kan genereres i løsning ved hjælp af i-løsning forstyrrelser metoder såsom tilsætning af organiske opløsningsmidler til at overvåge native-lignende topologier af proteinkomplekser. Afbrydelse af proteinkomplekser er hovedsagelig skyldes forstyrrelse af samhandelen ikke-kovalente interaktioner. Sub komplekser opretholde native-lignende topologier og på MS afsløring, afsløre oplysninger om Inter subunit connectivity.
Integrativ tilgange i strukturbiologi kombinere forskellige metoder til at studere strukturen og dynamikken i proteiner og deres komplekser3,4,5,6. Native MS og IM-MS har været brugt til at afdække de molekylære detaljer af udfordrende biologiske systemer. Der har været flere eksempler på anvendelser, herunder undersøgelse af protein forsamling veje11,12,13,14, studerer protein-protein interaktion netværk15 , 16 , 17, membran proteiner6,18,19,20,21, og protein-ligand interaktioner som nukleinsyrer22,23 ,24.
Native MS har imidlertid også sine begrænsninger. Native MS målingerne udføres ofte i flygtige buffere såsom vandig ammoniumacetat hvor nogle proteiner ikke bevarer deres foldede hjemstat3,25. Ikke desto mindre har de seneste arbejde vist, at denne begrænsning kan overvindes ved optimering af sprøjtning nål tip diameter (0.5 mm tips) sådan, at protein og protein kompleks ioner kan dannes direkte fra ikke-flygtig buffere med høj-Ioniske-styrke, der bedre efterligne den fysiologiske miljø26. Desuden bruger native MS electrospray at ionisere og overføre ikke-kovalente assemblies fra løsning til gasfasen; den relative forekomst af detekterede komplekser kan ikke fuldt ud repræsenterer derfor, i løsning5,27. Desuden, i sammenligning med i løsningen, gas fase hydrofobe interaktioner bliver svagere og elektrostatiske interaktioner blive stærkere og dermed begunstiget3,28.
I denne artikel leverer vi protokoller, dataanalyse og fortolkning til protein identifikation og ligand bindende ved hjælp af indfødte MS, IM-MS, CIU, i løsning forstyrrelser, og modellering. DNA reparation kompleks, HerA-NurA, bruges som et modelsystem. DNA dobbelt-strenget pauser (DSBs) er en af de mest cytotoksiske og skadelige former for DNA-skader, hvilket resulterer i genetiske ustabilitet og eventuel udvikling af kræft hos mennesker. Homologe rekombination er reparation mekanisme, som udrydder DSBs, en proces, der er dirigeret af ATP afhænger af helicase-nukleasen komplekse, HerA-NurA22.
Ved at kombinere indfødte MS og IM-MS med funktionelle analyser og modellering tilladt undersøgelse af: i) NurA rolle i forsamlingen, kropsbygning og stabilitet af komplekset, ii) samspillet mellem dsDNA og komplekset og dens indflydelse på samlet stabiliteten i komplekset, og iii) støkiometrisk og virkningen af ATP bindende forsamling22. Alt i alt dette arbejde førte til en bedre forståelse af det molekylære grundlag af HerA-NurA kompleks ved at sammenkæde protein kompleks konformationelle ændringer og stabilitet med nukleotid bindende. Denne protokol er generiske for alle protein complex(es), der interagerer med en eller flere ligand(s) typer.
MS spiller en stadig vigtigere rolle i kendetegner støkiometrisk, interaktioner og subunit arkitektur af proteinkomplekser. IM-MS data kan bruges til at definere topologiske arrangementer af underenheder i stand komplekser. Sammenlignet med andre eksisterende metoder, strukturel biologi, har MS flere fordele. Native MS er en hurtig og meget følsomme teknik og kan bruges til at probe heterogene protein prøver. Når kombineret med i-løsning forstyrrelser eksperimenter, kan dissociation veje af protein forsamlinger overvåges. Sammen med krystal strukturer eller homologi modeller, de oplysninger, der tilbydes af strukturelle MS tilbyder et redskab til at undersøge protein-ligand interaktioner og give nær indfødte modeller og forsamling veje11.
Her beskriver vi de nødvendige eksperimentelle procedurer til at analysere støkiometrisk og sammensætningen af protein-ligand interaktioner, med en eller flere ligander, ved hjælp af Integrativ MS. Dette omfatter MS prøveforberedelse, dataopsamling, analyse af data og integration af MS data ved hjælp af beregningsmæssige redskaber. For at gøre dette, brugte vi den DNA-resektion HerA-NurA hetero-oligomere protein kompleks, bundet til tre ligander (DNA, ATP og ADP), som vores modelsystem. Protokollen viser brugen af den aktuelt tilgængelige software til at støtte dataanalyse og præsentation.
Erhverve høj kvalitet spectra er vigtigt for ligand bindende analyse, derfor forsigtig prøve forberedelsestrin er kritisk, herunder protein oprensning, ligand titrering og buffer exchange. En indskrænkning af Pernilles indfødte MS når man studerer ligand bindende er ikke-specifik binding. Ikke-specifik binding opstår under dråbe desolvation hele electrospray proces. Dette øger ligand koncentrationen og derfor ændrer protein/Ligand forholdet29. Bindingen af nukleotider resulterer i en relativt lille masse forskel mellem apo og nukleotid-bundet protein, der ikke ændrer ionisering effektivitet50,51.
Vi brugte Synapt G2-Si MS system for vores arbejde, men protokollerne, der er gældende for forskellige undersøgelser af andre protein-ligand komplekser ved hjælp af andre kommercielt tilgængelige nano-electrospray massespektrometre. Integrativ strukturelle MS i stigende grad spiller en vigtig rolle i håndteringen af biologiske problemer af større kompleksitet. Arbejdsproces og teknikker beskrevet her er velegnet til at forstå de strukturelle konsekvenser og bygning mekanismer af protein kompleks og protein-ligand dannelse, som ellers er vanskeligt at studere ved hjælp af konventionelle strukturelle teknikker .
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Karl-Peter Hopfner og Robert Thomas Byrne venligst give HerA og HerA-NurA protein prøver og for deres hjælp med forsøgets udformning. Vi takker også Dr. Eamonn Reading for hans gennemgang af håndskriftet. Vi parlamentsarbejdet vores finansieringsorganer: Wellcome Trust [109854/Z/15/Z] og Royal Society [RG150216 til A.P.].
Adenosine 5′-(3-thiotriphosphate) tetralithium salt | Merck Millipore | 119120-25MG | |
Adenosine 5′-diphosphate | Sigma-Aldrich | 20398-34-9 | |
Ammonium acetate solution | Sigma-Aldrich | A2706 | |
Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 7326204 | |
Vivaspin concentrator | Sartorius | Z614041-25EA | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
Water TraceSelect | Sigma-Aldrich | 95305 | |
Borosilicate Capillaries | Harvard Apparatus | 300060 |