मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) संरचना और macromolecular विधानसभाओं की गतिशीलता की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में उभरा है । यहां, हम एकीकृत एमएस आधारित दृष्टिकोण प्रोटीन जटिल गठन और ligand बाध्यकारी पूछताछ करने के लिए ।
प्रोटीन जैविक अणुओं का एक महत्वपूर्ण वर्ग है कि जीन अभिव्यक्ति, catalyzing चयापचय प्रतिक्रियाओं, डीएनए की मरंमत और प्रतिकृति सहित सेलुलर कार्यों में कई महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहे हैं । इसलिए, इन प्रक्रियाओं की एक विस्तृत समझ कैसे कक्ष फ़ंक्शन पर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है । एकीकृत संरचनात्मक एमएस तरीकों प्रोटीन जटिल विधानसभा, जटिल संपर्क, उपइकाई stoichiometry, प्रोटीन oligomerization और ligand बाध्यकारी पर संरचनात्मक और गतिशील जानकारी प्रदान करते हैं । एकीकृत संरचनात्मक एमएस में हाल के अग्रिमों बड़े डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन और झिल्ली प्रोटीन सहित चुनौतीपूर्ण जैविक प्रणालियों के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति दी है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे इस तरह के देशी एमएस और आयन गतिशीलता के रूप में विविध एमएस डेटा को एकीकृत करने के लिए-जन स्पेक्ट्रोमेट्री आणविक गतिशीलता सिमुलेशन के साथ (IM-एमएस) एक helicase-nuclease डीएनए मरंमत प्रोटीन परिसर में अंतर्दृष्टि लाभ । परिणामी दृष्टिकोण अंय प्रोटीन महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं में शामिल परिसरों के लिए बाध्यकारी ligand के विस्तृत अध्ययन के लिए एक रूपरेखा प्रदान करता है ।
बरकरार प्रोटीन और उनके परिसरों का मूल जन spectrometric विश्लेषण electrospray और नैनो-electrospray ionization (nESI) है, जो आबंध प्रक्रिया1के दौरान प्रोटीन तह और गैर ionization बातचीत के संरक्षण का उपयोग कर बाहर किया जाता है, 2. देशी एमएस में, प्रोटीन और उनके परिसरों की संरचना गैस में एक निकट देशी राज्य में बनाए रखा जाता है-चरण3,4। देशी एमएस का पता लगाता है एकाधिक चार्ज प्रोटीन आयनों, जो अपने द्रव्यमान के अनुसार अनुपात चार्ज करने के लिए अलग कर रहे हैं (एम/जेड) प्रोटीन या प्रोटीन के द्रव्यमान की अनुमति ligand जटिल गणना की जा करने के लिए. यह जानकारी एक बरकरार है प्रोटीन stoichiometry, उपइकाई संरचना, ligand बंधन, और संपर्क नेटवर्क3,4,5,6के निर्धारण में सक्षम बनाता है । देशी एमएस अंय तकनीकों की तुलना में कई लाभ है ऐसे एक्स-रे क्रि और परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी5। सबसे पहले, देशी एमएस एक तेजी से और अति संवेदनशील तकनीक है, कम µ एम रेंज6के लिए उच्च एनएम में अपेक्षाकृत कम अंतिम जटिल सांद्रता में नमूना के केवल कुछ microliters (2-3 µ एल) की आवश्यकता होती है । दूसरे, देशी एमएस यह एक साथ कई प्रोटीन और oligomeric राज्यों का विश्लेषण करने के लिए संभव बनाने विषम प्रोटीन नमूनों से पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । तीसरे, देशी एमएस रासायनिक crosslinking या प्रोटीन लेबलिंग द्वारा विश्लेषण से पहले संशोधित किया जा करने के लिए प्रोटीन के नमूनों की आवश्यकता नहीं है । इन फायदों ने स्ट्रक्चरल MS को प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की संरचनात्मक जांच के लिए एक शक्तिशाली टूल बना दिया है ।
देशी एमएस आयन गतिशीलता (आईएम), एक तकनीक है कि समय एक प्रोटीन आयन एक बिजली के क्षेत्र के माध्यम से यात्रा करने के लिए लेता है उपायों के साथ जोड़ा जा सकता है, टकराव पार अनुभाग (सीसीएस) को सक्षम करने के लिए निर्धारित किया जाएगा । सीसीएस कम संकल्प संरचनात्मक जानकारी प्रदान करता है, जो सक्षम बनाता है टोपोलॉजी और संरचना के विविधता जानकारी के लिए प्रोटीन प्राप्त किया जाना है । इसके अलावा, यह प्रोटीन स्ट्रक्चरल गणना दृष्टिकोण द्वारा उत्पंन मॉडलों की परीक्षा की अनुमति देता है ।
प्रोटीन गैस चरण स्थिरता टक्कर प्रेरित खुलासा (CIU) IM द्वारा मापा-MS का उपयोग कर जांच की जा सकती है । CIU प्रक्रिया के दौरान, प्रोटीन आयनों में तेजी लाने और एक जन स्पेक्ट्रोमीटर7,8,9के भीतर एक निष्क्रिय बफर गैस के साथ तेजी से टकराव में वृद्धि के माध्यम से सक्रिय कर रहे हैं । इस टकराव सक्रियकरण प्रक्रिया प्रोटीन आंशिक रूप से प्रकट करना है, जो सीसीएस में वृद्धि में तब्दील हो जाता है । सीसीएस में यह परिवर्तन और प्रोटीन प्रकट करने के लिए आवश्यक ऊर्जा IM द्वारा मापा जा सकता है-MS. इस दृष्टिकोण का उपयोग, प्रोटीन स्थिरता पर बाध्यकारी ligand के प्रभाव10मापा जा सकता है । उपपरिसरों में समाधान व्यवधान विधियों का उपयोग करने के लिए कार्बनिक सॉल्वैंट्स के अलावा जैसे प्रोटीन परिसरों की topologies देशी की तरह की निगरानी के समाधान में उत्पंन किया जा सकता है । प्रोटीन परिसरों में व्यवधान मुख्य रूप से इंट्रा नॉन आबंध इंटरैक्शन के व्यवधान के कारण होता है । उप परिसरों topologies की तरह देशी बनाए रखने और एमएस का पता लगाने पर, अंतर-उप इकाई कनेक्टिविटी के बारे में जानकारी प्रकट करते हैं ।
संरचनात्मक जीवविज्ञान में एकीकृत दृष्टिकोण संरचना और प्रोटीन की गतिशीलता और उनके परिसरों3,4,5,6का अध्ययन करने के लिए विविध तरीकों गठबंधन । देशी एमएस और IM-एमएस के लिए चुनौतीपूर्ण जैविक प्रणालियों के आणविक विवरण उजागर किया गया है । वहां प्रोटीन विधानसभा मार्ग के अध्ययन सहित अनुप्रयोगों के कई उदाहरण दिया गया है11,12,13,14, अध्ययन प्रोटीन-प्रोटीन संपर्क नेटवर्क15 , 16 , 17, झिल्ली प्रोटीन6,18,19,20,21, और न्यूक्लिक एसिड के रूप में प्रोटीन-ligand बातचीत22,23 ,24.
हालांकि, देशी एमएस की भी अपनी सीमाएं हैं । देशी एमएस माप अक्सर ऐसे जलीय अमोनियम एसीटेट जिसमें कुछ प्रोटीन उनके जोड़ देशी राज्य3,25बनाए रखने नहीं होगा के रूप में अस्थिर बफ़र्स में प्रदर्शन कर रहे हैं । फिर भी, हाल के काम से पता चला है कि इस सीमा स्प्रे सुई टिप व्यास (०.५ mm युक्तियां) के अनुकूलन से दूर किया जा सकता है कि इस तरह के प्रोटीन और प्रोटीन जटिल आयनों के साथ गैर वाष्पशील बफ़र्स से सीधे गठन किया जा सकता है उच्च ईओण की शक्ति है कि बेहतर शारीरिक पर्यावरण26की नकल । साथ ही, मूल MS electrospray का उपयोग करता है और गैर-आबंध असेंबली समाधान से गैस चरण में स्थानांतरित करने के लिए; इसलिए, पता लगाया परिसरों के सापेक्ष बहुतायत समाधान5,27में पूर्ण रूप से प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता है । इसके अलावा, समाधान में की तुलना में, गैस चरण hydrophobic बातचीत कमजोर हो और इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत मजबूत हो और इसलिए3,28इष्ट ।
इस अनुच्छेद में, हम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, डेटा विश्लेषण, और प्रोटीन की पहचान के लिए व्याख्या और ligand बंधन देशी एमएस, IM-ms, CIU, में समाधान व्यवधान का उपयोग कर, और मॉडलिंग । डीएनए मरंमत परिसर, HerA-नुरा, एक मॉडल प्रणाली के रूप में प्रयोग किया जाता है । डीएनए डबल फंसे टूटता (DSBs) डीएनए क्षति के सबसे साइटोटोक्सिक और बचके रूपों में से एक हैं, आनुवंशिक अस्थिरता और मनुष्यों में कैंसर के अंतिम विकास में जिसके परिणामस्वरूप । मुताबिक़ पुनर्संयोजन मरंमत तंत्र जो DSBs उंमूलन, एक प्रक्रिया है जो एटीपी आश्रित helicase-nuclease परिसर, HerA-नुरा22द्वारा किया जाता है ।
कार्यात्मक परख और मॉडलिंग के साथ देशी एमएस और IM-एमएस के संयोजन की जांच की अनुमति दी: मैं) विधानसभा में नुरा की भूमिका, अनुरूपता, और परिसर, द्वितीय की स्थिरता) dsDNA और परिसर और समग्र पर अपने प्रभाव के बीच बातचीत परिसर की स्थिरता, और iii) stoichiometry और विधानसभा22पर एटीपी बाइंडिंग का प्रभाव । कुल मिलाकर, यह काम HerA-नुरा परिसर के आणविक आधार के एक बेहतर समझ के नेतृत्व में प्रोटीन जटिल संरचना परिवर्तन और न्यूक्लियोटाइड बंधन के साथ स्थिरता को जोड़ने के द्वारा । इस प्रोटोकॉल किसी भी प्रोटीन जटिल (es) जो एक या कई ligand (ओं) के प्रकार के साथ बातचीत के लिए सामांय है ।
एमएस प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के stoichiometry, इंटरैक्शन और उपइकाई आर्किटेक्चर को निस्र्पक में तेजी से महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है । आईएम-एमएस डेटा multicomponent परिसरों के भीतर उपइकाईयों के टोपोलॉजिकल व्यवस्था को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अंय मौजूदा संरचनात्मक जीवविज्ञान तरीकों की तुलना में, एमएस कई फायदे हैं । देशी एमएस एक तेजी से और अत्यधिक संवेदनशील तकनीक है और विषम प्रोटीन नमूनों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जब में समाधान व्यवधान प्रयोगों के साथ युग्मित, प्रोटीन सभाओं के पृथक्करण रास्ते पर नजर रखी जा सकती है । क्रिस्टल संरचनाओं या समरूपता मॉडल के साथ साथ, संरचनात्मक एमएस द्वारा की पेशकश की जानकारी प्रोटीन ligand बातचीत की जांच के लिए एक उपकरण प्रदान करता है और निकट देशी मॉडल और विधानसभा रास्ते11प्रदान करते हैं ।
यहां, हम stoichiometry और प्रोटीन की संरचना-ligand बातचीत का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का वर्णन, एक या एक से अधिक लाइगैंडों के साथ, एकीकृत एमएस का उपयोग यह एमएस नमूना तैयारी, डेटा अधिग्रहण, डेटा विश्लेषण, और गणना उपकरण का उपयोग कर एमएस डेटा के एकीकरण भी शामिल है । ऐसा करने के लिए, हम डीएनए-लकीर HerA-नुरा hetero-oligomeric प्रोटीन जटिल, तीन लाइगैंडों (डीएनए, एटीपी, और ADP) के लिए बाध्य, हमारे मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया । प्रोटोकॉल डेटा विश्लेषण और प्रस्तुति सहायता के लिए वर्तमान में उपलब्ध सॉफ्टवेयर के उपयोग से पता चलता है ।
उच्च गुणवत्ता स्पेक्ट्रा प्राप्त करने ligand बाध्यकारी विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है, इसलिए, प्रोटीन शुद्धि, ligand अनुमापन, और बफर एक्सचेंज सहित सावधान नमूना तैयारी कदम महत्वपूर्ण हैं । ligand बाइंडिंग का अध्ययन करते समय nESI मूल MS की एक सीमा गैर-विशिष्ट बाइंडिंग है । गैर-विशिष्ट बाइंडिंग electrospray प्रक्रिया भर desolvation छोटी बूंद के दौरान होती है । इस ligand सांद्रता बढ़ जाती है और इसलिए प्रोटीन/ligand अनुपात29बदल । एपीओ और न्यूक्लियोटाइड-बाउंड प्रोटीन जो ionization दक्षता५०,५१में परिवर्तन नहीं करता है के बीच एक अपेक्षाकृत छोटे बड़े अंतर में न्यूक्लियोटाइड परिणाम के बंधन ।
हम अपने काम के लिए Synapt G2-Si एमएस सिस्टम का इस्तेमाल किया, लेकिन प्रोटोकॉल अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नैनो-electrospray मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर अन्य प्रोटीन-ligand परिसरों की विभिन्न जांच के लिए लागू कर रहे हैं. एकीकृत संरचनात्मक एमएस अधिक जटिलता की जैविक समस्याओं को संबोधित करने में तेजी से एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है । कार्यप्रवाह और तकनीक यहां वर्णित संरचनात्मक परिणाम और प्रोटीन जटिल और प्रोटीन के निर्माण तंत्र-ligand गठन जो अंयथा मुश्किल पारंपरिक संरचनात्मक तकनीक का उपयोग कर रहे है समझने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है .
The authors have nothing to disclose.
हम कार्ल-पीटर Hopfner और रॉबर्ट थॉमस Byrne शुक्रिया अदा करना चाहूंगा के लिए कृपया HerA और HerA-नुरा प्रोटीन नमूनों और प्रयोगात्मक डिजाइन के साथ उनकी मदद के लिए प्रदान करते हैं । हम भी पांडुलिपि के अपने समीक्षा के लिए ट्विटर पढ़ने के लिए धंयवाद । हम कृतज्ञता हमारे धन निकायों स्वीकार करते हैं: वेलकम ट्रस्ट [109854/z/15/z] और रॉयल सोसाइटी [RG150216 to एपी] ।
Adenosine 5′-(3-thiotriphosphate) tetralithium salt | Merck Millipore | 119120-25MG | |
Adenosine 5′-diphosphate | Sigma-Aldrich | 20398-34-9 | |
Ammonium acetate solution | Sigma-Aldrich | A2706 | |
Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 7326204 | |
Vivaspin concentrator | Sartorius | Z614041-25EA | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
Water TraceSelect | Sigma-Aldrich | 95305 | |
Borosilicate Capillaries | Harvard Apparatus | 300060 |