질량 분석 (MS)는 구조 조사와 고분자 어셈블리의 역학에 대 한 중요 한 도구로 떠오르고 있다. 여기, 우리는 단백질 복잡 한 형성과 ligand 바인딩이 MS 기반 접근을 통합 합니다.
단백질은 유전자 발현, catalyzing 신진 대사 반응, DNA 복구 및 복제를 포함 하 여 세포질 기능에 많은 주요 역할을 재생 하는 생물학 고분자의 중요 한 클래스. 이러한 프로세스에 대 한 자세한 이해 방법에 대 한 중요 한 정보를 제공 하는 따라서, 세포 기능. 통합 구조 MS 메서드 구조와 역 동에 단백질 복잡 한 어셈블리, 복잡 한 연결, 소 단위 산출할, 단백질 oligomerization ligand 바인딩 정보를 제공합니다. 통합 구조 MS의 최근 발전은 큰 DNA 묶는 단백질 및 막 단백질을 포함 하 여 어려운 생물 학적 시스템의 특성에 대 한 수 있다. 이 프로토콜에서는 네이티브 MS 및 이온 이동성-질량 분석 (MS 메신저) 분자 동역학 시뮬레이션으로 helicase nuclease DNA에 대 한 통찰력을 얻기 위해 단백질 복잡 한 수리 같은 다양 한 MS 데이터를 통합 하는 방법을 설명 합니다. 결과 접근 중요 한 생물 학적 과정에 관련 된 다른 단백질 복합물에 ligand 바인딩의 상세한 연구에 대 한 프레임 워크를 제공합니다.
그대로 단백질 그리고 그들의 복합물의 네이티브 대량 spectrometric 분석 실시 하는 이온화 과정1, 동안 분무 및 나노 분무 이온화 (nESI), 단백질 폴딩 유지 및 비-공유 상호 작용을 사용 하 여 2. 네이티브 MS, 단백질 그리고 그들의 복합물의 구조3,4가스 단계에서에서 네이티브에 가까운 상태에 유지 됩니다. 네이티브 MS 검색 여러 청구 단백질 이온 충전 비 (m/z) 단백질 또는 단백질-리간드의 질량을 수 있도록 그들의 질량에 따라 구분 되는 복잡 한 계산. 이 정보는 그대로 단백질의 산출할, 소 단위 구성, ligand 바인딩 및 상호 작용 네트워크3,4,,56의 결정을 수 있습니다. 네이티브 MS는 다른 기술에 비해 몇 가지 장점이 같은 엑스레이 결정학 및 핵 자기 공명 분광학5. 첫째, 네이티브 MS는 신속 하 고 매우 중요 한 기술입니다, 요구 하는 단지 약간 microliters (µ L 2-3) 낮은 µ M 범위6높은 nM에서 상대적으로 낮은 최종 복잡 한 농도에서 샘플의. 둘째, 네이티브 MS 이종 단백질 샘플 여러 단백질과 oligomeric 상태를 동시에 분석 하는 게 가능 하가 사용할 수 있습니다. 셋째, 네이티브 MS는 화학 가교 또는 단백질 라벨 분석 전에 수정할 단백질 견본을 필요 하지 않습니다. 이러한 장점을 구조 MS 단백질 복합물의 구조상 조사 위한 강력한 도구를 만들었습니다.
네이티브 MS 이온 이동성 (IM), 단백질 이온 전기 분야를 통해 여행 하는 데 걸리는 시간을 측정 하는 기술 collisional 횡단면 (CCS) 결정 될 수 있도록 결합할 수 있습니다. CCS는 저해상도 구조 정보를, 토폴로지 및 얻을 수 단백질의 구조적이 정보를 제공 합니다. 또한, 그것은 계산 방법에 의해 생성 된 단백질 구조 모델의 시험이 있습니다.
단백질-기체 안정성 수 조사 충돌 유도 전개 (CIU) 측정을 사용 하 여 IM MS에 의해. CIU 과정 단백질 이온 가속 하 고 질량 분 서 계7,,89내에서 불활성 버퍼 가스로 증가 가속 충돌을 통해 활성화. 이 collisional 활성화 과정 하면 CCS 증가 변환 부분적으로 펼쳐, 단백질. CCS와 단백질을 전개 하는 데 필요한 에너지에이 변경 될 수 있습니다이 이렇게 임 씨를 사용 하 여 측정, ligand 바인딩 단백질 안정성에의 효과 측정된10일 수 있다. Subcomplexes는 단백질 복합물의 기본-같은 토폴로지를 모니터링 하는 유기 용 제의 추가 같은 솔루션에 중단 방법을 사용 하 여 솔루션에서 생성할 수 있습니다. 단백질 복합물의 주로 내부 공유 비 상호 작용의 인 이다. 하위 단지 네이티브 같은 토폴로지를 유지 하 고, MS 검출 시 간 소 단위 연결에 대 한 정보를 공개.
구조 생물학에 통합 접근 결합 구조 단백질과 그들의 단지3,4,,56의 역학을 공부 하 고 다양 한 방법. 네이티브 MS 및 MS 메신저 도전 생물 학적 시스템의 분자 정보를 밝히기 위해 사용 되었습니다. 단백질 어셈블리 경로11,12,13,14, 단백질 단백질 상호 작용 네트워크15 를 공부 하 고 연구를 포함 하 여 응용 프로그램의 몇 가지 예제 되었습니다. , 16 , 17, 막 단백질6,,1819,20,21및 핵 산22,23 같은 단백질-리간드 상호작용 ,24.
그러나, 네이티브 MS는 또한 한계가 있다. 네이티브 MS 측정 종종 일부 단백질의 접힌된 네이티브 상태3,25를 유지 하지 것입니다 수성 염화 아세테이트 등 휘발성 버퍼에서 수행 됩니다. 그럼에도 불구 하 고, 최근 일이이 제한 단백질과 단백질 복잡 한 이온 더 높은 이온 강도 비 휘발성 버퍼에서 직접 형성 될 수 있다 그런 바늘 팁 직경 (0.5 m m 팁) 분사의 최적화에 의해 극복 될 수 있다 보이고 있다 생리 적인 환경을26모방. 또한, 네이티브 MS를 사용 하 여 분무 이온화 솔루션에서 가스 단계; 비 공유 어셈블리를 전송 따라서, 검색 된 단지의 관계 되는 풍부 수 있습니다 전적으로 대표 하지는 솔루션5,27에서. 또한, 솔루션에서에 비해, 가스 단계 소수 성 상호 작용 약한 되 고 정전기 상호 작용 해지고 따라서 선호 하는3,28.
이 문서에서는, 우리 제공 프로토콜, 데이터 분석 및 해석 단백질 식별 및 ligand 바인딩을 사용 하 여 네이티브 MS, 메신저-MS, CIU, 솔루션에서 중단, 그리고 모델링 합니다. 헤 라-NurA, DNA 복구 복잡 한 모델 시스템으로 사용 됩니다. DNA 이중 가닥 틈 (DSBs) 유전 불안정성 및 인 간에 있는 암의 최종 개발 결과로, DNA 손상의 가장 세포 독성과 해로운 형태 중 하나입니다. 동종 재결합 DSBs, ATP 의존 helicase nuclease 복잡 한, 헤 라 NurA22에 의해 조정 하는 과정을 eradicates는 복구 메커니즘입니다.
네이티브 MS와 MS 메신저 기능 분석 실험 결합 및 모델링 허용의 조사: i) 어셈블리, 나 란, 그리고 복잡 한, ii) dsDNA 사이의 복잡 한 상호 작용 및 전체에 미치는 영향의 안정성에서 NurA의 역할 단지, 안정성 및 iii) 산출할와 ATP 바인딩 어셈블리22에 영향. 전반적으로,이 작품은 뉴클레오티드 바인딩과 함께 단백질 복잡 한 구조적 변화와 안정성을 연결 하 여 헤 라 NurA 복합물의 분자 기준의 향상 된 이해를 지도 했다. 이 프로토콜은 하나 또는 여러 개의 ligand(s) 종류와 상호 작용 하는 어떤 단백질 complex(es)에 대 한 일반.
MS는 산출할, 상호 작용 및 소 단위 단백질 복합물의 건축을 특성화에 점점 중요 한 역할을 재생 됩니다. 메신저-MS 데이터 하위 단위 multicomponent 단지 내에서 위상 배열 정의를 사용할 수 있습니다. 다른 기존의 구조 생물학 방법에 비해, MS는 몇 가지 장점이 있습니다. 네이티브 MS는 신속 하 고 매우 중요 한 기술 이며 이종 단백질 견본을 사용할 수 있습니다. 솔루션 장애 실험 결합, 분리 단백질 어셈블리의 경로 모니터링할 수 있습니다. 크리스탈 구조 또는 상 동 모델, 구조 MS에서 제공 하는 정보는 단백질-리간드 상호작용을 조사 하기 위한 도구를 제공 하 고 근처 기본 모델 및 어셈블리 경로11제공 합니다.
여기, 우리는 통합 MS를 사용 하 여 산출할 및 단백질-리간드 상호작용 하나 이상의 ligands의 구성 분석에 필요한 실험 절차 설명. 이 MS 샘플 준비, 데이터 수집, 데이터 분석 및 계산 도구를 사용 하 여 MS 데이터의 통합이 포함 됩니다. 이렇게 하려면, 우리는 우리의 모델 시스템으로 (DNA, ATP, 그리고 ADP), 3 개의 ligands에 바인딩된 DNA 절제 헤 라-NurA hetero oligomeric 단백질 복잡 한를 사용 합니다. 프로토콜은 데이터 분석 및 프레 젠 테이 션을 돕기 위해 현재 사용할 수 있는 소프트웨어의 사용을 보여준다.
Ligand 바인딩 분석을 위해 중요 하다 고품질 스펙트럼을 취득, 따라서 주의 샘플 준비 단계는 중요 한 단백질 정화, 버퍼 교환, ligand 적정, 등. 한 제한 nESI 네이티브 MS ligand 바인딩 공부를 할 때 비 특정 바인딩입니다. 비 특정 바인딩 물방울 desolvation 분무 과정 전반에 걸쳐 발생합니다. 이 ligand 농도 증가 하 고 따라서 단백질/Ligand 비율29변경. 뉴클레오티드 바인딩 apo와 이온화 효율50,51를 변경 하지 않는 뉴클레오티드 바인딩 단백질 사이의 비교적 작은 질량 차이에 발생 합니다.
우리는 우리의 작업에 대 한 Synapt g 2 시 MS 시스템을 사용 하지만 프로토콜은 다른 상업적으로 사용 가능한 나노-분무 질량 분석기를 사용 하 여 다른 단백질-ligand 복합물의 다른 조사에 대 한 적용. 통합 구조 MS 점점 더 큰 복잡성의 생물학 문제 해결에 중요 한 역할을 재생입니다. 여기서 설명 하 고 워크플로 구조적 결과 이해 하 고 기존의 구조 기법을 사용 하 여 공부 하는 수 없는 복잡 한 단백질 및 단백질-리간드 형성의 메커니즘을 구축에 적합 .
The authors have nothing to disclose.
우리는 친절 하 게 제공 헤 라 헤 라 NurA 단백질 샘플에 대 한 그리고 그들의 실험 설계에 대 한 칼 피터 Hopfner와 로버트 토마스 번 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 원고의 그의 검토에 대 한 박사 Eamonn 읽기를 감사합니다. 우리는 기꺼이 우리의 자금 시체 인정: Wellcome 신뢰 [109854/Z/15/Z]와 왕 사회 [되 게 RG150216].
Adenosine 5′-(3-thiotriphosphate) tetralithium salt | Merck Millipore | 119120-25MG | |
Adenosine 5′-diphosphate | Sigma-Aldrich | 20398-34-9 | |
Ammonium acetate solution | Sigma-Aldrich | A2706 | |
Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 7326204 | |
Vivaspin concentrator | Sartorius | Z614041-25EA | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
Water TraceSelect | Sigma-Aldrich | 95305 | |
Borosilicate Capillaries | Harvard Apparatus | 300060 |