Masspektrometri (MS) har vuxit fram som ett viktigt verktyg för utredningen av struktur och dynamik av makromolekylära församlingar. Här, integrera vi MS-baserade metoder för att förhöra protein komplex bildandet och ligand bindande.
Proteiner är en viktig klass av biologiska makromolekyler som spelar många viktiga roller i cellulära funktioner inklusive genuttryck, katalysera metaboliska reaktioner, DNA-reparation och replikering. Därför en detaljerad förståelse av dessa processer ger viktig information om hur celler fungerar. Integrativ strukturella MS metoder ge strukturella och dynamiska information om protein komplex sammansättning, komplexa connectivity, subenhet stökiometri, protein oligomerisering och ligand bindande. Senaste framstegen inom integrativ strukturella MS har tillåtit för karakterisering av utmanande biologiska system inklusive stora DNA-bindande proteiner och membranproteiner. Det här protokollet beskriver hur du integrerar olika MS data såsom infödda MS och ion rörlighet-masspektrometri (IM-MS) med molekylär dynamik simuleringar för att få insikter i en helicase-nuclease DNA reparation proteinkomplex. Den resulterande strategin ger en ram för detaljerade studier av liganden bindning till andra proteinkomplex som är inblandade i viktiga biologiska processer.
Infödda massa spektrometriska analys av intakta proteiner och deras komplex utförs med elektrospray och nano-elektrospray jonisering (nESI), som bevarar proteinveckning och icke-kovalenta interaktioner under jonisering process1, 2. I native MS, proteiner och deras komplex struktur behålls i en nära-native stat i gas-fas3,4. Infödda MS upptäcker flera laddade protein joner, som är separerade enligt deras massa att debitera baserat (m/z) så att massan av protein eller protein-ligand komplexa ska beräknas. Denna information gör det möjligt för bestämning av en intakt protein stökiometri, subenhet sammansättning, ligand bindande och interaktion nätverk3,4,5,6. Infödda MS har flera fördelar jämfört med andra tekniker sådan röntgenkristallografi och kärnmagnetisk resonans spektroskopi5. För det första är infödda MS en snabb och mycket känslig teknik, kräver endast några mikroliter (2-3 µL) av provet vid relativt låga slutliga komplexa koncentrationer i hög nM till låga µM sortiment6. För det andra kan infödda MS användas att förhöra heterogena protein prov gör det möjligt att analysera flera proteiner och Oligomera stater samtidigt. För det tredje kräver inte infödda MS protein prover att ändras före analys av kemiska crosslinking eller protein märkning. Dessa fördelar har gjort strukturella MS ett kraftfullt verktyg för strukturella utredning av proteinkomplex.
Infödda MS kan kombineras med ion rörlighet (IM), en teknik som mäter tiden en protein Jon tar för att resa genom ett elektriskt fält, aktivera lett tvärsnittet (CCS) skall fastställas. CCS ger lågupplösta strukturell information, som möjliggör topologi och konfirmerande heterogenitet information av proteiner ska erhållas. Dessutom tillåter den undersökning av protein strukturella modeller genereras av beräkningsvetenskapliga metoder.
Protein gas-fas stabilitet kan undersökas med hjälp av kollision inducerad utspelas (CIU) mätt av IM-MS. Under processen Fondföretaget protein joner påskyndas och aktiveras genom ökad accelererande kollisioner med en inert buffert gas inom en masspektrometer7,8,9. Detta lett aktiveringen gör proteinet till delvis utvecklas, som översätter till en ökning av CCS. Denna förändring i CCS och den energi som krävs för att veckla upp proteinet kan vara mätt med hjälp av IM-MS. Detta tillvägagångssätt, effekten av liganden bindande protein stabilitet kan vara uppmätta10. Subcomplexes kan genereras i lösning med i-lösning störningar metoder såsom tillsats av organiska lösningsmedel för att följa native-liknande topologier av proteinkomplex. Störningar av proteinkomplex är främst störningar av handeln icke-kovalenta interaktioner. Sub komplexen underhålla native-liknande topologier och vid MS upptäckt, avslöja information om Inter subenhet anslutning.
Integrativ strategier inom strukturbiologi kombinera olika metoder för att studera strukturen och dynamiken i proteiner och deras komplex3,4,5,6. Infödda MS och IM-MS har använts till att avslöja de molekylära detaljerna för utmanande biologiska system. Det har funnits flera exempel på tillämpningar inklusive studien av protein församlingen vägar11,12,13,14, studera protein-protein interaktioner nätverk15 , 16 , 17, membranet proteiner6,18,19,20,21och protein-ligand interaktioner såsom nukleinsyror22,23 ,24.
Infödda MS har dock sina begränsningar. Infödda MS mätningar utförs ofta i flyktiga buffertar som aqueous ammoniumacetat där vissa proteiner inte kommer behålla sin vikta infödda statligt3,25. Ändå har senaste arbete visat att denna begränsning kan övervinnas genom optimering av sprutning nål spets diameter (0,5 mm tips) så att protein och protein komplexa joner kan bildas direkt från icke-flyktiga buffertar med ionic-höghållfasta som bättre härma den fysiologiska miljö26. Dessutom använder infödda MS elektrospray att jonisera och överföra icke-kovalenta församlingar från lösning till gasfas; Det relativa överflödet av upptäckta komplex kan inte helt representerar därför som i lösning5,27. Dessutom i jämförelse med i lösningen, gas fas hydrofoba interaktioner blir svagare och elektrostatisk interaktioner bli starkare och därmed gynnas3,28.
I denna artikel ger vi protokoll, dataanalys och tolkning för protein identifiering och ligand bindande använder infödda MS, IM-MS, Fondföretaget, i-lösning störningar, och modellering. Komplexet DNA reparation, HerA-NurA, används som modellsystem. DNA dubbelsträngat pauser (DSBs) är en av de mest cytotoxiska och skadliga formerna av DNA-skador, vilket resulterar i genetisk instabilitet och eventuell utveckling av cancer hos människor. Homolog rekombination är mekanismen reparation som utrotar DSBs, en process som är iscensatt av ATP beroende helicase-nuclease komplexa, HerA-NurA22.
Att kombinera infödda MS och IM-MS med funktionella analyser och modellering tillåtna utredningen av: i) NurA roll i församlingen, konformation, och stabilitet komplexet, ii) samspelet mellan dsDNA och anläggningen och dess påverkan på totalt stabiliteten i anläggningen, och iii) den stökiometri och effekterna av ATP bindande församling22. Övergripande, detta arbete ledde till en förbättrad förståelse av den molekylära basen för HerA-NurA anläggningen genom att länka protein komplex konfirmerande förändringar och stabilitet med nukleotid bindande. Detta protokoll är generisk för någon protein complex(es) som interagerar med en eller flera ligand(s) typer.
MS spelar en allt viktigare roll i karaktärisera den stökiometri, interaktioner och subunit arkitektur av proteinkomplex. IM-MS data kan användas för att definiera topologiska arrangemang av subunits inom flerkomponents komplex. Jämfört med andra befintliga metoder för strukturbiologi, har MS flera fördelar. Infödda MS är en snabb och mycket känslig teknik och kan användas till probe heterogena protein prover. När tillsammans med i-lösning störningar experiment, kan dissociation vägar av protein aggregat övervakas. Tillsammans med kristallen strukturerar eller homologi modeller, den information som erbjuds av strukturella MS erbjuder ett verktyg för att undersöka protein-ligand interaktioner och ge nära-native modeller och församlingen vägar11.
Här beskriver vi experimentella förfarandena för att analysera stökiometri och sammansättning av protein-ligand interaktioner, med ett eller flera ligander, med integrativ MS. Detta inkluderar MS provberedning, datainsamling, dataanalys och integrationen av MS data med hjälp av datorverktyg. Detta gör använt vi DNA-resektion HerA-NurA hetero-Oligomera protein komplex, bunden till tre ligander (DNA, ATP och ADP), som vår modellsystem. Protokollet visar användningen av för närvarande tillgängliga programvaran till stöd dataanalys och presentation.
Förvärva hög kvalitet spectra är viktigt för ligand bindande analys, därför försiktig provberedningssteg är kritiska, inklusive protein rening, ligand titrering och buffert exchange. En begränsning av nESI infödda MS när man studerar ligand bindande är icke-specifik bindning. Icke-specifik bindning uppstår under droplet desolvering under hela elektrospray processen. Detta ökar koncentrationerna som ligand och därför förändrar protein/Ligand baserat på29. Bindningen av nukleotider resulterar i en relativt liten samlasskillnaden mellan apo och nukleotid-bundna protein som inte ändrar den jonisering effektivitet50,51.
Vi använde Synapt G2-Si MS systemet för vårt arbete, men protokoll som är tillämpliga för olika undersökningar av andra protein-ligand komplex med andra kommersiellt tillgängliga nano-elektrospray masspektrometrar. Integrativ strukturella MS spelar alltmer en viktig roll i att hantera biologiska problem av större komplexitet. Arbetsflöde och tekniker som beskrivs här lämpar sig väl för att förstå de strukturella konsekvenserna och bygga mekanismer av proteinkomplex och protein-ligand formation som annars är svåra att studera med hjälp av konventionella strukturella tekniker .
The authors have nothing to disclose.
Vi skulle vilja tacka Karl-Peter Hopfner och Robert Thomas Byrne för vänligt ge HerA och HerA-NurA protein prover och för deras hjälp med experimentell design. Vi tackar också Dr Eamonn Reading för hans granskning av manuskriptet. Vi tacksamt erkänna våra finansiärer: Wellcome Trust [109854/Z/15/Z] och Royal Society [RG150216 till A.P.].
Adenosine 5′-(3-thiotriphosphate) tetralithium salt | Merck Millipore | 119120-25MG | |
Adenosine 5′-diphosphate | Sigma-Aldrich | 20398-34-9 | |
Ammonium acetate solution | Sigma-Aldrich | A2706 | |
Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 7326204 | |
Vivaspin concentrator | Sartorius | Z614041-25EA | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
Water TraceSelect | Sigma-Aldrich | 95305 | |
Borosilicate Capillaries | Harvard Apparatus | 300060 |