Her presenterer vi en protokoll for Borstemmaskin immobilisert metall affinitet kromatografi rensing og påfølgende rekonstituering av en polyhistidine merket, ikke-heme jern bindende dioxygenase egnet for undervisning undervisning laboratoriet.
Borstemmaskin immobilisert metall affinitet kromatografi (IMAC), polyhistidine merket proteiner er lett mestrer av studenter og har blitt den mest brukte protein rensing metoden i moderne litteratur. Men anvendelsen av affinitet kromatografi metall binding proteiner, særlig de med redoks følsom metaller som jern, er ofte begrenset til laboratorier med tilgang til en hanskerommet – utstyr som ikke rutinemessig i lavere laboratoriet. I denne artikkelen viser vi vår Borstemmaskin metoder for isolasjon, IMAC rensing og metall-ion rekonstituering av en poly-histidin merket, redoks-aktive, ikke-heme jern bindende extradiol dioxygenase og analysen av dioxygenase med variert substrat konsentrasjoner og Mette oksygen. Disse metodene er utført av studenter og implementert i undervisning undervisning og forskning laboratorium med instrumentering som er tilgjengelig og rimelig på hovedsakelig lavere institusjoner.
De første rapportene om rensing av en polyhistidine merket protein fra ekstrakter av en vert organisme med chelation i histidin koden ved en immobilisert metall inn litteraturen i 19881,2. Siden den gangen, tillegg av polyhistidine tags rekombinante proteiner og rensing av immobilisert metall affinitet kromatografi (IMAC) har blitt nesten allestedsnærværende i biokjemiske litteratur3,4, 5. IMAC rensing metoder kan implementeres på Borstemmaskin, bruke automatiserte kromatografi og i spin-kolonne-format. Mens affinitet rensing metoder, spesielt IMAC, er mye brukt i forskningslaboratoriet, er de mindre vanlig i undervisning undervisning laboratoriet. Mest brukte laboratorium lærebøker for biokjemi laboratoriet lære ikke rutinemessig disse metodene, i stedet velger mer tradisjonelle ion-exchange eller fargestoff-bindende kromatografi6,7,8 , 9. For eksempel rensing av laktat dehydrogenase av Anderson10 bruker affinitet av fargestoff-bindende, og rensing av bovin melk α-lactalbumin7,11 av Boyer bruker et nikkel-nitriloacetic Acid matrix, men ingen rekombinant poly-histidin kode, stoler i stedet på iboende affinitet av protein for harpiks. Noen moderne undergraduate laboratoriet lærebøker og publikasjoner gjøre gjennomføre immobilisert metall affinitet Ture på poly-histidin merket protein mål som grønn eller rød-fluorescerende proteiner12,13, 14,15, antistoffer16og valgte enzymer17,18,19,20, selv noen ukjent funksjon21. Uten tvil, rensing av et enzym er å foretrekke i undervisning laboratoriet, fordi målet kan være assayed for aktivitet i etterfølgende økter, berikende opplevelsen av “ekte vitenskap” av studenten; faktisk slike laboratorium opplevelser har blitt publisert og resultater på elevenes læring rapporterte17,18,20,21. Og ennå, anvendelser av IMAC til enzym rensing i biokjemi laboratoriet være sparsom, og publiserte metoder kan selv antar tilgang til kromatografi instrumentering som er vanligvis ikke tilgjengelig for bruk i klasserommet laboratoriet 20. det er også begrensninger i bruk av IMAC til metalloproteins, spesielt de som binder redoks-sensitive divalent metaller som er viktige for aktivitet22. Ofte er metall ion mistet eller oksidert under renselsen gir en inaktiv enzym dårlig tilpasset undergraduate laboratoriet.
En full tredjedel av enzymer binde en metall ion23, og til tross for en nesten universell kravet for jern i alle former for liv23, jern er uten tvil blant de mest problematisk metall ionene i enzymology. Non-måltema Fe2 + bindende enzymer er spesielt utsatt for tap og/eller oksidasjon av metall i IMAC; antagelig skyldes mangel på en dedikert organisk ligand som måltema og enkel med hvilke Fe2 + kan dissociate fra aminosyre ligander24. Videre er oksygen avhengige oksidasjon av Fe2 + til Fe3 + spontan vandig løsning, negative fri energi endringen og relativ stabilitet Fe3 +. Ofte er disse utfordringene overvunnet ved hjelp av anaerob atmosfære og/eller ikke-IMAC brukt kromatografiske metoder22. I denne artikkelen vil vi vise bruk av Borstemmaskin IMAC å rense den Fe2 + avhengige metalloenzyme L-DOPA dioxygenase ved hjelp av enkle, rimelige kromatografi forsyninger, etterfulgt av rekonstituering av det aktive området Fe2 +, og enzymatisk analysen. Disse metodene er standard i vår egen undervisning biokjemi laboratorium for 6-12 studentgrupper og kan brukes til å utvide repertoaret enzym undersøkelser på lavere nivå.
Mens tillegg av polyhistidine tags rekombinante proteiner og rensing av IMAC har blitt nesten allestedsnærværende i biokjemiske litteratur3,4,5, anvendelser av IMAC til enzym rensing i biokjemi undervisning laboratoriet være sparsom og publiserte metoder ikke alltid vurdere ressurs begrensninger av undervisningen laboratorium20. Videre er bruk av IMAC i undervisning laboratoriet mest effektivt når koplet til eksperimenter som vurderer aktivitet og renhet, gjør IMAC rensing av et enzym en ideell instruksjonssøster aktivitet. For å utvide bruken av IMAC til rensing av enzymer, inkludert metalloenzymes, i undervisning laboratoriet, er pålitelig og rimelig metoder nødvendig. Denne protokollen, vi viser Borstemmaskin IMAC med lett tilgjengelig og rimelig laboratorium forsyninger, mens adressering også begrensningene i anvendelsen av IMAC til metalloproteins22, ved gjenoppbygge iron(II) avhengige metalloenzyme, L-DOPA dioxygenase, legge rensing. Ved hjelp av reagenser og materiale, anslå vi kostnaden for forbruksvarer for åtte studentgrupper er mellom $500-600 per semester kjøre denne protokollen, inkludert analyse fremgangsmåten i figur 1 og figur 2.
På grunn av brukervennlighet som Fe2 + kan dissociate fra aminosyre ligander24 og lettvinte oksidasjon av Fe2 + O2 til Fe3 +, rekonstituering av ikke-måltema, er aminosyre-chelated iron(II) i en rekombinant metalloenzyme en typisk komponent i enzym rensing. Når klassisk kromatografi brukes, er det mulig å unngå totalt tap av jern i noen tilfeller32, men oftere, jern (II) legges tilbake i nærvær av reduksjonsmidler33,34,35, 36 ofte under en anaerob atomosphere37,38,39, og i noen tilfeller overflødig jern ikke fjernet33,34,36, kompliserer alle påfølgende analysen. Påfølgende trinnene i klassisk kromatografi og en anaerob atmosfære er ikke realistisk for undergraduate laboratoriet, spørre utviklingen av denne protokollen.
Mens manuelle utarbeidelsen av kolonnen Ni-NTA og behandling av prøver hovedsakelig av tyngdekraften tar ekstra tid og innsats når sammenlignet med ferdigpakkede spalter og automatisert kromatografi instrumentering, tillater manuelle trinn for praktisk lære av studenten som resulterer i økt forståelse av vitenskapen bak prosessen. Tillegg av en jern (II) salt under forholdene som er beskrevet her er spesielt følsomme for overflødig dithiothreitol. Hvis en student ved en feiltakelse legger et overskudd av dithiothreitol, trolig en nedbør hendelse. Vi har funnet det nyttig å krever studentene til å utføre beregninger av reagens mengder før ankomst i laboratorium, slik laboratorium tid kan brukes mest effektivt på benken. Hele Borstemmaskin IMAC rensing – fra celle-lysis til protein elueringsrør – kan oppnås i en 4-timers laboratorium periode, etterfulgt av rekonstituering og analysen i en etterfølgende lab.
The authors have nothing to disclose.
Denne publikasjonen er basert på arbeid støttes av National Science Foundation under Grant nr. CHE 1708237.
consumables | |||
BeadBeater 0.1mm glass beads | BioSpec Products | 11079101 | 1 pound each |
50mL Conical Tubes with Screw Caps, sterile | VWR | 21008-178 | |
Sodium chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
Potassium phosphate, monobasic | Acros (Fisher) | AC42420-5000 | |
Sodium Ascorbate | Acros (Fisher) | AC35268-1000 | |
DTT (Dithiothreitol) | Lab Scientific | D-115 | |
Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigmaaldrich | 310077 | |
HisPur NiNTA Resin | Fisher (pierce) | PI88221 | |
Econo-Column Chromatography Columns – 1.5 x 20cm | Bio-Rad | 737-1522 | 1.5 x 20 cm, 35 ml, 2ea, |
Stopcock Valve, one way, female to male luer | Kimble | 420163-0000 | pack of 50 |
BD 10mL luer-loc syringe (non-sterile, without needle) | VWR | 301029 | |
Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Female Luer | Biorad | 7318222 | |
Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Male Luer | Biorad | 7318225 | |
Silicon Tubing (1.6 mm ID/0.8 mm wall, for 0.2-5 ml/min on Peristaltic Pump) | Bio-Rad | 7318211 | Pkg of 1, 1.6 mm ID/0.8 mm wall, 10 m, low-pressure tubing for liquid handling |
Glycerol | Fisher (Pierce) | 17904 | |
Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay | Thermo Scientitic | 23236 | |
Microcentrifuge Tubes, snap cap, 1.5mL | VWR | 89000-028 | |
Fisherbrand polystyrene disposable serological pipets | Fisher | 13-676-10F | |
Fiserbrand universal pipet pump | Fisher | 14-955-110 | |
Fisherbrand Transfer Pipets | Fisher | 13-711-9AM | |
Econo-Pac 10DG desalting columns | Bio-Rad | 732-2010 | box of 30 |
ExpressPlus PAGE 5x sample buffer | Genscript | MB01015 | 5mL (Dilute 1:5 with sample) |
ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 wells | Genscript | M42012 | 20 gels |
Fisherbrand Disposable Cuvettes, Methyacrylate | Fisher | 14-955-128 | case of 500 |
Cuvette Caps Square Disposable | Fisher | 14-385-999 | |
L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine) | Acros | D9628-5G | |
Permanent Equipment: | |||
BeadBeater 50mL chamber | BioSpec Products | 110803-50SS | 1 chamber |
BeadBeater | BioSpec Products | 1107900-101 | 350 ml polycarbonate chamber, rotor assembly, motor base, ice-water cooling jacket and one pound of glass beads. |
Centrifuge tubes, High-Speed PPCO, 50mL | Fisher | 3119-0050PK | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | Bio-Rad | 1658004 | 4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam |
PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | 100–120/220–240 V, power supply for high-current applications, includes power cord |
UV-1800 with UV-Probe Software | Shimadzu | UV-1800 | |
Kintek Global Kinetic Explorer | Kintek Corp | version 6 | https://www.kintekexplorer.com/downloads/ |