Vi har udviklet en strategi for at rense og billed et stort antal af centrioler i forskellige orienteringer modtagelig for Super-resolution mikroskopi og enkelt-partikel gennemsnit.
Centrioler er store makromolekylære forsamlinger vigtigt for korrekt udførelse af grundlæggende celle biologiske processer såsom celledeling, celle motilitet, eller celle signalering. Grønalger Chlamydomonas reinhardtii har vist sig for at være en indsigtsfuld model i studiet af centriole arkitektur, funktion og protein sammensætning. Trods store fremskridt mod forståelse centriolar arkitektur er en af de aktuelle udfordringer at bestemme den nøjagtige lokalisering af centriolar komponenter inden for strukturel regioner af centriole for bedre at forstå deres rolle i centriole Biogenese. En stor begrænsning ligger i løsningen af Fluorescens mikroskopi, hvilket komplicerer fortolkningen af protein lokalisering i denne organelle med dimensioner tæt på diffraktion grænse. For at tackle dette spørgsmål, leverer vi en metode til at rense og billed et stort antal C. reinhardtii centrioler med forskellige orienteringer bruger Super-resolution mikroskopi. Denne teknik giver mulighed for yderligere behandling af data gennem fluorescerende enkelt-partikel gennemsnit (Fluo-SPA) på grund af det store antal af centrioler erhvervet. Fluo-SPA genererer gennemsnit af farves C. reinhardtii centrioler i forskellige retninger, således at lette lokaliseringen af forskellige proteiner i centriolar subregioner. Vigtigst, kan denne metode anvendes på billedet centrioler fra andre arter eller andre store makromolekylære forsamlinger.
Centriole er en evolutionært bevarede organelle, der ligger kernen i centrosome i animalske celler og kan fungere som en basal krop (refereret til som centrioler herefter) til skabelon cilia eller flageller i mange eukaryoter1,2. Som sådan er centrioler afgørende for grundlæggende celle biologiske processer lige fra spindel forsamling til celle signalering. Derfor, defekter i centriole forsamling eller funktion er blevet forbundet med flere menneskelige sygdomme herunder ciliopathies og kræft3.
Centrioler er nine-fold, symmetrisk, mikrotubulus triplet-baserede cylindrisk strukturer der er, typisk ~ 450 nm lang og ~ 250 nm bred4,5,6,7. Konventionelle elektronmikroskopi og cryo-elektron tomografi af centrioler fra forskellige arter har afsløret, at centrioler er polariseret langs deres længdeakse med tre forskellige regioner: en proksimal region, en central kerne og en distal region5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. vigtigere, hver af disse regioner viser strukturelle særegenheder. Først, lumen af 100 nm-lange proksimale regionen indeholder vejrmølle struktur tilsluttet mikrotubulus triplet gennem knappenålshoved element12. Andet, 300-400 nm-lange centrale region indeholder fiber tætheder i funktionerne lumen og strukturelle langs indersiden af mikrotubuli: den Y-formede linker, C-tubulus hale og A-tubulus stub9. Endelig, 50 – 100 nm distale region udstiller sub distale og distale vedhæng, der omgiver den distale del af centriole5,13.
De sidste to årtier har været præget af opdagelsen af et stigende antal centriolar proteiner, fører til en aktuel vurdering af omkring 100 forskellige proteiner er en del af centriole14,15,16, 17. trods disse fremskridt, den præcise lokalisering af disse proteiner inden for centriole er stadig undvigende, især inden for strukturfondene subregioner. Vigtigere, er tildele en præcis lokalisering til strukturelle regioner af centriole afgørende for en bedre forståelse af deres funktion. I denne henseende, har C. reinhardtii centrioler været medvirkende til begge aspekter af første delimitating de forskellige strukturelle egenskaber langs den cylinder9,18,19, som derefter tilladt forskere til at korrelere lokalisering af en delmængde af proteiner ved hjælp af fluorescerende mikroskopi til en sub strukturelle region. Dette omfatter for eksempel, de proteiner, Bld12p og Bld10p, som Lokaliser i den proksimale region og i strukturen vejrmølle især20,21,22,23. Listen over underkonstruktionen lokaliseret proteiner indeholder også POB15 og POC16, to nye proteiner identificeret ved massespektrometri, dekorere regionen indre centrale kerne af C. reinhardtii centrioler17.
Dette papir giver en fuldstændig beskrivelse af den metode, der er udviklet til at isolere og image C. reinhardtii centrioler for efterfølgende super-resolution mikroskopi og enkelt-partikel gennemsnit. For at nå dette mål, er det vigtigt at afgrænse de tekniske begrænsninger, der skal overvindes. Første, centriole rensning kan påvirke den overordnede arkitektur, med vejrmølle strukturen ofte går tabt under de forskellige trin i isolation9. For det andet, dimensioner af centriole er meget tæt på diffraktion grænse i Optisk mikroskopi. Faktisk, den laterale opløsning, der kan opnås i Konfokal mikroskopi er omkring 200 nm24, svarende til diameteren af centriole, og opløsningen i z-akse er omkring 2-3 x lavere, fører til en anisotrope volumen. For det tredje kunne heterogenitet af antistof mærkning og centriole orientering begrænse tolkningen skulle lokalisere en protein i en bestemt centriolar subregion. Endelig findes centrioler i kun to eksemplarer pr. celle, hvilket gør det vanskeligt at erhverve et stort antal billeder og finde en entydig centriole orientering. For at omgå disse tekniske spørgsmål, udviklede vi en metode, der bygger på anvendelse super-resolution mikroskopi på stort antal isolerede centrioler, at vedtager forskellige retningslinjer. Først vil vi beskrive en protokol for at rense C. reinhardtii centrioler, der gør det muligt for rensning af strukturelt intakt centrioler og procentrioles indeholdende vejrmølle. Derefter vil vi beskrive en trinvis protokol for at koncentrere centrioler på coverslips til billeddannelse af konventionelle eller Super-resolution fluorescerende mikroskopi. Dette vigtige skridt giver mulighed for at øge antallet af centrioler afbildet i flere retninger. Endelig vil vi beskrive en procedure for at udføre enkelt-partikel gennemsnit på data erhvervet på fluorescerende mikroskoper, der letter påvisning af centrioler i forskellige retninger. Helt, denne metode kan anvendes på billedet centrioler fra forskellige arter eller andre store makromolekylære forsamlinger.
En af udfordringerne i biologi er at dechifrere det nøjagtige lokalisering af proteiner i en arkitektonisk kontekst. Centriole er en ideel struktur at anvende disse metoder, som dens arkitektur er blevet undersøgt ved hjælp af cryo-elektron tomografi, afslørende interessante ultrastrukturelle træk langs dens længde. På grund af sine dimensioner tæt på opløsning grænse i Optisk mikroskopi, er det imidlertid vanskeligt at lokalisere netop et protein ved immunfluorescens til en strukturel underregion af centriole ved hjælp af konventionelle mikroskoper30.
Opløsning i Optisk mikroskopi er begrænset af diffraktion af lys, der giver nogenlunde, lateral maksimal opløsning på 200 nm i Optisk mikroskopi24. Denne begrænsning har imidlertid været omgås ved en af de store gennembrud i de sidste 20 år i Optisk mikroskopi: opfindelsen af super-resolution metoder. Disse tilgange kan billedet over diffraktion grænser på forskellige beslutninger: 120 nm for SIM, omkring 50 nm for stimuleret emission udtynding (STED) og 20 – 40 nm for enkelt-molekyle lokalisering mikroskopi (SMLM)24. Med disse nye udviklinger super-resolution mikroskopi er de strukturelle subregioner af centriole opnåelige. I praksis er det imidlertid stadig vanskeligt at præcist bestemme lokalisering af et protein til et strukturelt element til hovedårsagen til, at de modne centrioler findes i kun 2 eksemplarer pr. celle og har tilfældige retningslinjer, hvilket gør fortolkningen af lokalisering vanskeligt. Derfor, blev en protokol, der oprettet som gør det muligt for forskere at billede af super-resolution et stort antal centrioler, øge chancen for at observere ikke-tvetydige retningslinjer. Vigtigere, da denne metode er baseret på brugen af isolerede centrioler, vi leverer en metode til at rense intakt C. reinhardtii centrioler, der indeholder modne centrioler og procentrioles.
Endelig, på grund af vifte af centriole retningslinjer, der kan være afbildet med denne protokol, enkelt-partikel analyse kan anvendes ved hjælp af elektronmikroskopi software. Dette resulterer i generation af gennemsnitlige klasser af centrioler i en bestemt retning. Vigtigere, kan disse fremkomne 2D-billeder derefter bruges til at vurdere lokalisering af et specifikt protein langs centriole. Denne metode kan anvendes på billeder med dual-farve Super-opløsning, og en farve kan bruges til at afsløre centriole skelettet (fx, tubulin), mens anden farven kan henføres til en specifik centriolar protein. Ved at fratrække de gennemsnit opnået med én farve eller to farver, bliver det lettere at registrere et protein langs centriole (proksimale, central eller distale). Bemærk at de to kanaler skal justeres nøjagtigt for at undgå eventuelle vildledende fortolkninger. Derudover vil gennemsnit af top synspunkter hjælpe dechifrere hvis et protein lokaliserer inde centriolar lumen, langs en mikrotubulus væg, eller uden for centriole.
Denne metode har fordelen at fastslå lokalisering af specifikke proteiner, der kunne være svært at lokalisere ellers på grund af heterogene mærkning. Bemærk, at andre metoder til at kortlægge proteiner inden for centrioler er beskrevet korrelationsmaalinger 3D-SIM/SMLM med, for eksempel vurdering af de specifikke retningslinjer for centrioler ved at bestemme de elliptiske profil af en markør, der danner en torus omkring den centriole af SIM-billeddannelse. Med denne parameter, er det muligt at lokalisere protein med en præcision på 4 – 5 nm30. Bemærk også, at den beskrevne metode her bruger isolerede centrioler med intakt procentrioles, et tegn på, at centriole arkitekturen er sandsynligvis i vid udstrækning bevaret. Men vi kan ikke udelukke der nogle arkitektoniske træk er forstyrret under rensningen, såsom centriole diameteren varierer med koncentrationen af divalent kationer, som forstærkes med isolering af den menneskelige centrosome5.
En af de kritiske trin i protokollen præsenteres her er at få tilstrækkelig koncentreret isolerede centrioler i forskellige orienteringer imødekommenhed over for Fluo-SPA. Det gør du ved først sikre renheden og effektiviteten af proceduren centriole isolation. En lav koncentration af isolerede centrioler vil forhindre korrekt imaging og yderligere billedbehandling. Til dette formål leverer vi en metode til at berige antallet af centrioler per synsfelt. Afhængigt af antallet af centrioler i den brøk, der anvendes, skal lydstyrken indlæst i koncentratoren, der justeres, med en maksimal volumen på 250 µL.
Vigtigst, er denne metode blevet udviklet til en cellevæg minus cw15-C. reinhardtii celler. I denne stamme, skrøbelighed af cellevæggen giver mulighed for en ordentlig lysering af celler og dermed, befrielsen af dens indhold. Denne protokol er ikke effektive for wild-type C. reinhardtii celler, som cellevæggen forhindrer en ordentlig lysering. Alternative strategier såsom sonikering eller en præ-inkubation af celler med autolysin, et enzym, der kan forringe cellevæg31, skulle sættes på plads til at ændre cellevæg før isolation protokollen præsenteres her.
Denne opsætning kan bruges med forskellige typer mikroskoper, lige fra konventionelle Konfokal mikroskoper til høj overførselshastighed dedikeret super-resolution mikroskoper. Bemærk, at når du laver SMLM, en speciel buffer er nødvendig for korrekt imaging og således et kammer, der er tilpasset til en 12 mm coverslip med buffer oven på coverslip skal bruges. Efterfølgende billedbehandling vil blive udført med inverterede mikroskoper. Hvis mikroskop set-up ikke tillader en 12 mm coverslip, kan protokollen præsenteres her anvendes på 18 mm coverslips ved hjælp af et 30 mL runde-nederste rør og en modificeret adapter og koncentrator. Det er også vigtigt at Bemærk at kvaliteten af den endelige genopbygning i SMLM vil afhænge af kvaliteten af farvning og af det primære antistof bruges som metode til fiksering.
I sammendrag leverer vi en metode, der kan anvendes til billede talrige centrioler efterfulgt af Fluo-SPA, vil generere gennemsnit af centrioler i forskellige retninger, hvilket bidrager til at lokalisere centriolar protein med præcision. Vigtigst, kan denne metode anvendes mere generelt isolerede centrioler fra andre arter, andre organeller eller store makromolekylære forsamlinger. Endelig stikprøve forberedelse tilgang præsenteres her, kombineret med nylige udvikling af algoritmer for enkelt-partikel analyse af fluorescerende SMLM data32, kunne åbne yderligere forbedring i den molekylære kartografi af store makromolekylære assemblies.
The authors have nothing to disclose.
Vi takke Pierre Gönczy og BioImaging & optik Platform (BIOP) på École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Lausanne, Schweiz, hvor SIM-billederne af centrioler blev erhvervet. Nikolai Klena og Davide Gambarotto er støttet af det Europæiske Forskningsråd (ERC) start Grant (StG) 715289 (ACCENT) og Maeva Le Guennec, Paul Guichard og Virginie Hamel af Swiss National Science Foundation (SNSF) PP00P3_157517. Susanne Borgers understøttes af Geneves Universitet.
Mouse monoclonal anti-apha tubulin (clone DM1A) | Abcam | ab7291 | dilution 1:300 |
DNaseI | Roche | 10104159001 | |
12 mm coverslips | Roth | YX03.1 | |
18 mm coverslips | Roth | LH23.1 | |
K2HPO4 | Fluka | 60355 | |
KH2PO4 | Fluka | 60230 | |
Tris base | Biosolve Chimie SARL | 0020092391BS | |
acetic acid | Carlo Erba Reagents | 524520 | |
NH4Cl | Sigma | A-4514 | |
CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
MgSO4 | Sigma | 63140-500G-F | |
steritop filter | Millipore | SCGPT05RE | |
sucrose | Sigma | S7903-1KG | |
HEPES | AppliChem PanReac | A3724,0250 | |
PIPES | Sigma | P6757-500G | |
MgCl2 | ACROS ORGANICS | 197530010 | |
NP-40 | AppliChem PanReac | A1694,0250 | |
Round-bottom (Kimble) tubes 15 mL | Fisherscientific | 09-500-34 | |
Round-bottom (Kimble) tubes 35 mL | Fisherscientific | 09-500-37 | |
cover glass staining rack | Thomas scientific | 8542E40 | |
crystal polystyrene transmission lab box | FISHERS | 11712944 | |
Methanol | VWR | 20864.32 | |
BSA | Roche | 10735086001 | |
Triton X100 | Roth | 3051.3 | |
goat anti-mouse coupled to Alexa 488 | invitrogen | A11029 | dilution 1:1000 |
goat anti-rabbit coupled to Alexa 568 | invitrogen | A11036 | dilution 1:1000 |
mounting medium | abcam | ab188804 | |
Tube, thinwall polypropylene | Beckman Coulter | 326823 | |
Poly-D-Lysine 1 mg/mL | SIGMA | A-003-E | |
Mouse monoclonal anti-Polyglutamylation modification mAb (GT335) | Adipogen | AG-20B-0020 | dilution 1:1000 |
glycerol mounting medium with DAPI and DABCO | Abcam | ab188804 | |
50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | |
Eppendorf 5810R centrifuge | Eppendorf | 5811000622 | |
Beckman JS-13.1 swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 346963 | |
Beckman SW 32Ti rotor | Beckman Coulter | 369694 | |
parafilm | Bemis | 13-374-10 | |
Leica TCS SP8 with Hyvolution mode | Leica | ||
OSRAM L18W/954 LUMILUX | Luxe Daylight/ OSRAM | ||
Whatman filter paper | Sigma | WHA1001325 | |
CrSAS-6/Bld12 antibody | dilution 1:300 (Hamel el al, 2014) | ||
Scipion | http://scipion.i2pc.es/ | ||
EM CCD camera (Andor iXON DU897) | Andor |