Vi har utvecklat en strategi för att rena och bild ett stort antal centrioles i olika inriktningar mottaglig för super-resolution mikroskopi och singel-partikel genomsnitt.
Centrioles finns stora makromolekylära församlingar som är viktigt för ett korrekt genomförande av grundläggande cell biologiska processer såsom celldelning, cell motilitet eller cellsignalering. Gröna alger Chlamydomonas reinhardtii har visat sig vara en insiktsfull modell i studien av centriol arkitektur, funktion och protein sammansättning. Trots stora framsteg mot förståelse centriolar arkitektur är en av de nuvarande utmaningarna att avgöra exakt lokalisering av centriolar komponenter inom strukturella regioner av centriol för att bättre förstå deras roll i centriol biogenes. En stor begränsning ligger i resolutionen av fluorescensmikroskopi, vilket komplicerar tolkningen av protein lokalisering i denna organell med dimensioner nära diffraktionsgränsen. För att ta itu med denna fråga, tillhandahåller vi en metod för att rena och bild ett stort antal C. reinhardtii centrioles med olika inriktningar använder super-resolution mikroskopi. Denna teknik tillåter vidarebearbetning av data genom fluorescerande singel-partikel genomsnitt (Fluo-SPA) på grund av det stora antalet centrioles som förvärvats. Fluo-SPA genererar medelvärden av målat C. reinhardtii centrioles i olika riktningar, vilket underlättar lokaliseringen av olika proteiner i centriolar underregioner. Ännu viktigare, kan denna metod tillämpas på bilden centrioles från andra arter eller andra stora makromolekylära sammanställningar.
Centriol är en evolutionärt bevarade organell som utgör kärnan av centrosome i djurceller och kan fungera som en basal kropp (kallad centrioles nedan) till mallen cilier eller flageller i många Eukaryoter1,2. Som sådan, är centrioles kritiska för grundläggande cell biologiska processer alltifrån spindelenhet till cell signalering. Därför har defekter i centriol montering eller funktion har associerats med flera mänskliga sjukdomar inklusive ciliopathies och cancer3.
Centrioles är niofaldig, symmetrisk, mikrotubuli triplet-baserade cylindriska strukturer som är, normalt ~ 450 nm lång och ~ 250 nm brett4,5,6,7. Konventionella elektronmikroskopi och cryo-elektron tomografi av centrioles från olika arter har visat att centrioles är polariserat längs deras långa axeln med tre distinkta regioner: en proximal region, en central kärna och en distala region5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. viktigast av allt, var och en av dessa regioner visar strukturella särdrag. Först innehåller lumen i regionen som 100 nm lång proximala cartwheel struktur ansluten till mikrotubuli triplett genom de pinhead element12. Andra regionen 300 – 400 nm lång centrala innehåller fibrösa tätheter i lumen och strukturella funktioner längs mitotiska inre ansikte: den Y-formade länkaren, C-tubuli svansen och den A-tubuli stub-9. Slutligen, 50 – 100 nm distala regionen uppvisar sub distala och distala bihang som omger den distala delen av centriol5,13.
De senaste två decennierna har präglats av upptäckten av ett ökande antal centriolar proteiner, vilket leder till en aktuell uppskattning av ca 100 olika proteiner som en del av de centriol14,15,16, 17. Trots dessa framsteg, exakt lokalisering av dessa proteiner inom centriol förblir svårfångade, särskilt inom strukturella underregioner. Viktigt, är tilldela en exakt lokalisering till strukturella regioner i centriol avgörande för en bättre förståelse för deras funktion. I detta avseende har C. reinhardtii centrioles varit avgörande för båda aspekterna av första delimitating olika strukturella drag längs den cylinder9,18,19, som sedan får forskare att korrelera lokaliseringen av en delmängd av proteiner med hjälp av fluorescerande mikroskopi till en sub strukturella region. Detta omfattar till exempel proteiner Bld12p och Bld10p, som lokaliserar i regionen proximala och i strukturen cartwheel särskilt20,21,22,23. Listan av underkonstruktionen lokaliserade proteiner innehåller också POB15 och POC16, två nya proteiner identifierats av masspektrometri som pryder regionen inre central kärna av C. reinhardtii centrioles17.
Detta dokument innehåller en fullständig beskrivning av den metod som utvecklats för att isolera och bild C. reinhardtii centrioles för efterföljande super-resolution mikroskopi och singel-partikel genomsnitt. För att uppnå detta mål är det viktigt att avgränsa de tekniska begränsningar som måste övervinnas. Först kan centriol rening påverka den övergripande arkitekturen, med cartwheel struktur ofta försvinner under de olika stegen i isolering9. För det andra är centriol dimensioner mycket nära diffraktionsgränsen i optisk mikroskopi. Den laterala resolution som kan erhållas i konfokalmikroskopi faktiskt omkring 200 nm24, liknande till diametern på centriol och resolutionen som i z-axeln handlar om 2 – 3 x lägre, vilket leder till en Anisotrop volym. För det tredje, heterogenitet antikropp märkning och centriol läggning kunde begränsa tolkningen behövs för att lokalisera ett protein i en specifik centriolar delregion. Slutligen existerar centrioles i endast två exemplar per cell, vilket gör det svårt att förvärva ett stort antal bilder och hitta en otvetydig centriol orientering. För att kringgå dessa tekniska frågor, utvecklat vi en metod som bygger på att tillämpa super-resolution mikroskopi på stort antal isolerade centrioles att antar olika inriktningar. Först kommer vi att beskriva ett protokoll för att rena C. reinhardtii centrioles som möjliggör rening av strukturellt intakt centrioles och procentrioles som innehåller cartwheel. Sedan kommer vi att beskriva ett stegvisa protokoll för att koncentrera sig på centrioles på coverslips för avbildning av konventionella eller super-resolution fluorescerande mikroskopi. Detta viktiga steg tillåter för att öka antalet centrioles som avbildas i flera riktningar. Slutligen kommer vi att beskriva ett förfarande för att utföra enkel-partikel genomsnitt på data förvärvade den fluorescerande Mikroskop som underlättar upptäckt av centrioles i olika inriktningar. Sammantaget kan denna metod tillämpas på bilden centrioles från olika arter eller andra stora makromolekylära sammanställningar.
En av utmaningarna i biologi är att dechiffrera den exakt lokaliseringen av proteiner i arkitektoniska sammanhang. Centriol är en idealisk struktur att tillämpa dessa metoder, eftersom dess arkitektur har studerats med hjälp av cryo-elektron tomografi, avslöjar intressanta ultrastrukturella funktioner längs dess längd. På grund av dess dimensioner nära gränsen på upplösning i optisk mikroskopi är det dock svårt att exakt lokalisera ett protein genom immunofluorescens till en strukturell delregion av den centriol som använder konventionella Mikroskop30.
Upplösningen i optisk mikroskopi begränsas av diffraktion av ljus som ger, ungefär, en lateral maximal upplösning på 200 nm i optisk mikroskopi24. Denna gräns har dock varit förbi en av de stora genombrotten under de senaste 20 åren i optisk mikroskopi: uppfinningen av super-upplösning metoder. Dessa metoder kan bilden utanför diffraktion gränserna vid olika upplösningar: 120 nm för SIM-kort, ca 50 nm för stimulerad emission utarmning (STED) och 20 – 40 nm för singel-molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM)24. Med dessa nya utvecklingar av super-resolution mikroskopi är strukturella underregionerna av centriol uppnåeliga. I praktiken är det dock fortfarande svårt att exakt bestämma localizationen av ett protein till ett strukturelement för den främsta anledningen att de mogna centrioles existerar i endast 2 exemplar per cell och har slumpmässiga riktlinjer, vilket gör tolkningen av lokalisering svårt. Av denna anledning inrättades ett protokoll som tillåter forskare att bilden av super-upplösning ett stort antal centrioles, ökar chansen att iaktta icke-tvetydigt riktlinjer. Ännu viktigare, eftersom denna metod förlitar sig på användningen av isolerade centrioles, vi tillhandahåller en metod för att rena intakt C. reinhardtii centrioles som innehåller mogen centrioles och procentrioles.
Slutligen, på grund av spänna av centriol riktlinjer som kan avbildas med detta protokoll, singel-partikel analys kan tillämpas med hjälp av elektronmikroskopi programvara. Detta resulterar i framtagningen av genomsnittliga klasser av centrioles i en viss läggning. Ännu viktigare, kan dessa resulterande 2D-bilder sedan användas till bedöma lokaliseringen av ett specifikt protein längs centriol. Ja, denna metod kan tillämpas på tvåfärgad super-upplösning bilder, och en färg kan användas för att avslöja centriol skelettet (t.ex., tubulin), medan den andra färgen kan hänföras till ett visst centriolar protein. Genom att subtrahera de medelvärden som erhålls med en färg eller två färger, blir det lättare att registrera ett protein längs centriol (proximala, centrala eller distala). Observera att de två kanalerna bör anpassas exakt för att förhindra någon vilseledande tolkningar. Dessutom hjälper medelvärden av top vyer dechiffrera om ett protein lokaliserar inuti centriolar lumen, längs mikrotubuli väggen, eller utanför centriol.
Denna metod har fördelen att fastställa lokaliseringen av specifika proteiner som kan vara svåra att lokalisera annars på grund av heterogena märkning. Observera att andra metoder för att kartlägga proteiner inom centrioles har beskrivits i korrelat 3D-SIM/SMLM med, exempelvis att bedöma de särskilda riktlinjerna av centrioles genom att bestämma de elliptiska profilen av en markör som bildar en torus runt den centriol av SIM-imaging. Med denna parameter, är det möjligt att lokalisera protein med en precision av 4 – 5 nm30. Observera också att den metod som beskrivs här används isolerade centrioles med intakt procentrioles, ett tecken på att centriol arkitekturen är mest sannolikt till stor del bevarad. Dock kan vi inte utesluta att vissa arkitektoniska funktioner störs under reningen, såsom centriol diameter varierar med koncentrationen av divalenta katjoner som förstärks med isolering av den mänskliga centrosome5.
En av de kritiska steg i de protokoll som presenteras här är att erhålla tillräckligt koncentrerad isolerade centrioles i olika inriktningar mottagliga för Fluo-SPA. Gör först säkerställa renheten och effektiviteten i förfarandet centriol isolering. En låg koncentration av isolerade centrioles förhindrar korrekt imaging och ytterligare bildbehandling. För detta ändamål tillhandahåller vi en metod för att berika antalet centrioles per synfält. Beroende på antalet centrioles i det bråk som används, bör den volym som laddats i anrikningsverket justeras, med en maximal volym på 250 µL.
Viktigast av allt, har denna metod utvecklats för en cellvägg minus cw15-C. reinhardtii celler. I denna stam möjliggör bräckligheten i cellväggen en ordentlig Lysering av cellerna och därmed befrielsen av dess innehåll. Detta protokoll är inte effektivt för vildtyp C. reinhardtii celler, som cellväggen hindrar en korrekt lysis. Alternativa strategier såsom ultraljudsbehandling eller en före inkubering av cellerna med autolysin, ett enzym som kan försämra de cellvägg31, skulle behöva vidtas för att förändra cellväggen innan protokollet isolering som presenteras här.
Detta upplägg kan användas med olika typer av Mikroskop, allt från konventionella confocal Mikroskop till hög genomströmning dedikerade super-upplösning Mikroskop. Observera att när du gör SMLM, en särskild buffert krävs för korrekt avbildning och, således, en kammare som anpassats för ett 12 mm täckglas med bufferten ovanpå täckglaset bör användas. Efterföljande imaging utförs med inverterade Mikroskop. Om Mikroskop set-up inte tillåter ett 12 mm täckglas, kan det protokoll som presenteras här tillämpas på 18 mm coverslips använder en 30 mL runda-botten tub och en modifierad adapter och koncentrator. Det är också viktigt att Observera att kvaliteten på den slutliga återuppbyggnaden i SMLM kommer att bero på kvaliteten på färgningen och av primär antikropp används, liksom metoden för fixering.
Sammanfattningsvis tillhandahåller vi en metod som kan tillämpas på bilden talrika centrioles följt av Fluo-SPA som kommer att generera medelvärden av centrioles i olika riktningar, vilket bidrar till att lokalisera centriolar protein med precision. Viktigast av allt, kan denna metod tillämpas mer allmänt till isolerade centrioles från andra arter, till andra organeller, eller till stora makromolekylära sammanställningar. Slutligen den prov förberedelse metoden presenteras här, kombinerat med senaste algoritmutveckling för singel-partikel analys av fluorescerande SMLM data32, kunde öppna ytterligare förbättring i den molekylära cartography av stora makromolekylära församlingar.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Pierre Gönczy och BioImaging & Optik plattform (Vävnadsprover) vid École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Lausanne, Schweiz, där SIM-bilderna av centrioles förvärvades. Nikolai Klena och Davide Gambarotto stöds av Europeiska forskningsrådet (ERC) Starting Grant (StG) 715289 (ACCENT) och Maeva Le Guennec, Paul Guichard och Virginie Hamel av den schweiziska National Science Foundation (SNSF) PP00P3_157517. Susanne Borgers stöds av universitetet i Genève.
Mouse monoclonal anti-apha tubulin (clone DM1A) | Abcam | ab7291 | dilution 1:300 |
DNaseI | Roche | 10104159001 | |
12 mm coverslips | Roth | YX03.1 | |
18 mm coverslips | Roth | LH23.1 | |
K2HPO4 | Fluka | 60355 | |
KH2PO4 | Fluka | 60230 | |
Tris base | Biosolve Chimie SARL | 0020092391BS | |
acetic acid | Carlo Erba Reagents | 524520 | |
NH4Cl | Sigma | A-4514 | |
CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
MgSO4 | Sigma | 63140-500G-F | |
steritop filter | Millipore | SCGPT05RE | |
sucrose | Sigma | S7903-1KG | |
HEPES | AppliChem PanReac | A3724,0250 | |
PIPES | Sigma | P6757-500G | |
MgCl2 | ACROS ORGANICS | 197530010 | |
NP-40 | AppliChem PanReac | A1694,0250 | |
Round-bottom (Kimble) tubes 15 mL | Fisherscientific | 09-500-34 | |
Round-bottom (Kimble) tubes 35 mL | Fisherscientific | 09-500-37 | |
cover glass staining rack | Thomas scientific | 8542E40 | |
crystal polystyrene transmission lab box | FISHERS | 11712944 | |
Methanol | VWR | 20864.32 | |
BSA | Roche | 10735086001 | |
Triton X100 | Roth | 3051.3 | |
goat anti-mouse coupled to Alexa 488 | invitrogen | A11029 | dilution 1:1000 |
goat anti-rabbit coupled to Alexa 568 | invitrogen | A11036 | dilution 1:1000 |
mounting medium | abcam | ab188804 | |
Tube, thinwall polypropylene | Beckman Coulter | 326823 | |
Poly-D-Lysine 1 mg/mL | SIGMA | A-003-E | |
Mouse monoclonal anti-Polyglutamylation modification mAb (GT335) | Adipogen | AG-20B-0020 | dilution 1:1000 |
glycerol mounting medium with DAPI and DABCO | Abcam | ab188804 | |
50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | |
Eppendorf 5810R centrifuge | Eppendorf | 5811000622 | |
Beckman JS-13.1 swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 346963 | |
Beckman SW 32Ti rotor | Beckman Coulter | 369694 | |
parafilm | Bemis | 13-374-10 | |
Leica TCS SP8 with Hyvolution mode | Leica | ||
OSRAM L18W/954 LUMILUX | Luxe Daylight/ OSRAM | ||
Whatman filter paper | Sigma | WHA1001325 | |
CrSAS-6/Bld12 antibody | dilution 1:300 (Hamel el al, 2014) | ||
Scipion | http://scipion.i2pc.es/ | ||
EM CCD camera (Andor iXON DU897) | Andor |