यहां वर्णित टैगिंग endogenously के लिए एक प्रोटोकॉल मानव प्रेरित pluripotent स्टेम CRISPR/Cas9 का उपयोग कर कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट टैग के साथ प्रोटीन व्यक्त की है । Putatively संपादित कोशिकाओं प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई द्वारा समृद्ध कर रहे हैं और क्लोनिंग सेल लाइनों उत्पन्न कर रहे हैं.
एक प्रोटोकॉल मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) है कि एक्सप्रेस अंतर्जात प्रोटीन में फ्रेम N-या सी-टर्मिनल फ्लोरोसेंट टैग से जुड़े पैदा करने के लिए प्रस्तुत किया है । prokaryotic CRISPR/Cas9 प्रणाली (संकुल नियमित रूप से प्रतिरिक्ति लघु palindromic दोहराता/CRISPR-संबंधित 9) exogenous के माध्यम से जीनोमिक loci निर्देशित मरंमत (HDR) में बड़े समरूपता दृश्यों को लागू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । वांछित दस्तक में प्राप्त करने के लिए, इस प्रोटोकॉल ribonucleoprotein (RNP) आधारित दृष्टिकोण जहां जंगली प्रकार स्ट्रेप्टोकोकस pyogenes Cas9 प्रोटीन, सिंथेटिक 2 भाग गाइड आरएनए (gRNA), और एक दाता टेम्पलेट प्लाज्मिड के माध्यम से कोशिकाओं को दिया जाता है रोजगार electroporation । Putatively संपादित कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट में टैग प्रोटीन व्यक्त प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) द्वारा समृद्ध कर रहे हैं. क्लोनिंग लाइनों तो उत्पंन कर रहे है और सटीक संपादन परिणामों के लिए विश्लेषण किया जा सकता है । ब्याज की जीन के जीनोमिक लोकस में फ्लोरोसेंट टैग शुरू करके, परिणामस्वरूप उपसेलुलर स्थानीयकरण और फ्यूजन प्रोटीन की गतिशीलता अंतर्जात विनियामक नियंत्रण के तहत अध्ययन किया जा सकता है, पारंपरिक पर एक महत्वपूर्ण सुधार सिस्टम. जीन टैगिंग के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में hiPSCs का प्रयोग द्विगुणित, विपरिवर्तित कोशिकाओं में टैग किए गए प्रोटीन का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है. चूंकि hiPSCs एकाधिक सेल प्रकार में विभेदित किया जा सकता है, इस दृष्टिकोण को बनाने और अध्ययन isogenic सेलुलर संदर्भों की एक किस्म में प्रोटीन टैग का अवसर प्रदान करता है ।
जीनोम का उपयोग संपादन रणनीतियों, विशेष रूप से CRISPR/Cas9, सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए तेजी से सुलभ और मूल्यवान1,2,3,4,5, हो रहा है 6 , 7. CRISPR/Cas9 के कई अनुप्रयोगों में से एक है परिचय (via समरूपता निर्देशित मरंमत (HDR) बड़े exogenous अनुक्रम के ऐसे विशिष्ट GFP जीनोमिक में loci के रूप में है कि एक जीन या प्रोटीन उत्पाद 8 की गतिविधि के लिए रिपोर्टर के रूप में सेवा . इस तकनीक के लिए एक अंतर्जात खुला पढ़ने के फ्रेम जहां जिसके परिणामस्वरूप endogenously विनियमित फ्यूजन प्रोटीन के लिए एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन अनुक्रम में शामिल होने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सेलुलर स्थानीयकरण और 5 ब्याज के प्रोटीन की गतिशीलता कल्पना ,6,9,10,11. जबकि endogenously टैग प्रोटीन की पेशकश कई लाभ के लिए एक्सप्रेस सिस्टम की तुलना में, मानव जीनोम में बड़े दृश्यों डालने एक अक्षम प्रक्रिया आम तौर पर एक चयन या संवर्धन रणनीति कोशिकाओं की आबादी है कि प्राप्त करने के लिए मांग कर सकते है आसानी से5,12का अध्ययन किया ।
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक डीएनए एक वांछित जीनोमिक लोकस में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (FP) एंकोडिंग अनुक्रम के सम्मिलन । प्रोटोकॉल डिजाइन और दाता टेंपलेट प्लाज्मिड के वितरण शामिल है, और ribonucleoprotein (RNP) परिसर (वंय प्रकार एस pyogenes Cas9 प्रोटीन सिंथेटिक CRISPR आरएनए (crRNA) और ट्रांस सक्रिय crRNA (tracrRNA) के साथ संयुक्त) । यह भी वर्णित प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) और क्लोनिंग सेल लाइन पीढ़ी प्रक्रिया के माध्यम से putatively संपादित कोशिकाओं के संवर्धन है । तारीख करने के लिए, इस विधि या तो monoallelic या (शायद ही कभी) द्वि-allelic ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ hiPSC लाइनें उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है पच्चीस लेबल के प्रमुख सेलुलर संरचनाओं का प्रतिनिधित्व प्रोटीन । इन प्रयासों से परिणामी संपादित कोशिकाओं की उंमीद आनुवंशिक प्रविष्टि है की पुष्टि की गई है, एक सही ढंग से स्थानीयकरण फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त, और बनाए रखने के pluripotency और एक स्थिर कैरयोटाइप12 (और अप्रकाशित डेटा) । इस विधि भी कई अंय एकल और दोहरी उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है (दो अलग एक ही सेल में टैग प्रोटीन) hiPSCs की आबादी संपादित (अप्रकाशित डेटा) ।
मानव एक स्वस्थ दाता से व्युत्पंन iPSCs इन जीनोम के संपादन के प्रयासों के लिए चुना क्योंकि, कई पारंपरिक कोशिका लाइनों के विपरीत थे, वे द्विगुणित कर रहे हैं, karyotypically स्थिर, गैर तब्दील, और प्रफलन । ये गुण मौलिक कोशिका जीवविज्ञान और रोग मॉडलिंग का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल प्रदान करते हैं । इसके अलावा, hiPSCs के भेदभाव की क्षमता विभिंन वंश और कोशिका organoids, ऊतकों और “एक डिश में रोग” 13 मॉडल सहित isogenic कोशिकाओं का उपयोग प्रकार भर में समानांतर में कई विकास चरणों के अध्ययन का अवसर प्रदान करता है ,१४,१५. हालांकि इस प्रोटोकॉल hiPSCs (वर्ल्ड ट्रेड सेंटर लाइन) के लिए विकसित किया गया था, यह अंय स्तनधारी सेल लाइनों का उपयोग प्रोटोकॉल के विकास के लिए जानकारीपूर्ण जा सकता है ।
विधि hiPSCs में endogenously विनियमित फ्लोरोसेंट प्रोटीन संलयन उत्पंन करने के लिए यहां प्रस्तुत की एक बहुमुखी और शक्तिशाली दृष्टिकोण है जीने सेल इमेजिंग से विभिंन कार्यात्मक अध्ययन करने के लिए आवेदन के साथ जीन संपादित सेल लाइनों को पैदा करने के लिए और ” एक डिश में रोग “रोगी-व्युत्पंन hiPSC लाइनों13,14,15का उपयोग कर मॉडल । हालांकि इस विधि N के लिए बड़े FP टैग लागू करने के लिए इस्तेमाल किया गया है या सी-अंतर्जात प्रोटीन के टर्मिनस, यह संभवतः के लिए अंय टैग या छोटे आनुवंशिक परिवर्तन मॉडल या सही रोग से परिचय किया जा सकता है-उत्परिवर्तनों22,23 के कारण . छोटे आवेषण के लिए, समरूपता बांह का आकार कम हो सकता है, लेकिन इस पद्धति में प्रस्तुत संपादन करने के लिए सामांय दृष्टिकोण अभी भी24,25लागू हो सकता है । जबकि hiPSCs का उपयोग दृढ़ता से अपने विशाल उपयोगिता के लिए प्रोत्साहित किया जाता है, सावधान अनुकूलन के साथ, इस प्रोटोकॉल के लिए अंय स्तनधारी सेल लाइनों के जीनोम संपादित अनुकूलित हो सकता है ।
जब एफ पी टैगिंग के लिए ब्याज की एक जीन की पहचान, प्रतिलिपि बहुतायत का अनुमान (microarray या आरएनए-Seq डेटा से) का आकलन है कि एक जीन या ब्याज की isoform व्यक्त की है के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु हैं, हालांकि प्रतिलिपि स्तर हमेशा के साथ सहसंबंधी नहीं है प्रोटीन का स्तर । FACS-संवर्धन रणनीति यहां वर्णित जीन के लिए सबसे अच्छा काम करेंगे कि कम से मध्यम अच्छी तरह से ब्याज की कोशिका प्रकार में व्यक्त कर रहे हैं । इस रणनीति भी फ्यूजन कि शो कबरा और/या centrin, desmoplakin, और paxillin के रूप में असतत स्थानीयकरण पैटर्न जहां पृष्ठभूमि अनुपात करने के लिए संकेत बहुत कम है के लिए चयन में सफल रहा है12,19। जीन है कि उच्च व्यक्त नहीं कर रहे है या केवल व्युत्पंन सेल प्रकार में व्यक्त कर रहे है अतिरिक्त चयन रणनीतियों की आवश्यकता हो सकती है ।
मानव कोशिका रेखाओं में प्रयुक्त crRNA और दाता टेम्पलेट प्लाज्मिड डिजाइनों के लिए प्रारंभिक बिंदु मानव संदर्भ जीनोम (GRCh38) होना चाहिए. क्योंकि विभिन्न कोशिका रेखाओं के जीनोम एक ही प्रजाति के भीतर भिन्न हो सकते हैं, और चूँकि CRISPR/Cas9 अनुक्रम-विशिष्ट है, इसलिए यह सेल लाइन-विशिष्ट वेरिएंट (एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं या सम्मिलन/विलोपन (indels)) की पहचान करने के लिए अत्यंत उपयोगी है कि संदर्भ जीनोम से अलग है और डिजाइन में इन शामिल । यह सुनिश्चित करता है कि crRNAs मेजबान जीनोम के साथ संगत होगा और है कि दाता समरूपता शस्त्र प्लाज्मिड टेंपलेट किसी भी सेल लाइन विशिष्ट वेरिएंट बनाए रखने होंगे । एक सुझाव दिया रणनीति डिजाइन प्रक्रिया के दौरान crRNAs और दाता प्लाज्मिड समरूपता हथियार टेंपलेट में homozygous वेरिएंट शामिल है । heterozygous वेरिएंट को शामिल करना वैकल्पिक है । इस प्रोटोकॉल के लिए बड़े नॉक-इन प्रयोगों और अन्य प्रमुख बातों के लिए उपयोग किए गए विशिष्ट रिएजेंट नीचे चर्चा में हैं.
Cas9 प्रोटीन
Cas9 प्रोटीन का उपयोग करने का प्राथमिक लाभ यह है कि एक RNP परिसर के रूप में Cas9 और gRNA का परिचय nuclease के प्लाज्मिड-आधारित दृष्टिकोण की तुलना में गतिविधि की एक सीमित अवधि में परिणाम दिखाया गया है, जहां Cas9 और gRNA की अभिव्यक्ति दिनों के लिए जारी रख सकते है और नेतृत्व पर-और ऑफ़-टारगेट गतिविधि को अधिक से अधिक26,27। Cas9 प्रोटीन का उपयोग करने का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि यह कोशिकाओं के अंदर एक बार सट करने के लिए आसानी से उपलब्ध है । यह Cas9 mRNA या Cas9/gRNA प्लाज्मिड कि प्रतिलेखन, अनुवाद और प्रोटीन प्रसंस्करण26,28की आवश्यकता का उपयोग कर के और अधिक परंपरागत तरीकों के साथ विरोधाभासों । Wildtype एस pyogenes Cas9 प्रोटीन अब कई वाणिज्यिक स्रोतों से उपलब्ध है ।
गाइड आरएनए
वहाँ कई सार्वजनिक रूप से वांछित FP सम्मिलन साइट है कि शून्य या कुछ की भविष्यवाणी की है के पास crRNA लक्ष्य खोजने के लिए उपलब्ध उपकरण हैं-मेजबान जीनोम29,30,31,३२में लक्ष्य । hdr में क्षमता और hdr परिणाम की परिशुद्धता crRNA लक्ष्य के बीच व्यापक रूप से बदलती है एक दिया लोकस12में इस्तेमाल किया । इस कारण से, परीक्षण के लिए कई crRNAs (2-4 और अधिमानतः के भीतर ५० बीपी प्रविष्टि साइट की) लोकस प्रति यह एक सफल संपादन प्रयोग की संभावना बढ़ सकता है के रूप में सिफारिश की है । gRNA पहुंचाने के लिए मौजूदा संभावनाओं सिंथेटिक 2 भाग crRNA और tracrRNA, सिंथेटिक एकल gRNAs (sgRNAs), इन विट्रो में sgRNAs, या एक प्लाज्मिड प्रमोटर से sgRNA व्यक्त कोशिकाओं को एक U6 पहुंचाने में शामिल हैं । इस प्रोटोकॉल उच्च क्लीवेज गतिविधि के लिए अनुकूलित नहीं किया गया था । unmodified 2-भाग crRNA और tracrRNA ( सामग्री की तालिकादेखें) मोनो-allelic FP-टैग सेल लाइनों के उत्पादन के लक्ष्य के साथ इस्तेमाल किया गया था, जबकि कोशिकाओं को कम क्षमता गड़बड़ी के कारण ।
दाता टेम्पलेट प्लाज्मिड
क्योंकि समरूपता हाथ दाता टेंपलेट प्लाज्मिड में उपलब्ध कराई क्रम के कुछ hdr घटना के दौरान मेजबान जीनोम में शामिल किया जाएगा, crRNA मांयता साइटों के लिए बिंदु उत्परिवर्तनों hdr निंनलिखित Cas9 द्वारा आगे दरार को रोकने के लिए शुरू किया जाना चाहिए । अक्सर सरल विघटनकारी परिवर्तन के लिए पाम अनुक्रम बदलना है । क्योंकि कुछ गैर विहित पाम अनुक्रम अभी भी जंगली प्रकार एस pyogenes Cas9 द्वारा मांयता प्राप्त किया जा सकता है, यह सबसे अच्छा है NGG, नाग या NGA३३का उपयोग कर से बचने के । जब समरूपता बांह में बदलना, गैर पर्यायी उत्परिवर्तनों और दुर्लभ codons के परिचय से बचें । यदि पाम अनुक्रम के लिए एक पर्याय परिवर्तन संभव नहीं है, बीज क्षेत्र में तीन पर्याय बिंदु उत्परिवर्तन बनाने पर विचार (10 पाम के लिए) बीपी crRNA बाध्यकारी साइट के समीपस्थ । इन क्षेत्रों में महत्वपूर्ण विनियामक अनुक्रम हो सकता है जब से 5 पिरणामस्वरूप untranslated क्षेत्र (UTR) में इन परिवर्तनों को बनाने जब चरम देखभाल लिया जाना चाहिए । इस तरह के UCSC जीनोम ब्राउज़र की तुलनात्मक जीनोमिक्स पटरियों के रूप में एक आनुवंशिक संरक्षण डेटाबेस परामर्श इन मामलों में मार्गदर्शन प्रदान कर सकते हैं, गैर के लिए परिवर्तन के रूप में संरक्षित ठिकानों को उच्च संरक्षित ठिकानों17परिवर्तन से बेहतर बर्दाश्त किया जा सकता है । कई बार FP अनुक्रम की मात्र प्रविष्टि crRNA बाइंडिंग साइट ( चित्रा 1में के रूप में) को बाधित करने के लिए पर्याप्त है; हालांकि, नए जोड़े अनुक्रम crRNA बाध्यकारी और पाम दृश्यों के हठ के लिए जांच की जानी चाहिए ।
एफ पी और देशी प्रोटीन के बीच एमिनो एसिड लिंकर्स को फ्यूजन प्रोटीन३४के समारोह के संरक्षण की सिफारिश की है । अक्सर एक एमिनो एसिड लिंक अपने विशेष शुल्क या आकार के लिए चुना जा सकता है । यदि लक्षित अंतर्जात फ्यूजन प्रोटीन के समान डिजाइन के साथ एक सीडीएनए संलयन अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है, कि एक ही linker अनुक्रम CRISPR/Cas9 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता दस्तक-प्रयोग में12,19। यदि ऐसी जानकारी अनुपलब्ध है, तो GTSGGS के रूप में एक छोटा लिंक भी सफलतापूर्वक12का उपयोग किया गया है । अंय अध्ययनों से एक सामांय छोटे 3-३५लक्ष्य की एक किस्म के लिए एमिनो एसिड linker अनुक्रम के साथ सफलता का प्रदर्शन किया है ।
अभिकर्मक व FACS संवर्धन
कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मक रिएजेंट कोशिकाओं के अणुओं के कुछ प्रकार के वितरण के लिए तैयार कर रहे हैं, जबकि एक electroporation प्रणाली आकार, प्रभारी, और संरचना की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ रिएजेंट देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । hiPSCs जैसे कठिन-से-transfect कोशिकाओं के लिए एक आम अभिकर्मक विधि होने के अलावा, electroporation भी CRISPR के लिए सभी तीन घटकों को देने का लाभ वहन करती है/Cas9-मध्यस्थता FP नॉक-इन के रूप में इस पद्धति में वर्णित है । Electroporation के लिए सबसे अच्छा परिणाम जब अंय व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है जब इस विधि (डाटा नहीं दिखाया गया है) के विकास के लिए जब की तुलना में पाया गया था, और भी RNP प्रसव के लिए दूसरों के द्वारा इस्तेमाल किया गया है26,28,३६ .
संपादन hiPSCs के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय, विशेष देखभाल से पहले और इष्टतम सेल अस्तित्व और कम से सहज भेदभाव के लिए जीन संपादन प्रक्रिया के बाद कोशिकाओं की कोमल हैंडलिंग सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए । विशेष रूप से, FACS संवर्धन विधियों सबसे बड़ा संभव नलिका (१३० µm), एक कम प्रवाह दर (≤ 24 µ l/), परिरक्षक-मुक्त म्यान द्रव (जैसे खारा, सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके स्टेम सेल छंटाई के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, और कम नमूना दबाव (10 साई) । इसके बजाय एकल कोशिका छंटाई, जो स्टेम सेल में इष्टतम व्यवहार्यता में परिणाम, FACS-समृद्ध hiPSCs थोक में हल कर रहे है और एक जनसंख्या के रूप में विस्तारित करने के लिए सेल व्यवहार्यता और स्टेम सेल अखंडता का अनुकूलन । हालांकि, एकल कक्ष सॉर्टिंग कम संवेदनशील कक्ष प्रकारों के लिए उपयुक्त हो सकता है । सेल अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए, कोशिकाओं को FACS संवर्धन के लिए फसल कटाई के बाद अब एक घंटे से अधिक संस्कृति को लौट रहे है और छंटाई की प्रक्रिया में कमरे के तापमान पर रखा । कुछ सेल प्रकार के लिए, सेल अस्तित्व भी छंटाई प्रक्रिया के दौरान बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर कोशिकाओं को गर्मी से बढ़ाया जा सकता है ।
FP-सकारात्मक कोशिकाओं का थोक विस्तार क्लोनिंग लाइनों को पैदा करने से पहले फ्यूजन प्रोटीन स्थानीयकरण के लिए इमेजिंग विश्लेषण द्वारा जनसंख्या का मूल्यांकन करने का अवसर प्रदान करता है । जबकि कोशिकाओं के परिणामस्वरूप समृद्ध जनसंख्या कुछ अध्ययनों के लिए पर्याप्त हो सकता है, इन आबादियों अक्सर तीव्रता बदलती के FP संकेत प्रदर्शन । अलग क्लोनिंग लाइनों वर्दी संकेत (चित्रा 3) है, उन्हें कार्यात्मक प्रयोगों12के लिए और अधिक उपयुक्त बनाने.
क्लोनिंग सेल लाइन जनरेशन
संपादन और क्लोनिंग लाइन पीढ़ी प्रक्रिया के दौरान, यह सेल आकृति विज्ञान की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है । hiPSC फीडर में उगाई गई कालोनियां-मुक्त शर्तों चिकनी किनारों और एक भी, अच्छी तरह से पैक केंद्र12,18,19प्रदर्शन करना चाहिए । विभेदित कोशिकाओं को संस्कृति के 5% से कम में मनाया जाना चाहिए । जब व्यक्तिगत कालोनियों उठा, उन है कि प्रदर्शन अच्छा आकृति विज्ञान चुनें । ९६-खैर प्लेट passaging घटनाओं के दौरान, आकृति विज्ञान के लिए क्लोन की जाँच करें और उन है कि यह भेदभाव करने के लिए नेतृत्व या आनुवंशिक अस्थिरता का एक संकेत हो सकता है के रूप में ऊंचा हो गया है बंद ।
क्लोनिंग सेल लाइनों की पीढ़ी सटीक संपादन है, जो महत्वपूर्ण है की आनुवंशिक पुष्टि के लिए अनुमति देता है क्योंकि Cas9-प्रेरित जीनोम में डबल किनारा टूटता अक्सर वांछित लोकस पर टैग के शामिल होने के बावजूद गलत रूप से मरंमत कर रहे हैं । पहले वर्णित पीसीआर आधारित परख दिखाया है कि संचई दस अद्वितीय जीनोमिक भर में loci कई (४५%)-एक्सप्रेस क्लोन के लक्षित लोकस पर दाता प्लाज्मिड रीढ़ एकीकरण से पीड़ित या (शायद ही कभी)12जीनोम में बेतरतीब ढंग से । इसके अतिरिक्त, GFP के 23%-सकारात्मक क्लोन (n = 177) दस अद्वितीय loci भर में या प्रत्याशित crRNA काटने साइट के पास में टैग एलील, सबसे NHEJ12के कारण होने की संभावना के पास बंदरगाह उत्परिवर्तनों के लिए पाए गए । कई क्लोनिंग लाइनों के इस आनुवंशिक विश्लेषण (~ १०० क्लोन/आनुवंशिक मांयता है कि FP-अभिव्यक्ति और अपेक्षित फ्यूजन प्रोटीन स्थानीयकरण अकेले सटीक संपादन 12 गारंटी नहीं है के बाद से एक कोशिका आबादी में संभव नहीं है के महत्व को रेखांकित . इसके अतिरिक्त, इन पीसीआर आधारित परख किसी भी निश्चितता के साथ कोशिकाओं की समृद्ध आबादी पर नहीं किया जा सकता है, सार्थक विश्लेषण से पहले क्लोनिंग लाइन पीढ़ी के लिए आवश्यकता वारंट पूरा किया जा सकता है । डाला FP टैग और अप्रकाशित एलील की आनुवंशिक अखंडता के सत्यापन के आनुवंशिक पुष्टि (एक मोनो allelic संपादित क्लोन में) दोनों के लिए टैग अभिव्यक्ति से परे लक्षित लोकस पर सटीक संपादन सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं ।
द्वि-allelic संपादन और ऑफ लक्ष्य उत्परिवर्तनों की कमी की एक कम दर (के रूप में सैंज और exome अनुक्रमण द्वारा परख) इस विधि (अप्रकाशित डेटा)12का उपयोग करने की तारीख को मनाया गया है । इस पिछले CRISPR/Cas9 प्रयोगों26,27के लिए कम-स्थाई RNP के उपयोग का वर्णन अध्ययनों के अनुरूप है । द्वि-allelic संपादन के साथ क्लोनिंग सेल लाइनों की कमी भी विशिष्ट या सेल की अक्षमता के कारण लोकस किया जा सकता है एक आवश्यक प्रोटीन की प्रतियां दो टैग को बर्दाश्त के रूप में पहले से प्रकाशित प्रयोगों से जहां ख्यात द्वि-allelic संपादित कोशिकाओं थे सुझाया एक लोकस (LMNB1) के लिए मनाया, लेकिन नहीं एक और (TUBA1B)12। द्वि-allelic पूरी तरह से मान्य क्लोनल सेल लाइनों ST6 बीटा-galactoside अल्फा-2, 6-sialyltransferase 1 (ST6GAL1), और RAB5A सदस्य रास oncogene परिवार (RAB5A) के साथ mEGFP19टैग करने के लिए इस विधि का उपयोग कर उत्पन्न किया गया है.
जीनोम में संपादित की पुष्टि परिशुद्धता परे, वहां गुणवत्ता नियंत्रण परख कि आगे क्लोनिंग लाइन विशेषताएं और क्लोनों कि सभी स्टेम सेल, जीनोमिक, और सेल जैविक मानदंडों को पूरा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक किस्म है भविष्य के अध्ययन में उपयोग के लिए . सेल जैविक और कार्यात्मक परख के लिए उपयुक्त अभिव्यक्ति, स्थानीयकरण, और फ्यूजन प्रोटीन12के समारोह की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अप्रकाशित अभिभावक नियंत्रणों की तुलना स्थानीयकरण, गतिशीलता और फ़ंक्शन पर संपादन प्रक्रिया के प्रभाव का मूल्यांकन करने में मदद करेगी । ऐसे विकास विश्लेषण और जीनोमिक स्थिरता के लिए परीक्षण के रूप में अंय परख भी अगर टैग प्रोटीन सेल को perturbing है निर्धारित करने में मदद कर सकते हैं । जब इस प्रोटोकॉल में hiPSC का उपयोग कर, pluripotency मार्करों और भेदभाव की क्षमता का मूल्यांकन एक क्लोन है कि बहाव12के अध्ययन के लिए मूल्यवान है निर्धारित करने में महत्वपूर्ण हो सकता है । क्योंकि hiPSC की विस्तारित संस्कृति आनुवंशिक अस्थिरता के लिए नेतृत्व दिखाया गया है, विकास दर और क्लोनिंग सेल लाइनों के कैरयोटाइप की निगरानी भी महत्वपूर्ण है12,३७। हालांकि, संपादित कोशिकाओं के अंतिम उद्देश्य का उपयोग अंततः स्तर और गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण के विस्तार का निर्धारण करेगा और आवेदन के आधार पर भिंन होगा ।
The authors have nothing to disclose.
हम कई व्यावहारिक विचार विमर्श और जीन संपादन पर सलाह के लिए Daphne Dambournet धंयवाद, थाओ चित्रण के लिए करते हैं, पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Angelique नेल्सन, और एंड्रयू टकर mEGFP B1 सेल लाइन टैग पैदा करने के लिए । हम सेल विज्ञान के लिए एलन संस्थान में जीन संपादन और गुणवत्ता नियंत्रण प्रक्रिया के लिए उनके योगदान के लिए स्टेम सेल और जीन संपादन और परख विकास टीमों को स्वीकार करना चाहते हैं । वर्ल्ड ट्रेड सेंटर लाइन है कि हम अपने जीन-संपादित सेल लाइन बनाने के लिए इस्तेमाल किया ग्लैडस्टोन संस्थानों और UCSF में ब्रूस आर Conklin प्रयोगशाला द्वारा प्रदान किया गया था । हम सेल विज्ञान के संस्थापक, पॉल जी एलन के लिए एलन संस्थान, उसकी दृष्टि, प्रोत्साहन के लिए धंयवाद, और समर्थन करते हैं ।
Geneious R9 | Biomatters, or similar | bioinformatics software for in silico donor plasmid design | |
TE Buffer pH 8.0 | IDT, or similar | 11-01-02-05 | |
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator, or similar | ThermoFisher Scientific, or similar | 51030408 | |
Pipettes (1000 µL, 200 µL, 20 µL, 10 µL, 2 µL) | Rainin, or similar | ||
Pipette tips (1000 µL, 200 µL, 20 µL) | Rainin, or similar | ||
Multi-channel Pipette (200 µL) | Rainin, or similar | ||
Serological pipetes (25 mL, 10 mL, 5 mL) | Costar, or similar | ||
BRAND 8-Channel Manifold for Quiksip, Autoclavable | Millipore Sigma, or similar | BR704526-1EA | use with non-filtered pipet tips, such as Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10, below |
Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10 | Thermo Fisher, or similar | 3501-05 | |
XP2 Pipette Controller | Drummond, or similar | 4-000-501 | |
Disposable Pasteur Pipets | VWR, or similar | 53300-567 | |
Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | CELLGARD, or similar | NU-481 | |
Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | lot tested before use with hiPSC |
DMEM/F12 (-phenol red) | Gibco | 11039-021 | cold, for diluting Matrigel 1:30 |
mTeSR1 Complete Media | StemCell Technologies | 85850 | recommended growth media for WTC hiPSC line |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
WTC hiPSC line | Coriell | GM25256 | the hiPSC line used in this protocol is available through Coriell |
Tissue culture dish 100 mm | Falcon | 353003 | |
6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657160 | |
StemPro Accutase | Gibco | A11105-01 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
15 mL polystyrene conical | Sarstedt | 62.554.100 | |
Y-27632 (ROCK Inhibitor) | StemCell Technologies | 72308 | |
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic crRNA, unmodified (custom sequence) | Dharmacon | Custom0247 | |
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA | Dharmacon | U-002005-05 | |
Recombinant wild-type Streptococcus pyogenes Cas9-NLS purified protein, 40 µM | University of California-Berkeley QB3 Macrolab | ||
Custom donor plasmid (PriorityGENE) | Genewiz | donor insert design was synthesized and cloned into pUC57 backbone by Genewiz | |
DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
NucleoBond Xtra Maxi EF | Clontech | 740424.50 | |
Neon Transfetion System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | |
Neon Transfection System, 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | |
5 mL Polystyrene Round-bottom Tube with Cell Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
15 mL High Clarity Polyproylene Conical Tube | Falcon | 352196 | |
FACSAriaIII Fusion | BD Biosciences | 656700 | |
FACSDiva software | BD Biosciences | ||
FlowJo version 10.2 | TreeStar | ||
NERL Blood Bank Saline | ThermoFisher Scientific | 8504 | used as preservative-free FACS Buffer |
Olympus SZX7 Stereo Microscope, or similar | Olympus, or similar | ||
Tissue culture plate, 96-well | Falcon | 353072 | |
96 well Cell Culture Plate, V-Bottom | CELLSTAR | 351180 | |
CryoStor CS10 | Sigma | C2874-100ML | used as cryopreservation buffer for cells in 96-well plate format |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
24 well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 662160 |