Beskrivs här är ett protokoll för taggning endogenously uttryckte proteiner med fluorescerande Taggar i mänskliga inducerade pluripotenta stamceller med CRISPR/Cas9. Förment redigerade celler berikas av fluorescens aktiverad cell sortering och klonal cellinjer genereras.
Ett protokoll presenteras för att skapa mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) som express endogena proteiner smält för att i-frame N – eller C-terminala fluorescerande taggar. Det prokaryota CRISPR/Cas9-systemet (klustrad regelbundet mellanliggande short palindromic repetitioner/CRISPR-associerade 9) kan användas för att införa stora exogena sekvenser i genomisk lokus via homologi regisserad reparation (HDR). För att uppnå den önskade inpressning, detta protokoll sysselsätter ribonukleoprotein (RNP)-baserat tillvägagångssätt där vildtyp Streptococcus pyogenes Cas9 protein, syntetisk 2-del guide RNA (gärna) och en givare mall plasmid levereras till cellerna via elektroporation. Förment redigerade celler som uttrycker de fluorescently märkta proteinerna berikas av fluorescens aktiverad cell sortering (FACS). Klonal rader genereras sedan och kan analyseras för exakt redigering utfall. Genom att införa fluorescerande etiketten på det genomiska locus av genen av intresse, kan den resulterande subcellulär lokalisering och dynamiken av proteinet fusion studeras under endogena tillsyn, en viktig förbättring jämfört med konventionella överuttryck system. Användningen av hiPSCs som modellsystem för genen taggning ger möjlighet att studera de märkta proteinerna i diploida, nontransformed celler. Eftersom hiPSCs kan differentieras till flera celltyper, ger detta tillvägagångssätt möjlighet att skapa och studera märkta proteiner i olika syngena cellulära sammanhang.
Användning av editering strategier, särskilt CRISPR/Cas9, att studera cellulära processer blir alltmer lättillgänglig och värdefulla1,2,3,4,5, 6 , 7. en av de många tillämpningarna av CRISPR/Cas9 är införandet (via homologi regisserad reparation (HDR)) av stora exogena sekvenser såsom GFP till specifika genomisk loci som sedan tjänar som reportrar för aktiviteten av en gen eller protein8 . Denna teknik kan användas att gå med en fluorescerande proteinsekvens till en endogen öppen läsning ram där den resulterande endogenously reglerade fusionsprotein kan användas för att visualisera subcellulär lokalisering och dynamiken i proteinet av intresse5 ,6,9,10,11. Medan endogent märkta proteiner erbjuder många fördelar jämfört med överuttryck system, är sätta in stora sekvenser i det mänskliga genomet en ineffektiv process som vanligtvis kräver en markering eller anrikning strategi att få en population av celler som kan vara enkelt studerade5,12.
Det här protokollet beskriver införandet av en DNA-sekvens som kodning en fluorescerande protein (FP) till en önskad genomisk locus. Protokollet omfattar design och leverans av givare mall plasmiden, och ribonukleoprotein (RNP) komplex (vildtyp S. pyogenes Cas9 protein i kombination med syntetiska CRISPR RNA (crRNA) och trans-aktivera crRNA (tracrRNA)). Beskrev också är berikning av förment redigerade celler via fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) och klonal cell linje genereringsprocessen. Hittills har denna metod använts för att generera hiPSC rader med antingen monoallelic eller (sällan) bi-alleliska grönt fluorescerande protein (GFP) Taggar märkning tjugofem proteiner som representerar stora cellulära strukturer. De resulterande redigerade cellerna från dessa ansträngningar har bekräftats har beräknade genetiska insättningspunkten, uttrycka ett korrekt lokalisera fusionsprotein och underhålla pluripotency och en stabil karyotyp12 (och opublicerade data). Denna metod har också använts för att generera flera andra singel och dubbel (två olika proteiner som taggats i samma cell) redigeras populationer av hiPSCs (opublicerade data).
Mänskliga iPSCs härrör från en frisk givare valdes för dessa editering insatser eftersom till skillnad från många konventionella cellinjer, de är diploida, karyotypiskt stabilt, icke-omvandlad och proliferativ. Dessa egenskaper ger en attraktiv modell för att studera grundläggande cellbiologi och sjukdom modellering. HiPSCs differentiering potential ger dessutom möjlighet att studera flera utvecklingsstadier parallellt över olika härstamningar och celltyper med syngena celler inklusive organoids, vävnader och ”sjukdom i en maträtt” modeller13 ,14,15. Medan detta protokoll utvecklades för hiPSCs (WTC linje), kan det vara informativ för utveckling av protokoll som använder andra däggdjursceller linjer.
Metoden presenteras här för generera endogenously reglerade fluorescerande protein fusioner i hiPSCs är en mångsidig och kraftfull metod för att generera gen redigeras cellinjer med applikationer alltifrån levande cell imaging till olika funktionella studier och ” i en maträtt ”sjukdomsmodeller med patientderiverade hiPSC linjerna13,14,15. Medan denna metod har använts för att införa stora FP taggar till N – eller C-terminus av endogena proteiner, skulle det potentiellt kunna användas att introducera andra taggar eller små genetiska förändringar till modell eller rätta sjukdomsframkallande mutationer22,23 . För mindre skär, storleken på homologi armen kan minskas, men den allmänna strategin för redigering presenteras i denna metod kan fortfarande tillkomma24,25. Medan användningen av hiPSCs är starkt uppmuntras för deras allra utility, med noggrann optimering, kan detta protokoll anpassas för att redigera genomen hos andra däggdjur cellinjer.
När identifiera en gen av intresse för FP taggning, avskrift överflöd uppskattar (från microarray eller RNA-Seq data) är en bra utgångspunkt för att bedöma huruvida en gen eller isoform av intresse uttrycks, även om avskrift nivåer inte alltid korrelerar med proteinnivåer. FACS-anrikning strategin beskrivs här fungerar bäst för gener som uttrycks åtminstone måttligt väl i celltyp av intresse. Denna strategi har också varit framgångsrik i att välja för fusioner som visar punktuell eller diskret lokalisering mönster såsom centrin, desmoplakin och paxillin där signal-bakgrund-förhållande är mycket låg12,19. Gener som uttrycks inte mycket eller uttrycks endast i derivat celltyper kan kräva ytterligare urval strategier.
Utgångspunkten för crRNA och givaren plasmid mallar används i mänskliga cellinjer bör vara mänsklig referens genomet (GRCh38). Eftersom genomen hos olika cellinjer kan variera inom samma art, och eftersom CRISPR/Cas9 är sekvens-specifik, är det extremt bra att identifiera cell linjespecifika varianter (enda nukleotid polymorfismer eller infogningar/borttagningar (indels)) som skiljer sig från referens genomet och införliva dessa i designen. Detta säkerställer att crRNAs kommer att vara kompatibel med värd genomet och att givaren mall plasmid homologi armarna kommer att behålla någon cellinje särskilda varianter. En föreslagen strategi är att införliva homozygot varianter i crRNAs och givaren mall plasmid homologi armar under designprocessen. Det är valfritt att införliva heterozygot varianter. De specifika reagenserna används för stora inpressning experiment och andra viktiga överväganden för detta protokoll diskuteras nedan.
Cas9 Protein
Den främsta fördelen med att använda Cas9 protein är att införa Cas9 och gärna som en komplex RNP har visat sig resultera i en begränsad varaktighet av nuclease aktivitet jämfört med plasmid-baserat tillvägagångssätt där uttryck av Cas9 och gärna kan fortsätta i dagar och leda till större på – och off-target aktivitet26,27. Ytterligare en fördel med att använda Cas9 protein är att det är lättillgängliga att klyva en gång inne i cellerna. Detta kontrasterar mot mer konventionella metoder för att använda Cas9 mRNA eller Cas9/gärna plasmiden som kräver transkription, översättning och protein bearbetning26,28. Vildtyp S. pyogenes Cas9 protein är nu tillgänglig från många kommersiella källor.
Guide RNA
Det finns många allmänt tillgängliga verktyg för att hitta crRNA mål nära önskad FP insticksstället som har noll eller några förutspådda off-mål i den värd genom29,30,31,32. Effektivitetsvinster i HDR och precisionen av HDR resultatet varierar kraftigt mellan crRNA mål används på en viss locus12. Av denna anledning, testa flera crRNAs (2-4 och helst inom 50 bp av önskad insticksstället) per locus rekommenderas eftersom det kan öka sannolikheten för ett framgångsrikt redigering experiment. Aktuella möjligheter för att leverera gärna inkludera syntetisk 2-del crRNA och tracrRNA, syntetiska inre gRNAs (sgRNAs), in vitro- transkriberat sgRNAs eller leverera en plasmid till celler som uttrycker sgRNA från U6 främjare. Detta protokoll har inte optimerats för höga klyvning aktivitet. Omodifierade 2-del crRNA och tracrRNA (se Tabell för material) användes med målet att generera mono-alleliska FP-taggade cellinjer samtidigt som de orsakar den minst potentiell störning till cellerna.
Givare mall Plasmid
Eftersom några av homologi arm sekvens förutsatt i givaren mall plasmid kommer att införlivas i den värd arvsmassan under händelsen HDR, bör punktmutationer till crRNA erkännande platser införas för att förhindra ytterligare klyvning av Cas9 efter HDR. Ofta är den enklaste störande ändringen att mutera PAM sekvensen. Eftersom vissa icke-kanoniska PAM sekvenser kan fortfarande kännas igen av vildtyp S. pyogenes Cas9, är det bäst att undvika att använda NGG, NAG eller NGA33. När muterar homologi armen, undvika icke-synonymt mutationer och införandet av sällsynta kodon. Om en synonymt förändring till PAM sekvensen inte är möjligt, överväga att göra tre synonymt punktmutationer i regionen utsäde (10 bp proximalt PAM) av crRNA bindningsstället. Extrem försiktighet iakttas när du gör dessa ändringar i regionen 5ʹ oöversatta (UTR) eftersom dessa regioner kan innehålla viktiga reglerande sekvenser. Consulting en genetiskt bevarande databas som UCSC genomet webbläsarens komparativ genomik spår kan ge vägledning i dessa fall som ändringar av icke-bevarad baser kan tolereras bättre än ändringar mycket baser17. Ibland är enbart införande av sekvensen FP tillräckligt för att störa crRNA bindningsstället (som i figur 1). den nyligen tillagda sekvensen bör dock kontrolleras för varaktigheten av crRNA bindande och PAM sekvenser.
Aminosyra linkers mellan FP och infödda protein rekommenderas att bevara funktionen av de fusion protein34. En aminosyra linker kan ofta väljas för sin särskild avgift eller storlek. Om en cDNA fusion med en design som liknar den riktade endogena undersökts fusionsprotein väl, att samma linker sekvens kan användas för CRISPR/Cas9 inpressning experiment12,19. Om sådan information är tillgänglig, en kort länkare som GTSGGS har också varit framgångsrikt använt12. Andra studier har visat framgång med en generisk små 3-amino acid linker sekvens för en mängd mål35.
Transfection och FACS berikning
Många kommersiellt tillgängliga transfection reagenser är formulerade för leverans av vissa typer av molekyler till celler, medan ett elektroporation system kan användas för att leverera reagenser med ett brett utbud av storlek, kostnad och sammansättning. Förutom att vara en vanlig transfection metod för hård-till-transfect celler som hiPSCs, bär elektroporation också fördelen med att leverera alla tre komponenter för CRISPR/Cas9-medierad FP inpressning som beskrivs för denna metod. Elektroporation konstaterades för att producera de bästa resultat jämfört med andra kommersiellt tillgängliga reagens när utveckla denna metod (inga data anges), och har också använts av andra för RNP leverans26,28,36 .
När du använder detta protokoll för redigering hiPSCs, bör särskild försiktighet iakttas att säkerställa skonsam hantering av cellerna före och efter genen redigeringsprocessen för optimal cellöverlevnad och minimal spontana differentiering. I synnerhet de FACS anrikningsmetoder bör anpassas för sortering av stamceller med hjälp av största munstycket möjligt (130 µm), ett lågt flöde (≤24 µL/min), konserveringsmedel slida vätska (till exempel koksaltlösning, se Tabell för material), och låg prov Tryck (10 psi). I stället för enstaka cell sortering, vilket resulterar i suboptimala livskraft i stamceller, de FACS-berikade hiPSCs sorteras i bulk och expanderat som en population att optimera cellernas livskraft och stamceller integritet. Dock kan det vara lämpligt för mindre känsliga celltyper enda cell sortering. För att främja cellöverlevnad, celler returneras till kultur inte längre än en timme efter skörd för FACS anrikningen och förvarats i rumstemperatur under hela sortering. För vissa celltyper, kan cellöverlevnad också förstärkas av ruvande celler på is (4° C) under hela sortering.
Bulk utbyggnaden av FP-positiva celler ger en möjlighet att utvärdera befolkningen av bildanalys för fusion protein lokalisering före klonal radgenerering. Medan den resulterande berikad befolkningen av celler kan räcka för vissa studier, visar dessa populationer ofta FP signal av varierande intensitet. Isolerade klonal raderna har enhetliga signal (figur 3), vilket gör dem lämpligare för funktionella experiment12.
Klonal Cell linje Generation
Under hela redigering och klonal linje generation är det viktigt att övervaka cellmorfologi. hiPSC kolonier odlas i feeder-fria villkor bör uppvisa jämna kanter och en jämn, väl packad center12,18,19. Differentierade celler observeras i mindre än 5% av kulturen. När plocka enskilda kolonier, välja dem som uppvisar bra morfologi. Under den plattan med 96 brunnar passaging händelser, kontrollera kloner för morfologi och avbryta dem som har övervuxna eftersom detta kan leda till differentiering eller vara ett tecken på genetisk instabilitet.
Generation av klonala cellinjer möjliggör genetisk bekräftelse av exakt redigering, vilket är viktigt eftersom Cas9-inducerad double strand breaks i genomet ofta repareras imprecisely trots införlivandet av etiketten på det önska locus. Tidigare beskrivna PCR-baserade analyser visade att kumulativt över tio unika genomisk loci många (45%) av FP-uttryckande klonerna drabbades av givare plasmid ryggraden integration på det rikta locus eller (sällan) slumpmässigt i genomet12. Dessutom, 23% av GFP-positiva kloner (n = 177) över tio unika loci befanns harbor mutationer på eller nära den förvänta crRNA skärande platsen i den otaggade allelen, troligen på grund av NHEJ12. Denna genetiska analyser av många klonal linjer (~ 100 kloner/redigera) underströk vikten av genetisk validering som inte är möjligt i en cell befolkningen eftersom FP-uttryck och förväntade fusion protein lokalisering ensam inte garanterar exakt redigering12 . Dessutom kan inte dessa PCR-baserade analyser utföras på en berikad population av celler med säkerhet, motiverar behovet av klonala linje generation innan meningsfull analys kan slutföras. Genetiska bekräftelse av taggen infogade FP och verifiering av genetisk integritet den oredigerade allelen (i en mono-alleliska redigerade klon) är både nödvändigt för att säkerställa exakt redigering på den riktade locus bortom etikettuttrycket.
Bi-alleliska redigeringar med låg hastighet och brist på off-target mutationer (som analyseras av Sanger och exome sekvensering) har observerats hittills använder denna metod (opublicerade data)12. Detta överensstämmer med tidigare studier som beskriver användningen av kortvarig RNP för CRISPR/Cas9 experiment26,27. Avsaknaden av klonala cellinjer med bi-alleliska redigeringar kan också vara locus specifika eller på grund av cellen oförmåga att tolerera två taggade kopior av en viktig protein som föreslagits från tidigare publicerade experiment där förmodade bi-alleliska redigerade celler var observerats för en locus (LMNB1), men inte en annan (TUBA1B)12. BI-alleliska fullt validerade klonal cellinjer har genererats med hjälp av denna metod att tag ST6 beta-galactoside alpha-2, 6-sialyltransferase 1 (ST6GAL1) och RAB5A medlem RAS onkogen familj (RAB5A) med mEGFP19.
Bortom bekräftar precision redigera i genomet, det finns en mängd kvalitetskontroll analyser som kan användas för att ytterligare karakterisera klonal linjen och identifiera kloner som uppfyller alla stamceller, genomisk, och cellen biologiska kriterier för att användas i framtida studier . Cell biologiska och funktionella analyser kan användas för att bekräfta lämpliga uttryck, lokalisering och funktion av fusion protein12. Jämförelsen till oredigerad Föräldrakontroll hjälper utvärdera påverkan av redigeringen på lokalisering, dynamik och funktion. Andra analyser avgöra såsom Tillväxtanalys och tester för genomisk stabilitet kan också hjälpa om märkta proteinet är störande till cellen. När du använder hiPSC i detta protokoll, kan utvärdering av pluripotency markörer och differentiering potential vara avgörande för att fastställa en klon som är värdefull för nedströms studier12. Eftersom extended kultur av hiPSC har visat sig leda till genetisk instabilitet, övervakning tillväxttakten och karyotyp klonal cellinjer är också viktiga12,37. Emellertid avsedd slutliga användning av redigerade cellerna kommer i slutändan bestämma nivå och bredd av kvalitetskontroll analys och varierar beroende på programmet.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Daphne Dambournet för många insiktsfulla diskussioner och rådgivning på genen redigering, Thao göra för illustration, Angelique Nelson för kritisk läsning av manuskriptet och Andrew Tucker för att skapa raden mEGFP-taggade Lamin B1 cellen. Vi vill uppmärksamma de stamceller och Gene Editing och Assay utvecklingsteam vid Allen Institute för Cell vetenskap för deras bidrag till genen redigering och kvalitetskontroll. WTC raden som vi använde för att skapa vår gen-redigeras cellinje tillhandahölls av Bruce R. Conklin Laboratory vid Gladstone institut och UCSF. Vi tackar Allen Institute for Cell vetenskap grundare, Paul G. Allen, för hans vision, uppmuntran och stöd.
Geneious R9 | Biomatters, or similar | bioinformatics software for in silico donor plasmid design | |
TE Buffer pH 8.0 | IDT, or similar | 11-01-02-05 | |
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator, or similar | ThermoFisher Scientific, or similar | 51030408 | |
Pipettes (1000 µL, 200 µL, 20 µL, 10 µL, 2 µL) | Rainin, or similar | ||
Pipette tips (1000 µL, 200 µL, 20 µL) | Rainin, or similar | ||
Multi-channel Pipette (200 µL) | Rainin, or similar | ||
Serological pipetes (25 mL, 10 mL, 5 mL) | Costar, or similar | ||
BRAND 8-Channel Manifold for Quiksip, Autoclavable | Millipore Sigma, or similar | BR704526-1EA | use with non-filtered pipet tips, such as Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10, below |
Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10 | Thermo Fisher, or similar | 3501-05 | |
XP2 Pipette Controller | Drummond, or similar | 4-000-501 | |
Disposable Pasteur Pipets | VWR, or similar | 53300-567 | |
Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | CELLGARD, or similar | NU-481 | |
Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | lot tested before use with hiPSC |
DMEM/F12 (-phenol red) | Gibco | 11039-021 | cold, for diluting Matrigel 1:30 |
mTeSR1 Complete Media | StemCell Technologies | 85850 | recommended growth media for WTC hiPSC line |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
WTC hiPSC line | Coriell | GM25256 | the hiPSC line used in this protocol is available through Coriell |
Tissue culture dish 100 mm | Falcon | 353003 | |
6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657160 | |
StemPro Accutase | Gibco | A11105-01 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
15 mL polystyrene conical | Sarstedt | 62.554.100 | |
Y-27632 (ROCK Inhibitor) | StemCell Technologies | 72308 | |
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic crRNA, unmodified (custom sequence) | Dharmacon | Custom0247 | |
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA | Dharmacon | U-002005-05 | |
Recombinant wild-type Streptococcus pyogenes Cas9-NLS purified protein, 40 µM | University of California-Berkeley QB3 Macrolab | ||
Custom donor plasmid (PriorityGENE) | Genewiz | donor insert design was synthesized and cloned into pUC57 backbone by Genewiz | |
DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
NucleoBond Xtra Maxi EF | Clontech | 740424.50 | |
Neon Transfetion System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | |
Neon Transfection System, 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | |
5 mL Polystyrene Round-bottom Tube with Cell Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
15 mL High Clarity Polyproylene Conical Tube | Falcon | 352196 | |
FACSAriaIII Fusion | BD Biosciences | 656700 | |
FACSDiva software | BD Biosciences | ||
FlowJo version 10.2 | TreeStar | ||
NERL Blood Bank Saline | ThermoFisher Scientific | 8504 | used as preservative-free FACS Buffer |
Olympus SZX7 Stereo Microscope, or similar | Olympus, or similar | ||
Tissue culture plate, 96-well | Falcon | 353072 | |
96 well Cell Culture Plate, V-Bottom | CELLSTAR | 351180 | |
CryoStor CS10 | Sigma | C2874-100ML | used as cryopreservation buffer for cells in 96-well plate format |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
24 well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 662160 |