Beskrevet her er en protokol til tagging endogent udtrykte proteiner med fluorescerende tags i menneskelige inducerede pluripotente stamceller ved hjælp af CRISPR/Cas9. Derfor redigerede celler er beriget af fluorescens aktiveret celle sortering og klonede cellelinjer genereres.
En protokol, der præsenteres for at skabe menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs), der udtrykker endogene proteiner smeltet for at N – eller C-terminale fluorescerende tags i rammen. De prokaryote CRISPR/Cas9 system (grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentager/CRISPR-associerede 9) kan anvendes til at indføre store eksogene sekvenser i genomisk loci via homologi instrueret reparation (HDR). For at opnå den ønskede knock-i, denne protokol beskæftiger ribonucleoprotein (RNP)-baseret tilgang, hvor vildtype Streptococcus pyogenes Cas9 protein, syntetisk 2-del guide RNA (gRNA) og en donor skabelon plasmid leveres til celler via elektroporation. Derfor redigerede celler, der udtrykker de fluorescently tagged proteiner er beriget af fluorescens aktiveret celle sortering (FACS). Klonede linjer oprettes derefter og kan analyseres for præcis redigering resultater. Ved at indføre de fluorescerende tag på den genomisk locus af gen af interesse, kan den resulterende subcellulært lokalisering og dynamikken i fusion protein studeres under endogene myndighedskontrol, en afgørende forbedring i forhold til konventionelle overekspression systemer. Brug af hiPSCs som et modelsystem for gen kodning giver mulighed for at studere de tagged proteiner i diploide, nontransformed celler. Da hiPSCs kan opdeles i flere celletyper, giver denne tilgang mulighed for at skabe og studere tagged proteiner i en lang række isogene cellulære sammenhænge.
Genom-redigering strategier, især CRISPR/Cas9, at studere cellulære processer bliver mere og mere tilgængelige og værdifulde1,2,3,4,5, 6 , 7. en af de mange anvendelser af CRISPR/Cas9 er indførelsen (via homologi instrueret reparation (HDR)) af store eksogene sekvenser som normal god landbrugspraksis i specifikke genomisk loci, der derefter fungere som journalister for aktiviteten af et gen eller protein produkt8 . Denne teknik kan bruges til at tilslutte sig en fluorescerende proteiner sekvens til en endogen åben læsning ramme hvor den resulterende endogent regulerede fusion protein kan bruges til at visualisere subcellulært lokalisering og dynamikken i protein af interesse5 ,6,9,10,11. Mens endogent tagged proteiner giver mange fordele i forhold til overekspression systemer, er indsætte store sekvenser i det menneskelige genom en ineffektiv processen typisk kræver en markering eller berigelse strategi til at opnå en befolkning af celler, der kan være let studerede5,12.
Denne protokol beskriver indsættelsen af en DNA-sekvens kodning en fluorescerende proteiner (FP) i en ønskede genomisk locus. Protokollen omfatter design og levering af donor skabelon plasmid, og ribonucleoprotein (RNP) kompleks (vildtype S. pyogenes Cas9 protein kombineret med syntetisk CRISPR RNA (crRNA) og trans-aktivering crRNA (tracrRNA)). Også beskrevet er berigelsen af derfor redigerede celler via fluorescens aktiveret celle sortering (FACS) og klonede celle linje generation proces. Til dato, har denne metode været brugt til at generere hiPSC linjer med enten monoallelic eller (sjældent) bi-allel grøn fluorescerende proteiner (NGL) tags mærkning femogtyve proteiner repræsenterer store cellulære strukturer. De resulterende redigerede celler fra disse bestræbelser er blevet bekræftet at har den forventede genetiske indsættelse, udtrykke en korrekt localizing fusion protein og vedligeholde pluripotency og en stabil karyotype12 (og ikke-offentliggjorte data). Denne metode er også blevet brugt til at generere flere andre single og dual (to forskellige proteiner markeret i den samme celle) redigeret populationer af hiPSCs (ikke-offentliggjorte data).
Menneskelige iPSCs stammer fra raske donorer blev valgt for indsatsen genom-redigering, fordi i modsætning til mange konventionelle cellelinjer, de er diploide karyotypically, ikke-transformeret, og stabile proliferativ. Disse egenskaber giver en attraktiv model til at studere grundlæggende cellebiologi og sygdom modellering. Derudover giver differentiering potentialet i hiPSCs mulighed for at undersøge flere udviklingsstadier parallelt på tværs af forskellige slægter og celletyper ved hjælp af isogene celler, herunder organoids, væv og “i et fad” sygdomsmodeller13 ,14,15. Denne protokol blev udviklet for hiPSCs (WTC linje), kan det være informativ for udviklingen af protokoller ved hjælp af andre pattedyr cellelinjer.
Metoden fremlægges her til generering af endogent reguleret fluorescerende protein fusioner i hiPSCs er en alsidig og kraftfuld tilgang til at generere gen redigeret cellelinjer med applikationer lige fra levende celle imaging til forskellige funktionelle studier og ” i et fad”sygdomsmodeller ved hjælp af patient-afledte hiPSC linjer13,14,15. Mens denne metode har været brugt til at indføre store FP tags til N – eller C-terminus af endogene proteiner, kunne det potentielt bruges til at indføre andre tags eller små genetiske ændringer til model eller korrekte sygdomsforårsagende mutationer22,23 . Til mindre skær, størrelsen af homologi arm kan reduceres, men den generelle tilgang til redigering, præsenteret i denne metode kan stadig gælde24,25. Mens brugen af hiPSCs er kraftigt opfordret til deres store utility, med omhyggelig optimering, kan denne protokol tilpasses for at redigere genomer af andre pattedyr cellelinjer.
Når du identificerer et gen af interesse for FP tagging, udskrift overflod skøn (fra microarray eller RNA-Seq data) er et godt udgangspunkt for vurderingen af, om et gen eller isoform af interesse er udtrykt, selv om afskriften niveauer ikke altid korrelerer med protein niveauer. FACS-berigelse strategi beskrevet her vil fungere bedst for gener, der er mindst moderat godt udtrykt i celletype af interesse. Denne strategi har også været en succes i at vælge for fusioner, der viser punktformet og/eller diskrete lokalisering mønstre som centrin, desmoplakin og paxillin hvor signal-baggrund-forholdet er meget lav12,19. Gener, der udtrykkes ikke meget eller er kun udtrykt i afledte celletyper kan kræve yderligere udvalg strategier.
Udgangspunktet for crRNA og donor skabelon plasmid design anvendes i human cellelinjer bør være menneskelige reference genom (GRCh38). Fordi genomer af forskellige cellelinjer kan variere inden for samme art, og fordi CRISPR/Cas9 sekvens-specifikke, det er ekstremt nyttigt at identificere celle linjespecifikke varianter (single nucleotide polymorphisms eller indrykninger/sletninger (indels)) der adskiller sig fra reference genom og indarbejde disse i design. Dette sikrer, at crRNAs vil være forenelig med værten genom og at donor skabelon plasmid homologi våben vil bevare cellelinie specifikke varianter. En foreslåede strategi er at indarbejde homozygot varianter i crRNAs og donor skabelon plasmid homologi arme under designprocessen. Indarbejde heterozygous varianter er valgfri. De specifikke reagenser anvendes til store knock-i eksperimenter og andre centrale overvejelser i forbindelse med denne protokol er diskuteret nedenfor.
Cas9 Protein
Den primære fordel ved hjælp af Cas9 protein er der introducerer Cas9 og gRNA som en kompleks RNP har vist sig at resultere i en begrænset varighed af nukleasen aktivitet sammenlignet med plasmid-baserede tilgange hvor udtryk for Cas9 og gRNA kan fortsætte i dage og fører til større om – og off-målet aktivitet26,27. En yderligere fordel ved at anvende Cas9 protein er, at det er let tilgængelige for kløve en gang inde i cellerne. Dette står i kontrast til mere konventionelle metoder for at bruge Cas9 mRNA eller Cas9/gRNA plasmid, der kræver transskription, translation og protein behandling26,28. Vildtype S. pyogenes Cas9 protein er nu tilgængelig fra mange kommercielle kilder.
Guide RNA
Der er mange offentligt tilgængelige værktøjer til at finde crRNA mål i nærheden af den ønskede FP indsættelsesstedet, som har nul eller par forudsagte off-mål i vært genom29,30,31,32. Effektivitetsgevinster i HDR og præcisionen af HDR resultatet varierer meget mellem crRNA mål anvendes på en given locus12. Af denne grund, test flere crRNAs (2-4 og helst inden for 50 bp af ønskede indsættelsesstedet) pr. locus er anbefales, da dette kan øge sandsynligheden for en vellykket redigering eksperiment. Nuværende muligheder for at levere gRNA omfatte syntetisk 2-del crRNA og tracrRNA, syntetisk enkelt gRNAs (sgRNAs), in vitro- transskriberet sgRNAs, eller levere en plasmid til celler, der udtrykker sgRNA fra en U6 promotor. Denne protokol blev ikke optimeret til høj kavalergang aktivitet. Uforandret 2-del crRNA og tracrRNA (Se Tabel af materialer) blev brugt med formålet at generere mono-allel FP-tagged cellelinjer samtidig forårsager den mindst mulige undertrykkelse af netbårne til cellerne.
Donor skabelon Plasmid
Fordi nogle af homologi arm sekvens forudsat i donor skabelon plasmid vil blive indarbejdet i vært genom under hændelsen HDR, bør punktmutationer til crRNA anerkendelse websteder indføres for at forhindre yderligere spaltning af Cas9 efter HDR. Ofte er den enkleste forstyrrende ændring at mutere PAM sekvens. Fordi nogle ikke-kanoniske PAM sekvenser kan stadig genkendes af vildtype S. pyogenes Cas9, er det bedst at undgå at bruge NGG, NAG eller NGA33. Når muterer homologi arm, undgå ikke-synonym mutationer og indførelsen af sjældne kodon. Hvis en synonym ændring til PAM sekvens ikke er muligt, overveje at gøre tre synonymt punktmutationer i regionen frø (10 bp proksimalt for PAM) af crRNA bindingssted. Største omhu bør tages, når du foretager disse ændringer i 5ʹ utranslaterede region (UTR), da disse regioner kan indeholde vigtige lovgivningsmæssige sekvenser. Høring en genetisk bevarelse database som UCSC genom browserens Komparativ genomforskning spor kan vejlede i disse tilfælde, da ændringer ikke bevaret baser kan være bedre tolereret end ændringer meget bevaret baser17. Undertiden er blot indsættelse af FP sekvens nok til at forstyrre crRNA bindingssted (som i figur 1); men den nyligt tilføjede sekvens skal kontrolleres for vedvarende crRNA bindende og PAM sekvenser.
Aminosyre linkers mellem rammeprogrammet og de indfødte protein anbefales at bevare funktionen af fusion protein34. Ofte kan en aminosyre linker vælges for dens bestemt gebyr eller størrelse. Hvis en cDNA fusion med et design ligner den målrettede endogene er fusion protein blevet godt undersøgt, at samme linker sekvens kan anvendes til CRISPR/Cas9 knock-i eksperimentet12,19. Hvis sådanne oplysninger ikke er tilgængelig, en kort linker som GTSGGS har også været anvendt med succes12. Andre studier har påvist succes med en generisk små 3-amino syre linker sekvens for en række mål35.
Transfektion og FACS berigelse
Mange kommercielt tilgængelige Transfektion reagenser er formuleret for levering af visse typer af molekyler i celler, der henviser til, at en elektroporation system kan bruges til at levere reagenser med en bred vifte af størrelse, ladning og sammensætning. Ud over at være en fælles Transfektion metode for svært at transfect celler som hiPSCs, bærer elektroporation også fordel af levere alle tre komponenter til CRISPR/Cas9-medieret FP knock-i som beskrevet i denne metode. Elektroporation blev fundet til at producere de bedste resultater i forhold til andre kommercielt tilgængelige reagenser når udvikle denne metode (data ikke vist), og er også blevet brugt af andre for RNP levering26,28,36 .
Når du bruger denne protokol til at redigere hiPSCs, tages særlige pleje til at sikre skånsom håndtering af celler før og efter gen redigeringsprocessen for optimal celle overlevelse og minimal spontan differentiering. Især FACS berigelse metoder bør tilpasses for at sortere stamceller ved hjælp af den største dyse muligt (130 µm), en lav strømningshastighed (≤24 µL/min), konserveringsmiddel-fri kappe væske (f.eks. saltvand, se Tabel af materialer), og lave prøve pres (10 psi). I stedet for enkelt celle sortering, hvilket resulterer i suboptimal levedygtighed i stamceller, er de FACS-beriget hiPSCs sorteret i bulk og udvidet som en befolkning til at optimere celle levedygtighed og stamceller integritet. Dog kan enkelt celle sortering være relevante for mindre følsomme celletyper. For at fremme celle overlevelse, er celler vendt tilbage til kultur ikke længere end en time efter høst for FACS berigelse og opbevares ved stuetemperatur under hele sorteringen. For nogle celletyper, kan celle overlevelse også forbedres ved kvægbruget celler på is (4° C) under hele sorteringen.
Bulk udvidelse af FP-positive celler giver mulighed for at evaluere befolkningen af imaging analyse for fusion protein lokalisering inden generering klonede linjer. Mens den resulterende berigede befolkning af celler kan være tilstrækkeligt for nogle undersøgelser, vises disse populationer ofte FP signal af varierende intensitet. De isolerede klonede linjer har ensartet signal (figur 3), hvilket gør dem mere relevante for funktionelle eksperimenter12.
Klonede celle linje Generation
I hele den redigering og klonede linje generation proces er det vigtigt at overvåge celle morfologi. hiPSC kolonier vokset i feeder-fri betingelser skal udstille glatte kanter og en selv, godt pakket center12,18,19. Differentierede celler bør observeres i mindre end 5% af kulturen. Når picking enkelte kolonier, Vælg de at udstille gode morfologi. Under 96-brønd pladen passaging begivenheder, kontrollere kloner til morfologi og afbryde dem, der har tilgroet, da dette kan føre til differentiering eller være en indikation af genetiske ustabilitet.
Generation af klonede cellelinjer giver mulighed for genetisk bekræftelse af præcise redigering, hvilket er vigtigt, fordi Cas9-induceret dobbeltstrenget pauser i genomet er ofte repareret upræcist trods indarbejdelse af tag på det ønskede sted. Tidligere beskrevet PCR-baserede analyser viste, at kumulativt over ti unikke genomisk loci mange (45%) af FP-udtrykker kloner lidt fra donor plasmid rygraden integration i den målrettede locus eller (sjældent) tilfældigt i genom12. Derudover 23% af normal god landbrugspraksis-positive kloner (n = 177) på tværs af ti unikke loci fandtes for at havnen mutationer på eller i nærheden af webstedet forventede crRNA opskæring i de ukodede allel, sandsynligvis på grund af NHEJ12. Denne genetiske analyser af mange klonede linjer (~ 100 kloner/Rediger) understregede betydningen af genetiske validering, det ikke er muligt i en celle population fordi FP-udtryk og forventede fusion protein lokalisering alene ikke garanterer præcis redigering12 . Derudover kan ikke disse PCR-baserede analyser udføres på en beriget befolkning af celler med sikkerhed, berettiger behovet for klonede linje generation før meningsfuld analyse kan fuldføres. Genetisk bekræftelse af de indsatte FP tag og verifikation af den genetiske integritet af den uredigerede allel (i en mono-allel redigerede klon) er begge nødvendige for at sikre præcis redigering på den målrettede locus ud over mærkatudtrykket.
En lav grad af bi-allel redigeringer og mangel på off-target mutationer (som analyserede af Sanger og exome-sekventering) er blevet observeret til dato ved hjælp af denne metode (ikke-offentliggjorte data)12. Dette er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser beskriver brugen af kort-varigt RNP til CRISPR/Cas9 eksperimenter26,27. Manglen på klonede cellelinjer med bi-allel redigeringer kan også være locus specifikke eller på grund af cellen manglende evne til at tåle to markeret kopier af en vigtig protein som foreslået fra tidligere udgivne eksperimenter hvor formodede bi-allel redigerede celler blev observeret for et locus (LMNB1), men ikke en anden (TUBA1B)12. Bi-allel fuldt valideret klonede cellelinjer der er genereret ved hjælp af denne metode til at tag ST6 beta-galactoside alpha-2, 6-sialyltransferase 1 (ST6GAL1), og RAB5A medlem RAS onkogen familie (RAB5A) med mEGFP19.
Ud over bekræfter præcision af edit på genomet, der er en bred vifte af kvalitet kontrol-assays, der kan bruges til yderligere at karakterisere den klonede linje og identificere kloner, der opfylder alle stamceller, genomisk, og celle biologiske kriterier til brug i fremtidige undersøgelser . Celle biologisk og funktionel assays kan bruges til at bekræfte passende udtryk, lokalisering og funktion af fusion protein12. Sammenligningen til uredigeret Forældrekontrol vil hjælpe vurdere redigeringsprocessen indflydelse på lokalisering, dynamik og funktion. Andre assays afgøre såsom vækst analyse og test for genomisk stabilitet kan også hjælpe, om den mærkede protein er forstyrrende til cellen. Når du bruger hiPSC i denne protokol, kan evaluering af pluripotency markører og differentiering potentiale være afgørende ved fastsættelsen af en klon, der er værdifulde for nedstrøms undersøgelser12. Fordi udvidet kultur af hiPSC har vist sig at føre til genetiske ustabilitet, overvågning af vækstrate og karyotype af klonede cellelinjer er også vigtige12,37. Dog beregnet endelige brugen af de redigerede celler vil i sidste ende bestemme niveau og bredde af kvalitetskontrol analyse og vil variere baseret på programmet.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Daphne Dambournet for mange indsigtsfulde drøftelser og rådgivning om gen redigering, Thao for illustration, Angelique Nelson for kritisk læsning af håndskriftet, og Andrew Tucker til at generere linjen mEGFP-tagged Lamin B1 celle. Vi ønsker at anerkende de stamceller og genet Editing og Assay udviklingsteams på Allen Institute for celle videnskab for deres bidrag til gen redigering og kvalitetskontrol. Linjen WTC, som vi brugte til at oprette vores gen-redigeret cellelinie blev leveret af Bruce R. Conklin Laboratory på Gladstone institutter og UCSF. Vi takker Allen Institut for celle videnskab grundlægger, Paul G. Allen, for hans vision, opmuntring, og støtte.
Geneious R9 | Biomatters, or similar | bioinformatics software for in silico donor plasmid design | |
TE Buffer pH 8.0 | IDT, or similar | 11-01-02-05 | |
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator, or similar | ThermoFisher Scientific, or similar | 51030408 | |
Pipettes (1000 µL, 200 µL, 20 µL, 10 µL, 2 µL) | Rainin, or similar | ||
Pipette tips (1000 µL, 200 µL, 20 µL) | Rainin, or similar | ||
Multi-channel Pipette (200 µL) | Rainin, or similar | ||
Serological pipetes (25 mL, 10 mL, 5 mL) | Costar, or similar | ||
BRAND 8-Channel Manifold for Quiksip, Autoclavable | Millipore Sigma, or similar | BR704526-1EA | use with non-filtered pipet tips, such as Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10, below |
Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10 | Thermo Fisher, or similar | 3501-05 | |
XP2 Pipette Controller | Drummond, or similar | 4-000-501 | |
Disposable Pasteur Pipets | VWR, or similar | 53300-567 | |
Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | CELLGARD, or similar | NU-481 | |
Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | lot tested before use with hiPSC |
DMEM/F12 (-phenol red) | Gibco | 11039-021 | cold, for diluting Matrigel 1:30 |
mTeSR1 Complete Media | StemCell Technologies | 85850 | recommended growth media for WTC hiPSC line |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
WTC hiPSC line | Coriell | GM25256 | the hiPSC line used in this protocol is available through Coriell |
Tissue culture dish 100 mm | Falcon | 353003 | |
6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657160 | |
StemPro Accutase | Gibco | A11105-01 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
15 mL polystyrene conical | Sarstedt | 62.554.100 | |
Y-27632 (ROCK Inhibitor) | StemCell Technologies | 72308 | |
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic crRNA, unmodified (custom sequence) | Dharmacon | Custom0247 | |
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA | Dharmacon | U-002005-05 | |
Recombinant wild-type Streptococcus pyogenes Cas9-NLS purified protein, 40 µM | University of California-Berkeley QB3 Macrolab | ||
Custom donor plasmid (PriorityGENE) | Genewiz | donor insert design was synthesized and cloned into pUC57 backbone by Genewiz | |
DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
NucleoBond Xtra Maxi EF | Clontech | 740424.50 | |
Neon Transfetion System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | |
Neon Transfection System, 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | |
5 mL Polystyrene Round-bottom Tube with Cell Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
15 mL High Clarity Polyproylene Conical Tube | Falcon | 352196 | |
FACSAriaIII Fusion | BD Biosciences | 656700 | |
FACSDiva software | BD Biosciences | ||
FlowJo version 10.2 | TreeStar | ||
NERL Blood Bank Saline | ThermoFisher Scientific | 8504 | used as preservative-free FACS Buffer |
Olympus SZX7 Stereo Microscope, or similar | Olympus, or similar | ||
Tissue culture plate, 96-well | Falcon | 353072 | |
96 well Cell Culture Plate, V-Bottom | CELLSTAR | 351180 | |
CryoStor CS10 | Sigma | C2874-100ML | used as cryopreservation buffer for cells in 96-well plate format |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
24 well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 662160 |