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Genetics

人間でタグ内因性のタンパク質誘導多能性幹細胞 CRISPR/Cas9 を使用して

doi: 10.3791/58130 Published: August 25, 2018

Summary

タグ内因のプロトコル CRISPR/Cas9 を用いたひと誘導多能性幹細胞の蛍光札が付いている蛋白質の表現は、ここで説明。推定編集されたセル、蛍光活性化細胞選別濃縮し、クローン細胞を生成します。

Abstract

エクスプレス内因性タンパク質融合フレーム N 末端または C 末端蛍光タグひと誘導多能性幹細胞 (hiPSCs) を生成するためのプロトコルが表示されます。原核生物の CRISPR/Cas9 システム (クラスター化された定期的に空間短回文 CRISPR/繰り返し関連付けられている 9) は、大規模な外因性シーケンス相同監督修理 (HDR) でゲノムの遺伝子座に導入するに使えます。目的のノックアウトのために、このプロトコルはリボ核タンパク質 (RNP) を採用しています-ベースのアプローチを細胞への野生型化膿連鎖球菌Cas9 タンパク質、合成 2 一部ガイド RNA (gRNA) やドナー テンプレート プラスミドの配信先エレクトロポレーション。蛍光付けられた蛋白質を表現する推定編集されたセルは、蛍光性によって作動セル (FACS) の並べ替えで濃縮されています。系統が生成され、精密な編集の結果を分析することができます。興味の遺伝子の genomic 位置に蛍光タグを導入し、結果内局と融合タンパク質のダイナミクスを内因性規制、従来の過剰発現の重要な改善点に師事することができます。システム。遺伝子のタグ付けのためのモデル システムとして hiPSCs の使用は、二倍体、トランスのセルに付けられた蛋白質を調査する機会を提供します。HiPSCs は、複数の細胞のタイプに区別できます、のでこのアプローチを作成し、さまざまな同質細胞コンテキストの付けられた蛋白質を研究する機会を提供します。

Introduction

ゲノム編集戦略、細胞プロセスを研究に CRISPR/Cas9 特にの使用になってますますアクセスし貴重な1,2,3,4,5,6,7. CRISPR/Cas9 の多くのアプリケーションの一つは、遺伝子やタンパク質製品8 の活動のためのレポーターとして特定のゲノム遺伝子座に GFP など大規模な外因性シーケンスの (監督ホモロジー修理 (HDR)) で導入.この手法を使用して、内局と5 興味の蛋白質のダイナミクスを可視化する結果の内生的規制の融合蛋白質を使用できます。、内因性の開いたリーディング ・ フレームに蛍光タンパク質シーケンスに参加できます。 ,6,9,10,11。タグ内因蛋白質過剰発現システムに比べて多くの利点を提供して、人間のゲノムの大規模なシーケンスの挿入は通常選択範囲または濃縮可能なセルの人口を得るために戦略を求めて非効率的なプロセス簡単に学ぶ5,12であります。

このプロトコルでは、目的の genomic 位置に蛍光タンパク質 (FP) をエンコードの DNA シーケンスの挿入について説明します。プロトコルには、デザインとドナー テンプレート プラスミッドおよび複雑なリボ核タンパク質 (RNP) の配信 (野生型ピオゲネス s. Cas9 タンパク質合成の CRISPR RNA (crRNA) とトランス活性化 crRNA (tracrRNA)) が含まれています。述べる推定編集した細胞蛍光性によって作動セル (FACS) を並べ替えおよび細胞ラインの生成プロセスの充実です。日には、このメソッドは、エピジェネティックまたは (稀に) bi 対立緑色蛍光タンパク質 (GFP) タグ分類主要な細胞構造を表す 20 5 蛋白質によるラインを生成する使用されています。これらの努力からの結果の編集されたセルは、予想される遺伝的挿入、正しくローカライズの融合蛋白質を表現、多能性と安定した染色体12 (と未発表のデータ) を維持確認されています。このメソッドは、他の複数の生成にも使用されていますシングルとデュアル (同じセルにタグ付きの 2 つの異なる蛋白質) 編集 hiPSCs (未発表データ) の集団。

多くの従来の細胞とは異なり彼ら、二倍体、karyotypically ので安定性非変形、増殖性健康なドナー由来ヒト Ips はこれらのゲノム編集の努力のため選ばれました。これらのプロパティは、基本の細胞生物学と疾患モデリングを勉強するため魅力的なモデルを提供します。なお、hiPSCs の微分の潜在性は様々 な系統、同質細胞オルガノイド、組織「皿に病気」モデル13 などを用いたセル型並列で複数の発達段階を研究する機会を提供します ,14,15。このプロトコルは hiPSCs (WTC 線) の開発は、他の哺乳類セルラインを使用してプロトコルの開発のために有益かもしれません。

Protocol

1インシリコの設計と crRNA ドナー テンプレート プラスミド FP ノックインの。

  1. NCBI16から注釈参照シーケンスまたは UCSC のゲノムのブラウザー17 (例えば、 GenBank フォーマット) の興味の遺伝子を取得し、好みのバイオインフォマティクス ソフトウェアにインポートします。基準変種を含むホストのゲノムの塩基配列が既知の場合はバイオインフォマティクス ソフトウェアのリファレンス ・ シーケンスを調整することによって今、(議論を参照)。
  2. 目的の FP 挿入部位を探します。C 末端タグの最後の基本クラスの最後のコドンと終止コドンの一塁間 FP タグのシーケンスが導入されます。N 末端タグ、FP タグのシーケンスは開始コドンの最後と次のコドンの塁間通常導入されます。開始コドンが 1 つのコドン エクソンやシグナル配列がタンパク質の末端に近い存在するなど、いくつかのケース必要な FP の挿入部位は、それはフレームを続けている限り、詳細 3ʹ 位置に位置して可能性があります。
  3. 公開されている crRNA デザイン ツールの入力シーケンスとして必要な挿入部位の両側に使用 50 bp。2 4 crRNA ターゲットを挿入部位近く識別、一度 crRNA 結合部位とバイオインフォマティクス ソフトウェアの protospacer 隣接するモチーフ (PAM) シーケンス (NGG) に注釈を付けます。これらの crRNAs は、二重鎖改 (crRNA デザインについての説明を参照) を誘導するために使用されます。
    注: カスタム crRNA シーケンスを合成 (推奨)、商業ベンダーに送信できるまたはこのプロトコルの範囲を超えている合成戦略、クローン作成または体外の設計シーケンスを開始点として使用できます (ディスカッションを参照してください。).
  4. (これは N ターミナル挿入の開始コドンを含める必要があります) 5ʹ 相同性の腕として必要な挿入部位の上流のシーケンスの 1 kb を使用し、3ʹ として必要な挿入部位の下流のシーケンスの 1 kb を使用、ドナー テンプレート プラスミドを開始するにはホモロジーの腕 (これは C ターミナル挿入の停止コドンを含める必要があります)。2 つの相同性の腕の間の拠点は通常省略されていません。相同性の腕の中で細胞特定のバリアントを含む結果の編集されたセルのこれらの遺伝的変異が保持されます。
  5. 2 つの相同性腕の間挿入 FP (または他のノックのシーケンス) の順序とリンカー順序 (リンカーについての説明を参照)。N 末端タグ リンカー シーケンスする必要があります直接 fp; 3ʹC 末端のタグ、リンカー順序は FP の 5ʹ 直接する必要があります。
  6. Cas9 ドナー シーケンスの切断を防ぐためにドナー テンプレート プラスミド crRNA 結合部位を混乱させる (crRNA 結合部位を変更するときの考慮事項の説明を参照)。可能であれば、NGG またはおいぼれ馬以外のシーケンスに PAM の中断お勧めします。CrRNA (PAM に近位 10 拠点) の種子地域の 3 拠点に点突然変異を導入することを予測して十分に crRNA の結合を妨害する代わりに、いくつかの crRNA 結合部位がドナー テンプレート プラスミド; で FP シーケンスの導入によって破壊されPAM、またはそのまま結合領域まだが存在しないことでこれらのケースを確認します。
    注: は、ドナー テンプレート プラスミドインシリコ商業ベンダーによって遺伝子合成のため送信されるか、それはこのプロトコルの範囲を超えているクローン作成戦略を設計する出発点として使用できます。PUC19 など pUC57 単純なバックボーンで十分です。

2. リボ核タンパク質 (RNP) トランスフェクションに CRISPR/Cas9 を介したノック - hiPSCs の

注: このプロトコルでは 'gRNA' という用語について説明します合成 crRNA と tracrRNA 正しく再懸濁、未知数、製造元の指示に従って前複合体 (材料の表を参照してください)。1% のすべてのメディアを補うペニシリン ストレプトマイシン。WTC による線の培養の一般的なガイドラインは、アレン セル エクスプ ローラー18,19詳細で説明されます。WTC hiPSCs は、このプロトコルでは、適切なトランスフェクション最適化、RNP のエレクトロポレーションを使用され、ドナー テンプレート プラスミドは他のセルタイプに正常に適応させること。

  1. GRNA と野生型s. 化膿Cas9 蛋白質2,20; の株式を働いている 10 の μ M を準備します。氷の上を保ちます。1 μ g/μ L のドナー テンプレート プラスミド; 通常在庫を準備します。室温 (RT) で維持します。すべて希釈液の pH 8.0 TE バッファーを使用します。
  2. 5 ml の新鮮な成長培地 10 μ M ROCK 阻害剤 (Ri) ウェルあたりのマトリックス コート 6 ウェル培養プレートを準備します。おいてメディアでプレート インキュベーター 37 ° C、5% CO2で準備ができるまでプレート細胞にトランスフェクション手順 (最大 2 時間) の後。
    注: このプロトコルで使われるすべてのマトリックス コーティング プレートは冷たいマトリゲル量希釈 1:30 のアレンの協会によると冷たい DMEM/F12 メディアで細胞科学のプロトコルの WTC によるライン19を培養するためを追加することによって行われます。
  3. 材料の表で推奨されるように穏やかな単一細胞解離試薬を使用して、自動化された細胞カウンター、または検定を使用して単一細胞懸濁液および count セルに hiPSCs を通路します。
    注: ここで使用される WTC によるラインのための詳しいプロトコルは、アレン セル エクスプ ローラー19見つけることが。簡単に、RT DPBS 一度セルを洗浄し、3-5 分間解離試薬とを扱います。その後、カップ刻んだセル単一細胞懸濁液に穏やかなピペッティングしてペレット遠心分離によって。成長培地 10 μ M Ri の生細胞ペレットを再懸濁します。
    1. 1.84 x 10 の因数別 1.5 mL チューブにトランスフェクションするのに実験条件ごとに6セルを準備します。
      注: すべてのボリュームは、2.3 反応時間の 100 μ L エレクトロポレーション ボリュームで 4.5 μ L 全反応量について計算されます。このアカウントは、重複したトランスフェクションとピペッティング エラーの過剰。
  4. 2.88 μ 10 μ M gRNA と 10 μ M の 2.88 μ L を追加することによって各実験条件のリボ核タンパク質 (RNP) 複雑なチューブを準備 1.5 mL チューブに Cas9。最低 10 分 (最大 1 時間) 室温で孵化させなさい。
  5. 1 つのセル分注 (2.3.1 の手順で準備) 3 分吸引した上清の 211 x g でペレットし、製造元のエレクトロポレーション バッファーの 220 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。
  6. 2.4 準備した 1.5 mL RNP 複合管に 2.5 ステップから再懸濁細胞の 220 μ L を追加します。
  7. 2.4 準備した 1.5 mL チューブに 1 μ g/μ L ドナー テンプレート プラスミドの 4.60 μ L を追加します。
  8. Nucleofection チップ、ピペットを使用して、2 〜 3 回、チューブ内をミックスし、懸濁液 100 μ L を準備されたエレクトロポレーションのデバイスに転送します。ヒント任意の気泡を導入することは避けてください。1300 V 30 ms の 1 パルスを適用します。
  9. ゆっくり旋回運動と 2.2 の段階から準備 6 ウェル プレートに懸濁液を転送します。軽くサイド ・ ツー ・ サイドとフロント-バック プレートを移動することによって細胞を分散させます。
  10. 新しい nucleofection チップを使用して、懸濁液および伝達の残りの 100 μ L で準備 6 ウェル プレートの 2 つ目のウェルに、2.8 2.9 手順を繰り返します。
    1. GRNA と組み合わせごとにドナー テンプレート プラスミド、非ターゲット gRNA、ドナー テンプレート プラスミドのみ、バッファーだけコントロールなど 2.4 2.10 ~ の手順を繰り返します。クロス汚染を避けるためピペットと nucleofection のヒントを変更する注意してください。
  11. 37 ° C、5% CO2で transfected セルを孵化させなさい。メディアを 24 h で、通常成長媒体 (Ri なし) に変更し、72 96 h、密度の監視のすべての 24 h hiPSCs を送り続けます。HiPSCs、60-80% の合流点に到達するときは、手順 3 に進みます。
    注: 重い細胞死 (> 70%、推定) はトランスフェクション後、通常 24 ~ 48 時間。

3. 推定編集 hiPSCs FACS 濃縮

注: 幹細胞をソートするには、議論で提案した細胞の生存を促進するための機器の設定を適応します。簡潔に、使用最大ノズル可能 (130 μ m)、低流量 (≤ 24 μ L/分)、防腐剤フリー シース液 (生理食塩水など材料の表を参照)、低いサンプル圧 (10 psi)。

  1. FACS 実験を開始する前にメディアを成長培地 10 μ M Ri に変更し、FACS 後の生存を促進するために 2-4 h の CO2を 37 ° C、5% でセルを孵化させなさい。
  2. 材料の表で推奨されている穏やかな単一細胞解離試薬を使用して、単一細胞懸濁液 10 μ M Ri19を添加した成長媒体に hiPSCs を通路します。
  3. ポリスチレンの丸底チューブに 35 μ m のメッシュ フィルターを通過による懸濁液をフィルタ リングします。
  4. 破片やダブレットを除外する前方散乱、側方散乱 (幅高さを含む) を使用してセルを並べ替えます。ライブを使用、バッファーのみコントロール FP 肯定的なゲートを設定するセル、< セルだけをバッファーの 0.1% 落ちるゲート内。
  5. 並べ替え FP 陽性の全体の人口は 0.5-2 を含む 1.5 15 mL ポリプロピレン チューブに細胞 RT 成長培地 10 μ M Ri の mL。
    注: ポリプロピレン プラスチックに細胞接着の可能性を低減します。
  6. 室温 3 分 211 x g で収集した細胞を遠心分離します。
  7. 慎重に上清を吸引し、10 μ M Ri を添加した成長媒体の 200 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。新鮮なマトリックス コーティング 96 ウェル プレート19の単一の井戸に最大 3,000 並べ替えセルを転送します。
    注: 適切な機器設定とセル並べ替えることもできます (一括) で 10 μ m Ri ウェルあたり 1,000-3,000 の推奨密度で補われる成長媒体の 200 μ L を含むマトリックス コーティング 96 ウェル培養プレートの単一の井戸に直接こと。
  8. 37 ° C、5% CO2で並べ替えられた細胞を孵化させなさい。24 h で 5 μ M Ri を添加した成長媒体に、メディアを変更します。48 h で餌の細胞の通常成長媒体 (Ri なし) 72 96 h、密度の監視のすべての 24 h を開始します。FACS は 500 セルの最小値は 96 ウェル プレートのウェル 1 個で播かれる場合 50% を超えると推定される後の生存。
    1. とき hiPSCs は 60-80% の合流点に達するし、6 ウェル プレートに成熟した形態 (滑らかな、十分に詰めてコロニー センター)、24 ウェル プレートなど、24 ウェル プレートから大きな形式プレートに通路を表示します。
    2. 6 ウェル プレートで hiPSCs 60-80% の合流点に達するし、成熟を示すときは、形態が 100 mm プレートに展開し、再イメージング プレート、凍結、またはクローン ピッキング密度 (ステップ 4)19種します。

4. 推定を生成する編集による系統

  1. 材料の表で推奨されるように穏やかな単一細胞解離試薬を使用して、単一細胞懸濁液に hiPSCs を通過し、mL19あたりのセル数を決定します。
  2. シード 10,000 細胞成長培地 10 μ M Ri19を使用して新鮮なマトリックス コート 100 mm 細胞培養用ディッシュ上に hiPSCs の編集の人口の。播種後 Ri 24 h なし成長媒体にメディアを変更し、5-7 日間新鮮な成長媒体ごとの 24 h で hiPSCs をフィードします。
  3. HiPSCs 巨視的表示されるコロニーを形成しているとき (約 500 μ m) 彼らが分離するのに十分な大きさです。過剰なマトリックス ・成長培地 10 μ M Ri よく19あたりの 100 μ L を追加するマトリックス コーティング 96 ウェル プレートを準備します。
  4. 解剖顕微鏡使用、P-200 ピペットまたは同様に、軽くこすり、プレート面から個々 のコロニーを吸引します。転送量 (20 〜 100 μ L) 4.3 準備した 96 ウェル プレートの単一の井戸への植民地を含みます。
    1. すべてのコロニーが転送された後は、37˚C と 5% CO2で組織文化のインキュベーターでプレートを孵化させなさい。メディアを 24 h で、通常成長媒体 (Ri なし) に変更し、コロニー サイズ (約 1500 μ m) の約 3 倍まで 72 96 h のすべての 24 h 細胞を送り続けます。
      注: お勧め、トランスフェクションに使用 crRNA あたり 24 96 コロニーを拾います。孤立したクローンの生存率は通常 95% よりも大きいです。
  5. 穏やかな単一細胞解離試薬材料の表で推奨されている、通路による複製を使用新しいマトリックス コーティング 96 ウェル プレートにとおり19
    1. 8 ch の吸引器を使用して、削除し、96 ウェル プレートの最初の列からメディアを破棄します。
    2. P-200 マルチ チャンネル ピペットを使用して、セルを洗浄する 96 ウェル プレートの最初の列に DPBS 〜 200 μ L を追加します。8 ch の吸引器を使用して、削除し、96 ウェル プレートの最初の列から DPBS 洗浄を破棄します。
    3. P-200 マルチ チャンネル ピペットを使用すると、96 ウェル プレートの最初の列に解離試薬の 40 μ L を追加します。
    4. 必ずヒントを変更するない交差汚染井戸 96 ウェル プレートの 6 列の合計で最大の手順 4.5.1-4.5.3 を繰り返します。解離試薬 (ステップ 4.5.3) の最初の列に追加した時刻から 3-5 分の 37 ° C の定温器にプレートを配置します。
      注: お勧めだけ通路に最大 6 列 (48 ウェル) 次の手順の実行に要する時間のために。最初の時間のため、このプロトコルを実行するときのみ、一度に 1 つまたは 2 つの列を通過し始めます。一度に継代の列数の制限により hiPSCs に有害であることをあまりにも長い間、解離試薬で細胞が残っていないことになります。
    5. プレートの最初の列内のセルは、プレートの下から持ち上げて始めている場合、は、96 ウェル プレートの最初の列の DPBS 160 μ L を追加し、「12:00」でセルをそっとカップ刻んだ P-200 マルチ チャンネル ピペットを使用、「3:00」、「6:00」、および「9:00」各ウェルの位置。V 底 96年ウェル プレートに細胞懸濁液 (200 μ L) のボリューム全体を転送します。
    6. それらの解離試薬をいるセルの残りの列に対して、手順 4.5.5ない交差汚染井戸に関してヒントを変更します。
    7. ルート 3 分の 385 × g で遠心分離で V 底板をスピンします。
    8. P-200 マルチ チャンネル ピペットを使用して、そっと上澄みを除去し、200 μ L、新鮮な成長培地 10 μ M Ri ウェルあたりの細胞を再懸濁します。クロス汚染しないようヒントを変更するすべての井戸に繰り返します。
    9. 新鮮なマトリックス コーティング 96 ウェル プレート19に細胞懸濁液のすべてを転送します。37 ° C、5% CO2で組織文化のインキュベーターでプレートを孵化させなさい。メディアを 24 h で、通常成長媒体 (Ri なし) に変更し、クローンの大半は 60-80% 合流まで 72 96 h のすべての 24 h 細胞を送り続けます。
      注: この一節細胞を普及し、96 ウェル プレートの全体の面積をより多くの成長を可能にすることができます。
  6. クローンを監視し、それぞれ個々 のクローン ・ 96 ウェル プレートでの適切な分割比を特定 (例えば、 1:10、または 1:8)。通路による材料の表で推奨されている穏やかな単一細胞解離試薬を使用して、新しいマトリックス コーティング 96 ウェル プレートに (手順 4.5.1-4.5.8) 各クローンに適した細胞懸濁液の比を転送するクローンを作成します。37˚C と 5% CO2で組織文化のインキュベーターでプレートを孵化させなさい。メディアを 24 h で、通常成長媒体 (Ri なし) に変更し、72 96 h のすべての 24 h までクローンの大半は 60-80% の合流点に達するし、成熟形態を示す細胞を送り続けます。
    注: 各クローンがあります異なる分割比わずかに異なる成長率や前の通路からの生存のために凍結のステップに各クローンの井戸あたりのセル数を正規化することができますこの一節。生存と成長のさまざまなレートの変動によりいくつかのクローンは一面にはえ、これらの手順を通過中に成長に失敗します。
    1. ルート削除清 3 分の 385 x g で V 下 96年ウェル プレートで残りの細胞懸濁液と gDNA 分離遠心細胞のペレットを保存し gDNA 分離 96 ウェル キットを使用してに進むか小球形にされた細胞 - 木までの 20˚C のプレートは保管ee 週間。

5. 96 ウェル プレート形式のクローン細胞の凍結保存

  1. 単一細胞解離試薬を使用して、ことクローン前述 (手順 4.5.1-4.5.7) の通路します。P-200 マルチ チャンネル ピペットを使用して上清を吸引し、再成長培地 10 μ M Ri の 60 μ L で中断します。すべての井戸に繰り返しますクロス汚染しないようヒントを変更します。
  2. 細胞懸濁液の 30 μ L を非行列コーティング 96 ウェル培養プレートに転送します。170 をすばやく追加バッファーを凍結 μ L (材料の表を参照) を混合せず、各ウェル。妹に懸濁液の残りの 30 μ L を転送することによって繰り返しプレートと凍結 170 μ L の追加のバッファーです。
    注: このプロセスで行われます重複姉妹板、個々 のプレートの一つを解凍後にセルのバックアップ人口が存在します。速く融解 (ステップ 5.6) 96 ウェル プレートのだけすべての他の列に凍結保存した細胞を置くことができます。
  3. 板パラフィルムをラップし、RT 発泡スチロール ボックスのふたに置きます。-80 ° C のフリーザーで全体のボックスを配置します。
  4. 24 h 後板を発泡スチロールの箱から転送し、- 80 ° c で最長 4 週間保存できます。
    注: セルは-80 ° C で一時的に格納されている、遺伝的品質管理試金実行できます 4.6.1 の手順で解凍し、さらに、前述した以前に公開された作品を伝達するクローンを識別するために得られる細胞から収穫された gDNA を12です。 簡単に言えば、コピー数滴デジタル PCR 試金を使用して、GFP の 1 つまたは 2 つのコピーとドナー テンプレート プラスミド バックボーン統合を含むクローンを識別できます。[エンドポイント PCR の試金とサンガー シーケンス処理することができますの組み合わせは、正確な挿入を含むクローンを識別します。
  5. 雪解けには、氷の粒を溶かすため慎重に見て、組織培養のインキュベーターで 37 ° C にプレート全体をもたらします。プレートの端に井戸は、まず解凍する傾向があります。
    1. RT 成長培地 10 μ M Ri と 211 × g で遠心する室温 3 分の 3 mL を含む 15 mL の円錐管に全体 200 μ L を優しく転送望ましいクローンの氷ペレットが溶けると
    2. 上清を吸引し、10 μ m Ri 補われる RT 成長媒体の 1 mL の小球形にされた細胞を再懸濁します。新鮮なマトリックス膜 24 ウェル プレートに移し、37˚C と 5% CO2で孵化させなさい。メディアを 24 h で、通常成長媒体 (Ri なし) に変更し、クローンで 60-80% の confluency に達すると、成熟した形態19まで 72 96 h のすべての 24 h 細胞を送り続けます。

Representative Results

この実験の目的は、LMNB1 遺伝子 (タンパク質の N 末端) の 5ʹ の終わりに mEGFP シーケンスを導入することにより核ヒトラミン B1 蛋白質 mEGFP (単量体強化された GFP) の融合をだった。リンカー (アミノ酸配列 SGLRSRAQAS) は、マイケル ・ デビッドソン蛍光タンパク質コレクション21から以前の cDNA の構造に基づいて選ばれました。潜在的な crRNA の認識とで胸の谷間を混乱させる可能にするので各候補者 crRNA のドナー テンプレート プラスミドの crRNA 結合領域は、mEGFP とリンカー順序のインシリコ挿入後中断された、点突然変異は必要ありません。ドナー シーケンス (図 1) の Cas9。ドナーの配列には、1 kb の相同性腕 mEGFP リンカー順序の両端の側面が含まれています。結果として得られる 2,734 シーケンスを確認、pUC57 バックボーンに複製された DNA の bp とエンドトキシン マキシ準備を使用して結果のドナー テンプレート プラスミドを精製しました。ドナー テンプレート プラスミッドおよび複雑な RNP 導入させた、推定編集した細胞を濃縮した、mEGFP 核ヒトラミン B1 融合タンパク質の局在を蛍光顕微鏡 (図 2) で確認しました。CrRNA1 トランスフェクションから結果だけは両方の crRNA シーケンス生産推定編集集団12ここでは、とおりです。

推定編集を表す 0.95 %megfp 陽性細胞が細胞に含まれている transfected LMNB1 crRNA1 gRNA、Cas9 蛋白質またはドナー テンプレート プラスミド エレクトロポレーション反応 (バッファーのみ) には含まれていない、負の制御と比較されたときmEGFP 核ヒトラミン B1 人口 (図 3 a)。この結果は、ノックイン効率以前に報告された12として、このメソッドを使用して多くのゲノム遺伝子座の間で観察の範囲内だった。

MEGFP 陽性細胞は、FACS により分離され、核封筒に mEGFP 核ヒトラミン B1 融合タンパク質の予想される局在を確認するライブ顕微鏡によるイメージングします。FACS 濃縮後細胞 LMNB1 crRNA1 の人口からの約 90% は mEGFP 陽性 (顕微鏡検査によって決定される) として示唆いくつかの mEGFP 陰性細胞は共同並べ替えプロシージャ中に GFP 陽性細胞の精製されました。これは、成功を編集するため、遺伝子選別できる 96 クローンのピッキングに使用できる濃縮の許容可能なレベルだった。一般的に、成功した濃縮のためのカットオフは 50 %gfp 陽性。

並べ替えられたセルの人口の大半は非分裂細胞の核膜 (核周辺) に蛍光を表示され、有糸分裂提供する自信を持って正しいゲノム中に細胞質内の拡張核ラミナを LMNB1 で編集軌跡。豊かな人口には、明るいまたは暗い信号を持つセルが含まれています。この信号強度の違いは正しいと不適切な結果とハイライトの系統が遺伝的検証をさらに生成するユーティリティ研究 (説明参照) の編集の組み合わせを反映可能性があります (図 3 b)12。系統発生後検証顕微鏡実験 (図 3 c) で均一の GFP 強度を示した細胞が遺伝子。

Figure 1
図 1.LMNB1 遺伝子の N 末端 GFP タグの戦略を設計する。GFP タグ染色体 5 にある LMNB1 の最初のエクソンの N ターミナル挿入 5ʹ 設計されました。5ʹ と 3ʹ の両方の相同性の武器は 1 kb と開始コドン (ATG) と 2 番目のコドン (ホモロジー腕だけ部分的に図で表される) との間を満たす。2 候補者 crRNAs まだゲノム内で一意でありながら、可能な限り目的の挿入サイトに近い切断する Cas9 をご案内しています。MEGFP とアミノ酸リンカーのシーケンスは開始コドン (ノンスケール mEGFP とリンカー順序) の挿入だけ 3ʹ.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2.タグ付きの内生生産ワークフローによる系統。トランスフェクション コンポーネント、ホモロジー腕 (HAs、金で示されている) を含むドナー テンプレート プラスミド (金 crRNA と紫の tracrRNA と赤の Cas9 蛋白質を示す)、Cas9/crRNA/tracrRNA RNP 複合体を含むと FP リンカー順序 (で示されている緑) +electroporated。4 日後推定編集 FP 陽性細胞 FACS による濃縮 96 ウェル プレート (1,000 〜 細胞) の単一ウェルに、細胞のすべてを播くことによって集団として拡大し、労働人口数百万のまで文化の拡大細胞が「豊かな人口」として試金することができる (プロトコル手順 3.8 を参照してください).FP 陽性細胞の収量は、HDR12; 可変レートの変動により実験によって異なります成功した濃縮は通常 300 〜 5,000 を含めることができます約 1.6 × 10 のトランスフェクション後のセル6腰セル。予備のイメージング研究は、豊かな人口の融合蛋白質の局在と信号を確認しました。コロニーは拡大し凍結保存のための 96 ウェル プレートに手動で選ばれました。ゲノムの品質管理審査をさらに液滴デジタルを使用して PCR (ddPCR) および他の PCR に基づく試金を使用して前述の12として正しく編集したクローンを識別します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3.推定編集したセル人口の濃縮します。(A) 、LMNB1 の流れの cytometry プロット編集セル 4 日後トランスフェクションします。Y 軸は、GFP の強度を表示し、x 軸表示前方散乱。並べ替えのゲートは、バッファー制御に基づいて設定しました。HiPSCs は摂動に敏感なのでライブ/デッド汚れが省略され、非常に保守的な FSC/SSC ゲートが代わりに使用されました。(B)濃縮後、LMNB1 Cr1 の人口編集細胞核封筒 (予想 LMNB1 局在) にローカライズする GFP と細胞の ~ 90% を示した。人口は、いくつかの GFP 陰性細胞と同様、程度は GFP の細胞に含まれています。スケール バーは、10 ミクロンです。(C)系統世代後の細胞は、細胞周期依存の違いと、均一な GFP 強度を示した。スケール バーは、20 ミクロンです。

Discussion

HiPSCs の蛍光タンパク質融合を規制内生を生成するため、ここで示す方法は、ライブセル イメージングから様々 な機能の研究に至るまでのアプリケーションと編集遺伝子細胞を生成するための汎用性と強力なアプローチと」患者由来による行13,14,15を使用して皿に病」モデル。それが潜在的モデルや正しい病気の原因となる変異22,23に他のタグまたは小さい遺伝の変更を導入して使用する中に、N または C-末端内因性のタンパク質の大きな FP タグを導入するこのメソッドを使用すると、.小さい挿入相同性の腕のサイズになることがありますが、このメソッドで提示を編集する一般的なアプローチは、24,25をかかることがあります。HiPSCs の使用が彼らの広大なユーティリティは、慎重に最適化と強くお勧めこのプロトコルは他の哺乳類セルラインのゲノムを編集するのには適応があります。

(マイクロ アレイまたは RNA シーケンス データ) から推定するトラン スクリプト豊富な FP がタグ付けに興味の遺伝子を識別するとき良いトラン スクリプトのレベルは常に相関がないが、遺伝子または関心のアイソ フォームを表明したかどうかを評価するためのポイントを始めています。蛋白質レベル。ここで説明されている FACS 濃縮方法が興味のセル型で少なくとも適度に表現される遺伝子の最高を仕事します。この戦略はまた、バック グラウンド強度比への信号が非常に低い12,19centrin、desmoplakin、paxillin など点状および/または離散の局在パターンを示す融合の選択で成功しています。遺伝子が高発現していないまたは派生セル型でしか表現が追加選定を必要があります。

ひと培養細胞で使用されるテンプレート プラスミド crRNA とドナーのデザインの出発点は、人間の参照ゲノム (GRCh38) をする必要があります。異なる培養細胞のゲノムは、同じ種の内で変わることができるので CRISPR/Cas9 はシーケンス固有セル行固有亜種 (一塩基多型または挿入/削除 (オクターリピート)) を識別するために非常に便利ですので参照ゲノムとは異なる、デザインにこれらを組み込みます。これにより crRNAs がホストのゲノムに互換性があること、ドナー テンプレート プラスミド ホモロジー腕が任意のセル行の特定のバリアントが保持されます。推奨される戦略は、設計プロセス中に crRNAs とドナーのテンプレート プラスミド ホモロジー腕にホモの亜種を組み込むことです。ヘテロ接合体の変形を組み込むことはオプションです。大きなノックアウトの実験のため特定の試薬を使用し、このプロトコルの他主な考慮事項を以下に。

Cas9 タンパク質

Cas9 蛋白質を使用しての主な利点は、Cas9 を導入して、RNP 複合として gRNA は、Cas9 と gRNA の発現が数日間続く可能性があり、つながるプラスミド ベースのアプローチと比較してのヌクレアーゼ活性の限られた期間での結果に示されています。大きいとオフ-対象活動26,27。Cas9 蛋白質を使用しての追加の利点は、劈開は一度細胞の中にすぐに利用できることです。これより従来の Cas9 mRNA または Cas9/gRNA プラスミドを使用して転写、翻訳、タンパク質のプロセッシング26,28を必要とするとは対照的します。野生型ピオゲネス s. Cas9 蛋白質が多く商業ソースから可能です。

ガイド RNA

目的の FP 挿入部位付近の crRNA ターゲットがターゲットを持つゼロまたは数予測をオフ - ホストのゲノム29,30,31,32を見つけるための多くの公開ツールがあります。HDR と HDR 結果の精度の効率は、crRNA ターゲット特定の軌跡12で使用によって大きく異なります。このため、いくつかの crRNAs をテスト (2-4、できれば 50 以内に目的の挿入部位の bp) 軌跡あたりは、これは編集の実験が成功の確率を高める可能性がありますので勧め。GRNA を提供するための現在の可能性を含める合成 2 部 crRNA と tracrRNA、合成単一 gRNAs (sgRNAs)の in vitro転写 sgRNAs、または U6 プロモーターから sgRNA を発現する細胞にプラスミドを提供します。このプロトコルは高い切断活性の最適化されていません。そのまま 2 部の crRNA と tracrRNA (材料表参照) は、セルに少なくとも潜在的な摂動を起こしながらモノラル対立 FP タグ セルラインを生成することを目標に使用されました。

ドナー テンプレート プラスミド

相同性のいくつか腕シーケンスを提供ドナー テンプレート プラスミドが HDR イベント中に宿主ゲノムに組み込まれます、ため crRNA 認識部位に点突然変異を導入次の HDR Cas9 で胸の谷間をさらに防ぐためするべき。通常最も簡単な分裂的な変更は PAM シーケンスを変異です。いくつかの非正規の PAM のシーケンスは、野生型ピオゲネス s. Cas9 でまだ認識できる、ために、NGG、NAG、NGA の33を使用しないようにすることをお勧めします。相同性腕を変異、非同義変異とまれなコドンの導入を避けます。PAM シーケンスに同義的な変化は不可能、種地域で 3 つの同義の点突然変異をすることを検討 (10 bp PAM に近位) crRNA 結合部位の。これらの地域は重要な規制シーケンスを含めることができますので、5ʹ 非翻訳領域 (UTR) でこれらの変更を行うときに十分な注意が必要があります。コンサルティングの遺伝的保全データベース UCSC のゲノムのブラウザー比較ゲノミクスのトラックは、これらのケースでのガイダンスを提供できるよう非常に節約された拠点17への変更よりも、非保存の拠点への変更より良い容認されるかもしれない。FP シーケンスの単なる挿入がある (図 1) のように crRNA 結合部位を破壊する十分なただし、新しく追加されたシーケンスは crRNA バインディングおよび PAM シーケンスの永続化のためにチェックしなければなりません。

FP とネイティブ蛋白質のアミノ酸のリンカーが融合蛋白質34の機能を節約するためにお勧めします。多くの場合特定料金のサイズ アミノ酸リンカーを選択可能性があります。場合は内因性にターゲットを絞ったようなデザイン cDNA 融合融合タンパク質よく研究されている、CRISPR/Cas9 ノックアウトの実験12,19同じリンカー シーケンスが使えます。このような情報を使用できない場合は、GTSGGS などの短いリンカーもされて正常に12を使用します。他の研究は、さまざまなターゲット35の汎用小型 3-アミノ酸リンカー順序との成功を実証しています。

トランスフェクションと FACS 濃縮

多くの市販のトランスフェクション試薬は、エレクトロポレーション システムを使用するサイズ、料金、および構成の広い範囲で試薬を提供することができますに対し分子の特定の種類の細胞への配信のため処方されています。HiPSCs ようにセルに transfect ハードの一般的なトランスフェクション法に加えて、エレクトロポレーションはまたこのメソッドで説明されているように CRISPR/Cas9 を介した FP ノックのすべての 3 つのコンポーネントを提供することの利点を運ぶ。トレーシー ・ メソッド (データは示されていない)、また RNP 配信26,28,36 の他のユーザーによって使用されていますと、他の市販試薬と比較して最高の結果を生成するエレクトロポレーションが見つかりました.

HiPSCs を編集するため、このプロトコルを使用する場合、特別な注意は編集プロセスの最適な細胞生存率と最小限の分化遺伝子の前後にセルの穏やかな取扱いの確保にすべき。特に、FACS 濃縮方法が最大ノズル可能 (130 μ m)、低流量 (24 μ L/分)、防腐剤フリー シース液を用いて幹細胞を並べ替えに適応する必要があります (生理食塩水など材料の表を参照)、および低いサンプル圧力 (10 psi)。幹細胞の最適生存率の結果、並べ替え、単一のセルではなく FACS 濃縮 hiPSCs が一括で並べ替えられ、細胞の生存率と幹細胞の整合性を最適化する人口として展開します。ただし、単一セルの並べ替えが以下の敏感な細胞のタイプの適切なあります。細胞の生存を促進するため、細胞は FACS 濃縮のため収穫後 1 時間よりは、もはや文化に戻り、並べ替えプロセス全体を通じて室温で保管します。いくつかの細胞の種類、細胞の生存は並べ替えプロセスを通して氷 (4 ° C) の上のインキュベーターの細胞によって強化があります。

FP 陽性細胞の一括拡大は、系統を生成する前に融合蛋白質のローカリゼーションのための画像解析による人口を評価する機会を提供します。セルの結果豊かな人口は、いくつかの研究のために十分かもしれないが、これらの集団はよく FP 様々 な強度の信号を表示します。分離系統機能実験12のより適切な意思統一信号 (図 3) があります。

クローンの細胞ラインの生成

編集とクローン線の生成処理中、細胞の形態を監視することが重要です。フィーダー無料条件で栽培による植民地は、滑らかなエッジとも、十分に詰めてセンター12,18,19を表わすべきであります。分化した細胞は、文化の 5% 未満で観察すべき。個々 のコロニーを選ぶとき、それらにその展示形態を選択します。イベントを継 96 ウェル プレート、中に形態のためのクローンをチェックし、これが差別化につながるや遺伝的不安定性の徴候である可能性がありますが大きくなり過ぎたものを中止します。

クローンの細胞ラインの生成できる遺伝確認正確な編集のため Cas9 誘起二重鎖切断がゲノムのために重要なある頻繁に修復される不正確定款目的の軌跡でタグにもかかわらず。前述の PCR アッセイことを示した累積 10 ユニークなゲノム遺伝子座の間で多く (45%) FP 発現クローンのゲノム12ドナー プラスミド バックボーン統合対象の座または (稀に) ランダムに苦しみました。また、GFP 陽性の 23% のクローンを作成 (n = 177) 10 ユニークな遺伝子座の間で、またはタグなしの対立遺伝子、NHEJ12可能性があります予想される crRNA 切削現場近くの突然変異を隠すことがわかった。多くの系統 (~ 100 クローン/編集) のこの遺伝子解析 FP 式と単独で予想される融合蛋白質のローカリゼーションは正確な編集12 には保証しないので、細胞集団では不可能です遺伝検証の重要性を強調しました。.さらに、これらの PCR に基づく試金は、有意義な分析が完了する前に系統発生の必要性を正当化、確実に細胞の豊かな人口に実行できません。挿入された FP タグの遺伝学的確認と (モノラル対立編集したクローン) で未編集の対立遺伝子の遺伝的整合性の検証は、タグ式を超えてターゲットの軌跡で正確な編集を確認する必要です。

Bi 対立編集率が低いと (サンガーとエキソーム配列によって試金) としてターゲットを突然変異の欠如は、この方法で (未発表データ)12を使用して、日付に観察されています。これは、CRISPR/Cas9 実験26,27短期持続 RNP の使用を記述する先行研究と一致。Bi 対立編集クローン細胞の欠如特定の軌跡がありますまたはセルの 2 つを容認することができないのためと推定される bi 対立編集されたセルがあった以前に公開された実験の重要な蛋白質のコピー タグ別 (TUBA1B)12が、一つの座 (LMNB1) の観察。Bi 対立の完全に検証されたクローン細胞株は、mEGFP19このメソッド タグ ST6 β-ガラクトシド α 2, 6 シアル酸転移酵素 1 (ST6GAL1) および RAB5A メンバー RAS 癌遺伝子家族 (RAB5A) を使用して生成されています。

ゲノムの編集の精度を確認し、超えてさらにクローン線を特徴付けるし、満たすすべての幹細胞、ゲノム、クローンの識別に使用することができます品質管理試金の様々 ながあるし、細胞生物学的基準は研究を将来的に使用.細胞生物学・機能の試金を使用して、適切な表現、ローカリゼーション、および融合タンパク質12の機能を確認できます。未編集のペアレンタル コントロールに比較は、編集プロセスのローカリゼーション ・動態・機能に及ぼす影響の評価に役立ちます。他のアッセイなど成長解析とゲノム安定性をテストすることができますは、タグ付きタンパク質がセルに摂動かどうか。使用すると、このプロトコルでは、多能性マーカーと微分の潜在性の評価が下流の貴重なクローン研究12を決定する際に重要なことができます。文化を拡張したため、遺伝的不安定性、成長率を監視していくことが示されているし、クローン細胞の染色体はまた重要な12,37。ただし、最終的なもの編集されたセルの使用レベルと幅広い品質管理分析が最終的に決定して、アプリケーションによって異なります。

Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

ダフネ Dambournet は、多くの洞察力に富んだ議論や編集、イラスト、原稿の批判的読解のアンジェ リーク ・ ネルソン、アンドリュー タッカー ラミン B1 セルのタグ付きの mEGFP ラインを生成するためのタオは遺伝子についてのアドバイスを感謝いたします。遺伝子の編集および品質管理プロセスへの貢献のため細胞科学の幹細胞と遺伝子編集とアレンの協会のアッセイ開発チームを確認したいです。私たちの細胞の遺伝子編集行を作成するために使用私たち WTC ラインは、グラッドス トーン研究所、UCSF でブルース ・ r ・ コンクリン研究所によって提供されました。我々 は細胞科学創設者、ポール g. アレン、励まし、彼のビジョンのためのアレンの協会に感謝し、サポートします。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Geneious R9 Biomatters, or similar bioinformatics software for in silico donor plasmid design
TE Buffer pH 8.0 IDT, or similar 11-01-02-05
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator, or similar ThermoFisher Scientific, or similar 51030408
Pipettes (1000 µL, 200 µL, 20 µL, 10 µL, 2 µL) Rainin, or similar
Pipette tips (1000 µL, 200 µL, 20 µL) Rainin, or similar
Multi-channel Pipette (200 µL) Rainin, or similar
Serological pipetes (25 mL, 10 mL, 5 mL) Costar, or similar
BRAND 8-Channel Manifold for Quiksip, Autoclavable Millipore Sigma, or similar BR704526-1EA use with non-filtered pipet tips, such as Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10, below
Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10 Thermo Fisher, or similar 3501-05
XP2 Pipette Controller Drummond, or similar 4-000-501
Disposable Pasteur Pipets VWR, or similar 53300-567
Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet CELLGARD, or similar NU-481
Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced Corning 354230 lot tested before use with hiPSC
DMEM/F12 (-phenol red) Gibco 11039-021 cold, for diluting Matrigel 1:30
mTeSR1 Complete Media StemCell Technologies 85850 recommended growth media for WTC hiPSC line
Penicillin-streptomycin Gibco 15070-063
WTC hiPSC line Coriell GM25256 the hiPSC line used in this protocol is available through Coriell
Tissue culture dish 100 mm Falcon 353003
6-well Cell Culture Plate CELLSTAR 657160
StemPro Accutase Gibco A11105-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) no calcium, no magnesium Gibco 14190144
15 mL polystyrene conical Sarstedt 62.554.100
Y-27632 (ROCK Inhibitor) StemCell Technologies 72308
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic crRNA, unmodified (custom sequence) Dharmacon Custom0247
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA Dharmacon U-002005-05
Recombinant wild-type Streptococcus pyogenes Cas9-NLS purified protein, 40 µM University of California-Berkeley QB3 Macrolab
Custom donor plasmid (PriorityGENE) Genewiz donor insert design was synthesized and cloned into pUC57 backbone by Genewiz
DNA LoBind Tube 1.5 mL Eppendorf 22431021
NucleoBond Xtra Maxi EF Clontech 740424.50
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 100 µL kit ThermoFisher Scientific MPK10096
5 mL Polystyrene Round-bottom Tube with Cell Strainer Cap Falcon 352235
15 mL High Clarity Polyproylene Conical Tube Falcon 352196
FACSAriaIII Fusion BD Biosciences 656700
FACSDiva software BD Biosciences
FlowJo version 10.2 TreeStar
NERL Blood Bank Saline ThermoFisher Scientific 8504 used as preservative-free FACS Buffer
Olympus SZX7 Stereo Microscope, or similar Olympus, or similar
Tissue culture plate, 96-well Falcon 353072
96 well Cell Culture Plate, V-Bottom CELLSTAR 351180
CryoStor CS10 Sigma C2874-100ML used as cryopreservation buffer for cells in 96-well plate format
Parafilm Bemis PM-996
24 well Cell Culture Plate CELLSTAR 662160

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References

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人間でタグ内因性のタンパク質誘導多能性幹細胞 CRISPR/Cas9 を使用して
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Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (138), e58130, doi:10.3791/58130 (2018).More

Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (138), e58130, doi:10.3791/58130 (2018).

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