数字聚合酶链反应 (PCR) 是一个有用的工具, 高灵敏度检测单核苷酸变种和 DNA 复制数变种。在这里, 我们展示了测量人类基因组中稀有变种的关键考虑因素, 使用数字 PCR 技术与芯片内管格式。
对人类遗传变异的定量分析对于了解肿瘤等严重疾病的分子特征至关重要。由于数字聚合酶链反应 (PCR) 能够精确量化 DNA 拷贝数变体, 它们正成为检测稀有遗传变异的重要工具, 如耐药性突变。预计在不久的将来, 使用数字 PCR (dPCR) 的分子诊断将在临床实践中得到应用;因此, 如何有效地进行 dPCR 的人类遗传物质是一个热门话题。在这里, 我们介绍了一种检测腺瘤型息肉样大肠杆菌(APC) 体细胞嵌合体的方法, 使用 dPCR 与芯片内管格式, 这使得八 dPCR 反应同时进行。在填充和密封的反应混合物在芯片上应注意。本文演示如何避免对正分区的过度和低估。此外, 我们提出了一个简单的程序, 从芯片上的分区收集 dPCR 产品, 然后可以用来确认具体放大。我们希望这种方法的报告将有助于促进 dPCR 与芯片内管方法在遗传学研究。
定量 PCR (qPCR) 经常用于量化人类遗传变异, 包括单核苷酸变异 (SNVs) 和 DNA 拷贝数变异 (CNVs)。在 qPCR 中, 在每管中进行聚合酶反应的方式与常规终点 PCR 方法相同, 在每个热循环后从管中获得放大信号。相比之下, 在 dPCR, 这意味着终点 dPCR 在本报告中, PCR 混合物被加载到许多微观室, 称为分区, 其中 DNA 模板是存在或缺席的限制稀释, 和每一个包含 PCR 混合物的分区被评估为完全 PCR 后阴性或阳性。虽然很容易估计在负分区中没有 dna 模板, 但目前尚不清楚阳性分区中有多少个 dna 模板拷贝。因此, 在正分区中的 DNA 模板数根据泊松分布估计, 使用来自负分区1的计数。与 qPCR 相比, dPCR 成本更高, 动态范围更小, 但是这种方法能够实现绝对量化, 并提供更高的灵敏度和更精确的2。
dPCR 的主要应用之一是对下一代测序识别的变种进行验证。特别是在罕见变型的情况下, 这意味着低变型分数, 验证是至关重要的, 因为排序错误可能发生在3。虽然 qPCR 是验证 SNVs 和 CNVs 的有用工具, 但与 dPCR 相比, 它们的灵敏度较低。因此, dPCR 技术对处理稀有变种的遗传研究是有需求的。最近, 经液体活检发现的罕见变种与癌症的特点, 如耐药性, 已成为分子诊断和治疗的热门话题4。dPCR 技术似乎适合于液体活检研究, 预计在不久的将来将有重要的临床应用, 尽管有关动态范围和成本的改进仍需实施。
商业可用的 dPCR 技术大致可以分为液滴和基于芯片的平台;不同的是 DNA 模板是如何划分5,6,7。在 dPCR 与管状芯片的格式, PCR 混合物由毛细管作用分配到芯片上的分区。芯片是建立在八管条, 许多实验室工作人员将已经熟悉, 因此, 八样品可以处理一次8。在阅读步骤中, 通过检测芯片的整个图像而不是每个分区来处理96个样本需要 < 1 小时。由于 dPCR 与其他 dPCR 系统相比具有较高的吞吐量, 因此, 可用性和生产率是其用户的主要优势。
在本报告中, 以零星家族性腺瘤性息肉病患者的APC基因体细胞嵌合体为典型病例, 并比较 dPCR 和结果。本报告的主要目的是要清楚地量化一个单一核苷酸变体使用 dPCR 与芯片在一管格式。我们希望这份报告能帮助感兴趣的研究人员为自己的工作采用 dPCR 平台。
DIN 值通常用于评估被破坏的 DNA (例如, gDNA 从福尔马林固定石蜡嵌入组织) 在定量或排序之前, 因为 gDNA 的高级退化可能导致低质量数据。因此, DIN 评估已成为人类 gDNA11质量控制的重要一步。因为在代表性实验使用的 gDNA 在它从血液提取以后被存放了在4°c 为4–11年, 它的 DIN 价值被确定了为质量控制在 dPCR 试验之前。如果材料被怀疑损坏, 则特别推荐此步骤。gDNA 的浓度也由电泳法测定。由于 dPCR 的动态范围不像 qPCR 由于分区的局限性而宽, gDNA 浓度的测量是成功 dPCR 检测的重要步骤。由于输入 DNA 的数量与 dPCR 测定中变异和参考等位基因的总拷贝数相关 (R-平方 = 0.935;表 4), 电泳对测定 dPCR 测定前的 gDNA 浓度有很重要的意义。
加载和密封过程是成功结果的重要步骤。确定在平台上适当安装 PCR 混合物并确保芯片与平台之间的接触是至关重要的 (图 1A)。从滑块中的 PCR 混合物的凸出可能导致芯片上的分布无效.确认在位置图上的正和负分区的分布也需要精确分析, 因为在泊松统计中假定 DNA 模板被随机分成1室。在代表性的结果中, 在整个芯片中分布有正的分区 (图 3)。这一结果符合泊松统计的要求, 反映了加载和密封程序是有效的。当在密封增强器中设置管时, 如果顶盖的中心部分被推得太强 (图 1B), 芯片可能会断裂。要避免这种情况, 请轻轻推顶盖的边缘。如果存在正分区的人工簇 (图 1D), 则由于分区之间的交叉污染, 复制编号可能会过高估计。如果表面上可见一滩液体 (如图 1C) (例如, 通过依次重新运行密封增强剂1分钟), 则应改进密封过程。如果正分区分布不均匀 (图 1E), 则由于密封液和水的放大或污染不足, 复制数可能被低估。pcr 条件应在这种情况下调整 [例如, 通过调整温度或 pcr 的持续时间 (步骤3.11 的协议), 或确保密封流体和水倒入夹具是干净的]。从浸泡在蒸馏水中的8管条中检测出荧光信号。如果气泡附着在管表面, 就有可能干扰信号检测 (图 1F)。因此, 气泡应该使用一个工具, 如细吸管提示清除。此外, 空气气泡可能形成的管道内, 当他们设置在夹具 (图 1G)。如果管子内的气泡足够大, 足以覆盖芯片, 它们也应该被清除。气泡可能会清除, 如果他们在室温下离开几分钟。
在 NTC 中可能检测到一些积极的分区。为了避免 DNA 模板的污染, 保持工作台的清洁, 如果可能的话, 用风扇过滤单元制造一个干净的空间。如果怀疑 DNA 模板的污染, 彻底清除空间和/或丢弃使用过的试剂。相比之下, 如果在 gDNA 存在时未检测到参考等位基因的阳性分区, 请重新确认 gDNA、底漆和探针的浓度。值得注意的是, 与常规 PCR (表 1)12相比, 引物在代表性实验中使用的浓度较低。在常规 PCR 中, 确定斜坡速率是非常重要的, 这种速度很少改变。
是什么使 dPCR 与芯片在一管格式独特的是分割 PCR 混合物内的通用8管条8,13。该系统不需要将分区腔转移到 PCR 管中, 从而降低了污染风险。还有一个优势, 在 dPCR 系统与芯片在一管格式;它需要 < 4 小时完成96化验, 在该 dPCR 系统, 而它需要至少5小时完成相同数量的化验, 以液滴为基础的 dPCR14。此外, 通用8管带允许使用传统的热循环仪, 不像另一个基于芯片的 dPCR15, 这需要一个热循环仪与扁平块。此外, 常规 PCR 的积累知识和试剂也可应用于 dPCR 系统。这将有助于扩大 dPCR 的应用。
应该指出的是, dPCR 有几个限制。在 dPCR 中, 与其他 dPCR 平台相比, 芯片的分区数相对较低。对芯片设备的进一步改进将需要增加动态范围, 这取决于分区的数量。由于通用管的内部空间有限, 因此需要对芯片设备进行突破性设计, 以增加分区数量。未来整个 dPCR 程序的自动化将大大减少人为错误, 从而产生更可靠的结果。由于其高吞吐量和高灵敏度的性质, dPCR 与芯片内管的格式有望被应用于处理一些样品的液体活检和环境 DNA。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了日本促进科学学会 (15K08397) 对智明 Kahyo 的资助, 以及日本医学研究与发展署 (阿曼德) 的赠款 (927960719 号),为探索性研究提供的补助 (16K15256), 为促进全国大学管理费用赠款改革特别预算的相关项目支出 (1019253 号), 以及吸烟研究基金会, 以黑田东彦 Sugimura。作者感谢 Iwaizumi 博士和 Kurachi 博士的临床支持。出资人在编写手稿方面没有任何作用。图 3、图 4和表 4是根据 Kahyo等的文章改编和转载的。10, 征得 Elsevier 的许可。
QIAamp DNA Blood Maxi Kit | Qiagen | 51194 | Before Protocol 1: Extraction of genomic DNA |
NanoDrop 1000 | ThermoFisher SCIENTIFIC | ND-8000 | Before Protocol 1: Spectrophotometer |
8-strip tube | Agilent Technologies | 401428 | Protocol 1 |
Genomic DNA sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5366 | Protocol 1: A component of Genomic DNA Screen Tape Assay |
DNA ladder | Agilent Technologies | 5067-5366 | Protocol 1: A component of Genomic DNA Screen Tape Assay |
MS3 Basic Small Shaker | IKA | 3617000 | Protocol 1: Vortex mixer |
Genomic DNA ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5365 | Protocol 1: Gel device |
2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2965AA | Protocol 1: Electrophoresis instrument |
TapeStation Analysis Software | Agilent Technologies | Bundled with G2965AA | Protocol 1: Analysis software |
DNA oligo primers | IDT | Custom order | Protocol 2 |
LNA probes | IDT | Custom order | Protocol 2 |
Software tool | IDT | Web site: http://biophysics.idtdna.com/ | Protocol 2 |
dbSNP database | NCBI | Web site: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ | Protocol 2 |
TE buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12090015 | Protocol 3 |
DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher SCIENTIFIC | 10977015 | Protocol 3 (Table 1) |
Clarity Digital PCR Probe Mastermix | JN Medsys | 12013 | Protocol 3 (Table 1): 2xPCR Master Mix A component of #10011 |
Clarity Sealing Fluid | JN Medsys | 12005 | Protocol 3: Sealing fluid A component of #10011 |
Clarity JN Solution | JN Medsys | 12006 | Protocol 3 (Table 1): 20xdPCR solution A component of #10011 |
Clarity Tube-strip | JN Medsys | 12007 | Protocol 3: Chip-in-a-tube A component of #10011 |
Clarity Sample Loading Kit | JN Medsys | 12008 | Protocol 3: Loading platform and slider A component of #10011 |
Clarity Auto Loader | JN Medsys | 11002 | Protocol 3: Auto loader A component of #10001 |
Clarity Sealing Enhancer | JN Medsys | 11003 | Protocol 3: Sealing enhancer A component of #10001 |
Clarity Reader | JN Medsys | 11004 | Protocol 3: Reader A component of #10001 |
Life Eco Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | Protocol 3: Thermal cycler |
Clarity Software | JN Medsys | Bundled with #10001 | Protocol 3: Analysis software |
High Sensitivity D1000 screen tape | Agilent Technologies | 5067-5584 | Protocol 4: Gel device for high sensitivity |