Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Digitale Polymerase Chain Reaction Assay voor de genetische variatie in een sporadische familiale adenomateuze Polyposis patiënt met behulp van de Chip-in-a-tube-indeling

doi: 10.3791/58199 Published: August 20, 2018

Summary

Digitale polymerase-kettingreactie (PCR) is een nuttig hulpmiddel voor het opsporen van hoog-gevoeligheid van één nucleotide varianten en DNA kopie nummer varianten. Hier tonen we belangrijke overwegingen voor het meten van zeldzame varianten in het menselijk genoom digitale PCR met de chip-in-a-tube-indeling.

Abstract

De kwantitatieve analyse van menselijke genetische variatie is van cruciaal belang voor het begrip van de moleculaire kenmerken van ernstige medische aandoeningen, zoals tumoren. Omdat digitale polymerase-kettingreactie (PCR) in staat de precieze kwantificering van DNA kopie nummer varianten stellen, worden zij een essentieel instrument voor het opsporen van zeldzame genetische variaties, zoals resistente mutaties. Verwacht wordt dat moleculaire diagnose met behulp van digitale PCR (dPCR) beschikbaar zijn in de klinische praktijk in de nabije toekomst zullen; Dus, hoe efficiënt voeren dPCR met menselijk genetisch materiaal is een hot topic. Hier introduceren we een methode voor het detecteren van somatische mozaïcisme adenomateuze polyposis coli (APC) dPCR met de chip-in-a-tube-indeling, waardoor acht dPCR reacties op gelijktijdig worden uitgevoerd. Zorg moet worden genomen wanneer vullen en afdichten van het reactiemengsel op de chips. Dit artikel demonstreert hoe te voorkomen dat de over- en onderschatting van positieve partities. Bovendien presenteren we een eenvoudige procedure voor het verzamelen van het dPCR product van de partities op de chips, die vervolgens kunnen worden gebruikt om te bevestigen de specifieke versterking. Wij hopen dat dit verslag methoden zal helpen bevorderen van de dPCR met de methode van de chip-in-a-tube in genetisch onderzoek.

Introduction

Kwantitatieve PCR (qPCR) wordt vaak gebruikt voor het kwantificeren van menselijke genetische variatie, met inbegrip van één nucleotide varianten (SNVs) en DNA kopie aantal variaties (CNVs). In qPCR, een reactie van de polymerase in elke buis wordt uitgevoerd op dezelfde manier zoals in de conventionele eindpunt PCR en een versterking signaal na elke thermische cyclus van de buis wordt verworven. Daarentegen, in dPCR, wat betekent dat eindpunt dPCR in dit verslag de PCR-mix is geladen in vele microscopische kamers, partities genoemd, waar DNA sjablonen aanwezig of afwezig op een beperkende verdunning en elke partitie met PCR mengsel wordt beoordeeld als negatief of positief na de volledige PCR. Hoewel het gemakkelijk is om te schatten zijn er geen DNA-sjablonen in de negatieve partities, is het onduidelijk hoeveel exemplaren van DNA sjablonen in de positieve partities aanwezig zijn. Daarom is het aantal DNA templates in de positieve partities geschat op basis van de Poisson-verdeling, met behulp van de graaf van de negatieve partities1. dPCR is duurder en heeft een kleiner dynamisch bereik in vergelijking met qPCR, maar deze methode maakt een absolute kwantificering en biedt een hogere gevoeligheid en grotere precisie2.

Een van de belangrijkste toepassingen van dPCR is de validatie van de varianten die geïdentificeerd door sequentiebepaling van volgende-generatie (NGS). Vooral in het geval van zeldzame varianten, zin lage variant breuken, is validatie cruciaal vanwege sequencing fouten die in NGS3 optreden kunnen. Terwijl Sanger sequentie en qPCR zijn nuttige instrumenten voor de validering van SNVs en CNVs, de gevoeligheid is laag in vergelijking met dPCR. Daarom is de dPCR technologie in vraag naar genetische studies omgaan met zeldzame varianten. Onlangs, is de detectie door vloeibare biopsie van zeldzame varianten die aan de kenmerken van de kanker, zoals weerstand, een hot topic in moleculaire diagnostiek en therapie4geworden. De dPCR technologie lijkt geschikt voor vloeibare biopsie studies en naar verwachting hebben belangrijke klinische toepassingen in de nabije toekomst, hoewel verbeteringen aan het dynamisch bereik gerelateerde en kosten nog moeten worden uitgevoerd.

Verkrijgbare dPCR technologie kan grofweg worden onderverdeeld in druppel- en chip gebaseerde platformen; het verschil is hoe de DNA-sjablonen zijn gepartitioneerd5,6,7. De PCR-mix is de dPCR met chip-in-a-tube formaat verdeeld door de capillaire werking in de partities op een chip. De chips zijn ingebouwd in acht proefbuisjes strips, welke veel lab-medewerkers al bekend zijn met zullen, en dus, de acht monsters behandeld kunnen worden op één moment8. In de stap van lezing duurt het < 1 h voor de behandeling van 96 monsters door het detecteren van het hele beeld van de chip en niet elke partitie. Omdat dPCR met de chip-in-a-tube formaat een hoge-doorvoer in vergelijking met andere systemen van de dPCR heeft, zijn bruikbaarheid en productiviteit de belangrijkste voordelen voor de gebruikers.

In dit verslag, somatische mozaïcisme van de APC -gen bij een patiënt met sporadische familiale adenomateuze polyposis wordt gebruikt als een representatieve en de resultaten van dPCR en NGS worden vergeleken. Het belangrijkste doel van dit verslag is een variant van de single nucleotide dPCR met de chip-in-a-tube formaat duidelijk te kwantificeren. Wij hopen dat dit verslag nuttig voor onderzoekers ook geïnteresseerd is in de aanneming van het dPCR platform voor hun eigen werk.

Protocol

De studie ontwerp werd goedgekeurd door de institutionele beoordeling besturen van de Hamamatsu University School of Medicine (G-260-4). Schriftelijke geïnformeerde toestemming was verkregen van de patiënt en zijn ouders.

1. controle van de kwaliteit van Genomic DNA

Opmerking: Genomic DNA (gDNA) werd gewonnen uit perifeer bloed met de gevestigde silica membraan-gebaseerde DNA zuivering methode. Voorafgaand aan de onderstaande procedures, de concentratie van gDNA werd bepaald met behulp van een spectrofotometer.

  1. Het monster van de gDNA bij een concentratie van 10-100 ng/µL voor te bereiden.
  2. 10 µL van DNA monster buffer toevoegen aan een strip 8-buis.
  3. Voeg 1 µL van DNA-ladder of gDNA de buizen. Vortex het mengsel gedurende 1 min. met behulp van de microplate-bevestiging.
  4. Laden van de buis, de apparaat en Pipetteer uiteinden in de Elektroforese van het gel instrument (Tabel van materialen) en de run start door op de knop 'Start' te drukken.
    Opmerking: De Elektroforese van het systeem zal automatisch bedienen met één klik op de knop Start.
  5. Bevestig dat de onderste markering vervat in de DNA-monster buffer correct is toegewezen op de electropherograms. Als het ten onrechte is toegewezen, handmatig toe te wijzen van de markering in de 'Electroherogram-modus' van de software.
    Opmerking: Het DNA integriteit nummer (DIN) zal worden automatisch berekend. De DIN-waarde wordt opgehaald van de DNA-integriteit. Hoge en lage DIN waarden geven aan zeer intact en sterk aangetaste gDNA, respectievelijk.
  6. Geef de regio van de grootte van de gDNA (> 200 bp) in de 'regio modus' van de software voor het automatisch berekenen van de concentratie van gDNA (> 200 bp).

2. primer en sonde Design

  1. Berekenen van de smeltende temperatuur (Tm) waarden met behulp van een tool open toegang onder de volgende voorwaarden: 10 – 25 basen, 50 mM nb+/K+, dNTPs 0.80 mM en 3 mM Mg2 + (Tabel van materialen). Het ontwerp van de voorwaartse en omgekeerde inleidingen aan de genomic regio met doel allelen met de T-m waarde ongeveer 60 ° C en de lengte van de amplicon op 100-300 bp versterken.
    Opmerking: Zie tabel 1 voor de concentratie van oligonucleotides.
  2. Ontwerp het vergrendelde (LNA) geïntroduceerde nucleïnezuur probes voor de referentie- en variant allelen op basis van de volgende voorwaarden: (i) 1 – 6 LNAs aanwezig zijn in elke sonde; (ii) een fluorescente kleurstof en een quencher zijn aanwezig op de 5'- en de 3'-eindhaltes van elke sonde, respectievelijk; (iii) het verschil tussen de waarden van dem T van de gecompenseerde en niet-overeenkomende sondes is > 10 ° C; (iv) Tm -waarden van de gecompenseerde en niet-overeenkomende sondes zijn hoger en lager dan die van de primers, respectievelijk [bijvoorbeeld, voorwaartse primer: 60.8 ° C, omgekeerde primer: 59.8 ° C, referentie-allel sonde (evenementen/verkeerde): 62.6/45.3 ° C, variant allel sonde (evenementen/verkeerde): 61.7/50.5 ° C]. De Tm waarden werden berekend aan de hand van de open access-hulpprogramma ook gebruikt voor stap 2.1.
  3. Zorg ervoor dat de ontworpen primers en sondes doen niet omvatten de single nucleotide polymorphisms met een frequentie van > 0.1% zoals bepaald uit databases [bijvoorbeeldde Single Nucleotide Polymorphism database (dbSNP)].

3. digitale PCR

  1. De inleidingen, sondes en stamoplossingen van het gDNA in de concentraties die zijn beschreven in tabel 1 met een buffer TE bereiden en bewaar ze op -20-4 ° C.
  2. Meng de reagentia bij kamertemperatuur in een totaal volume van 15 µL tot een uiteindelijke concentratie zoals beschreven in tabel 1.
    1. Voeg 3 µL van gedistilleerd water in plaats van gDNA in een neen-template besturingselement (NTC).
    2. 3.5 x het bedrag van het PCR-mengsel in drievoud ter verantwoording voor de pipetting fout voor te bereiden.
  3. Pipetteer de PCR-mix op en neer om te mengen.
  4. Stelt het laadplatform op de chips die is gebouwd in de strook 8-buis en hen op de autoloader. Zorg ervoor dat er een contact tussen de chip en het laadplatform.
  5. Past een schuifregelaar laden op het perron en houd de schuifregelaar met de stop op de lader.
  6. Pipetteer 15 µL van het PCR-mengsel op het platform, nabij de monding van de schuifregelaar(Figuur 1).
  7. De loader uitvoeren door op de knop van de lader (voor ongeveer 1 minuut).
    Opmerking: Het is niet een probleem als een kleine hoeveelheid PCR mengsel op het platform blijft. Het is mogelijk aan sequentieel rerun de loader.
  8. De chip-in-a-tube gevuld met PCR mengsel in de sleuf van de kant van de verzegeling enhancer instellen Duw het deksel van de dia en de rand van het bovendeksel niet breken de chip (Figuur 1B).
  9. Voer de verzegeling enhancer (ongeveer 2 min). Sequentieel rerun de verzegeling enhancer voor 1 min als een plas van vloeistof nog steeds zichtbaar, is omdat een onvolledige afdichting een kruisbesmetting van de positieve signalen (cijfers 1 c en 1 D veroorzaakt).
  10. Voeg 230 µL van verzegeling vloeistof, een olie-gebaseerde reagens, de buizen.
    Opmerking: De chips moeten nu worden ondergedompeld in de vloeistof.
  11. Stel de buizen in de thermische cycler. Voer de thermische cycler zoals beschreven in tabel 2 (voor ongeveer 2 h). Tune de temperatuur of de duur van de PCR als er een ongelijke verdeling van positieve partities (Figuur 1E).
    Opmerking: Het wordt aanbevolen om de oprit tarief ingesteld op ongeveer 1 ° C/s.
  12. Laat de buizen in de thermische cycler gedurende ten minste 15 minuten ter vermindering van het lawaai van de basislijn.
    Opmerking: De buizen kunnen worden overgelaten 's nachts ook. Fluorescentie signalen werden zelfs de volgende dag ontdekt.
  13. Zet de buizen op de mal detectie en 6 mL gedestilleerd water giet in de mal. Als luchtbellen zichtbaar binnen en buiten de buizen zijn, schakelt u hen (cijfers 1F en 1 G).
  14. Laad de mal in de detector en draaien met een klik op de knop 'Run' van de software na de selectie van Fluorescene, Experiment en monster/NTC tabbladen (Tabel van materialen).
    Opmerking: De detectie van dubbele kleur van acht monsters met een standaard-intensiteit neemt ongeveer 4-5 min.
  15. Bevestig de positie plot, histogram en 2D scatterplot.
    Opmerking: iIf de intensiteit van de fluorescentie van de negatieve partities is hoog, past u de intensiteit met een klik op de knop van de instellingen van de software zodat het valt binnen het bereik van 30-70.
  16. Bereken de variant allel breuk (VAF) met de volgende formule:
    Equation 1
    Cv en Cr hier de nummers van de kopie van de variant en de referentie-allel, respectievelijk.
    Opmerking: Ze worden automatisch berekend in het softwareprogramma op basis van Poisson statistieken.

4. verzameling van PCR Product

  1. Verwijder de verzegeling vloeistof uit de tube.
  2. Voeg 100 µL van de buffer TE aan de buis. Vortex krachtig gedurende 30 s en kort centrifuge de buis.
  3. Breng de oplossing TE over in een andere buis en 30 µL van 3 M natriumacetaat en 200 µL van ethanol toevoegen.
  4. Koel de oplossing bij-20 ° C's nachts.
  5. De oplossing voor 30 min bij 16.000 x g centrifugeren en verwijder de bovendrijvende substantie.
  6. Voeg 300 µL van 80% ethanol tot de buis en vortex.
  7. De oplossing voor 15 min bij 16.000 x g centrifugeren en verwijder de bovendrijvende substantie. Laat het neerslag gedurende 5 minuten drogen.
  8. Los het precipitaat op in 1-5 µL van TE buffer na droging.
  9. Indien nodig, beoordelen de grootte van het product met behulp van een instrument van de elektroforese onder verwijzing naar stap 1. Laden 1 µL van de oplossing naar het apparaat van de gel voor een hoge gevoeligheid (Tabel van materialen).

Representative Results

We bezien de somatische mozaïcisme van de APC -gen bij een patiënt met sporadische familiale adenomateuze polyposis volgens de hierboven beschreven procedures. In een eerdere studie, de APC -c.834 + 2T > C mutatie werd gevonden in de patiënt, maar niet in hun ouders, met behulp van Sanger sequencing en NGS9. De ontwerpen van de primers en sondes gebruikt in de representatieve resultaten worden weergegeven in tabel 3. Genomic DNA werd onttrokken aan het bloed van de proband, de ouders en zes gezonde donoren. De DIN-waarden van de negen gDNA monsters varieerden tot 6.7-7,9 (Figuur 2 en tabel 4). FAM en HEX werden gebruikt als de fluorescentie kleurstoffen voor de C en T allelen, respectievelijk. De groene en gele vlekken op de percelen standpunt vertegenwoordigen FAM-positieve en HEX-positieve partities, respectievelijk (Figuur 3A). De blauwe plekken vertegenwoordigen negatieve partities voor FAM zowel HEX. De zwarte achtergrond komt overeen met partities waar het reactiemengsel is niet toegevoegd. Veel positieve partities van de C en T allelen werden ontdekt in de proband, terwijl enkele positieve partities van het C-allel werden ontdekt in de proband de vader of de NTC en, in de laatste, positieve partities van de T allel niet zijn waargenomen. De signaal-scheiding tussen de allelen C en T was duidelijk op de twee-dimensionale (2D) scatterplot, en de meest positieve signalen van HEX en FAM waren exclusief elkaar (Figuur 3B). Het VAF van de proband was 13,2%, wat vergelijkbaar is met die bepaald met behulp van NGS (12,7%) (Tabel 4). De VAFs van de proband van ouders en gezonde donoren waren < 0,1%. De aantoonbaarheidsgrens voor de APC -c.834 + 2T > C mutatie werd geschat op 0,3% met behulp van 3 x de standaarddeviatie voor de herhaalde metingen met 10 – 11 ng van de totale gDNA10.

De grootte van de amplicon in de dPCR assay voor APC c.834 + 2T > C werd voorspeld als 123 bp. Om te bevestigen dat het product van de dPCR werd versterkt als een enkele band, werd het dPCR product bijeengezocht uit de chip getest. Met behulp van elektroforese, een enkele band was duidelijk gedetecteerd en wordt de grootte van het product in overeenstemming was met de voorspelling (Figuur 4).

Figure 1
Figuur 1 : Punten om op te merken voor de dPCR-assay met chip-in-a-tube formaat. (A) dit paneel toont hoe de strook 8-buis in de autoloader instelt. (B) dit paneel toont gebroken chips. (C) dit paneel toont hoe de chip oppervlakken onmiddellijk na (i) laden en (ii) afdichting. (iii) een plas van vloeistof is zichtbaar in het geval van een onvolledige sluiting. (D) dit paneel toont de plot van de positie in het geval van een kruisbesmetting. (E) dit paneel toont de plot van de positie in het geval van een ongelijke verdeling. (F) dit paneel toont luchtbellen hoe op het oppervlak van de buis ondergedompeld in water. (G) dit paneel toont luchtbellen binnenkant van de buis. Gedurende de hele figuur, zwart-witprinter pijlpunten geven gebroken chip stukken en luchtbellen, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Vertegenwoordiger electropherograms van bloed gDNA. Electropherograms van de bloed-gDNA met DIN waarden van 6,7 en 7,9 worden weergegeven in de bovenste en onderste paneel, respectievelijk. Het sterretje geeft aan dat een lagere marker. DIN: DNA integriteit nummer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Representatieve resultaten van APC somatische mozaïcisme dPCR met de chip-in-a-tube formaat. (A) de positie percelen en (B) scatterplots van de controle van de neen-template (NTC), het proband en de vader worden hier getoond. HEX en FAM komen overeen met de referentie- en variant allelen, respectievelijk. Verticale en horizontale lijnen geven de drempels van HEX en FAM intensiteiten, respectievelijk. Dit cijfer is gewijzigd van Kahyo et al. 10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Verzameling van dPCR producten van de chip getest. De verzamelde en geconcentreerde dPCR producten werden onderworpen aan elektroforese. De voorspelde doelgrootte was 123 bp. Dit cijfer is gewijzigd van Kahyo et al. 10. NTC: neen-sjabloon controle. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Reagens Concentratie
van stockoplossing
Volume (l) Eindconcentratie Aanbevolen
eindconcentratie
DNase/RNase-vrij gedistilleerd Water - 1,75 - -
2 x PCR Master mix - 7.5 - -
LNA sonde voor grote allel 2 ΜM 0,5 66,7 nM 3,33 – 100 nM
LNA sonde voor kleine allel 2 ΜM 0,5 66,7 nM 3,33 – 100 nM
Voorwaartse primer 1 ΜM 0,5 33.3 nM 3,33 – 50,0 nM
Omgekeerde primer 1 ΜM 0,5 33.3 nM 3,33 – 50,0 nM
20 x dPCR oplossing - 0,75 - -
gDNA 3.33 ng/μL 3 666 pg/μL 20 pg/μL-2.000 pg/μL1

Tabel 1: voor de dPCR assay gebruikte reagentia. 1 Afhankelijk van de verwachte precisie en gevoeligheid.

Stap Temperatuur Tijd Cycli
Initiële denatureren 95 ° C 5 m 1
Denatureren
Gloeien en uitbreiding
95 ° C
58 ° C
50 s
90 s
42
Laatste uitbreiding 70 ° C 5 m 1

Tabel 2: Thermische cycler voorwaarden.

Naam Reeks1 Tm waarde2
Voorwaartse primer 5'-GGTCAAGGAGTGGGAGAAATC-3 ' 60.8 ° C
Omgekeerde primer 5'-TCTTAGAACCATCTTGCTTCATACT-3 ' 59.8 ° C
LNA sonde voor T-allel 5'-HEX-ATTT [A] CCTGACCA-IBFQ-3' Evenementen: 62.6 ° C
Niet-overeenkomende: 45.3 ° C
LNA sonde voor C-allel 5'-FAM-TTT [G] CCTGACC-IBFQ-3' Evenementen: 61.7 ° C
Niet-overeenkomende: 50.5 ° C

Tabel 3: ontwerp van de primers en sondes. 1 Onderstreepte letters tussen haakjes zijn de LNA en doelgerichte variant, respectievelijk. 2 Berekend op basis van stap 2 van het protocol.

NGS3 dPCR4
Monster1 Weefsel Input DNA (ng) DIN2 VAF (%) Variant (kopieën) Referentie (kopieën) VAF (%)
Gemiddelde RSD
NTC - - - - 1.23 0 N/B N/B
Proband Bloed 11.3 7.6 12.7 379 2,48 x 103 13.2 0.0353
Vader Bloed 10.3 7.7 0.0167 1.08 3.42 x 103 0.0341 0.439
Moeder Bloed 10,8 7.6 0.0136 0.956 3.04 x 103 0.0313 0.637
Donor-1 Bloed 11.7 7.3 - 1.64 3.01 x 103 0.0543 0.414
Donor-2 Bloed 10.5 7.6 - 1,06 2.90 x 103 0.0406 0.539
Donor-3 Bloed 17,6 7,9 - 4.24 5,65 x 103 0.0713 0.783
Donor-4 Bloed 12.3 7.6 - 2.38 4.16 x 103 0.0666 0.557
Donor-5 Bloed 19.2 7 - 1.48 6.79 x 103 0.0213 0.571
Donor-6 Bloed 14.4 6.7 - 3.44 4.67 x 103 0.0728 0.729

Tabel 4: resultaten van de dPCR assay voor APC somatische mozaïcisme. 1 NTC: neen-template controle; Donateur: gezonde donor. 2 DIN: DNA integriteit nummer. 3 Iwaizumi et al. 9, hum genoom Var. 2 15057 (2015). 4 De experimenten werden uitgevoerd in drievoudige en onafhankelijk herhaalde 3 x; de gegevens worden uitgedrukt als de gemiddelde waarde; RSD: relatieve standaardafwijking; N/A: niet van toepassing. De tabel is gewijzigd van Kahyo et al. 10.

Discussion

De DIN-waarde wordt vaak gebruikt ter beoordeling van beschadigde DNA (b.v., gDNA van formaline-vaste paraffine-ingebedde weefsel) vóór kwantificering of sequencing, omdat een geavanceerde achteruitgang van de gDNA in lage kwaliteit gegevens resulteren kan. DIN beoordeling, zo wordt een belangrijke stap in de kwaliteitscontrole van menselijke gDNA11. Aangezien de gDNA gebruikt in het representatieve experiment was opgeslagen bij 4 ° C 4-11 jaar na de winning uit bloed, werden haar DIN-waarden bepaald voor een kwaliteitscontrole voor de bepaling van de dPCR. Deze stap wordt met name aanbevolen als de materialen worden verdacht te zijn beschadigd. De concentratie van gDNA werd ook bepaald door elektroforese. Want het dynamische bereik van dPCR niet zo breed als voor qPCR als gevolg van de beperkingen van de partities is, is een meting van de concentratie van gDNA een belangrijke stap voor een succesvolle dPCR assay. Als de hoeveelheid van input DNA was gecorreleerd met het totale exemplaaraantal van de variant en verwijzing allelen in de bepaling van de dPCR (R-kwadraat = 0.935; Tabel 4), elektroforese is nuttig voor het meten van de concentratie van de gDNA voor de bepaling van de dPCR.

Het laden en het afdichten van processen zijn belangrijke stappen voor succesvolle resultaten. Het is cruciaal dat de juiste montage van de PCR-mix op het platform te bevestigen en zorgen voor contacten tussen de chip en het platform (Figuur 1A). Uitsteeksel van PCR mengsel van de schuifregelaar kan ongeldige distributie veroorzaken op de chip. Bevestiging van de verdeling van de positieve en negatieve partities op een perceel van standpunt is ook noodzakelijk voor een nauwkeurige analyse, omdat wordt uitgegaan van in Poisson statistieken dat DNA sjablonen willekeurig worden gepartitioneerd in kamers1. In de representatieve resultaten, werden positieve partities verspreid in de chip (Figuur 3). Dit resultaat voldoet aan de eis voor de Poisson statistiek en weerspiegelt dat het laden en het afdichten van procedures effectief waren. Bij de vaststelling van de buizen in de afdichting enhancer, de chips worden verbroken als het centrale gedeelte van het bovendeksel wordt geduwd te sterk (Figuur 1B). Om dit te vermijden, duw voorzichtig de rand van het bovendeksel. Als er een kunstmatige cluster van positieve partities (Figuur 1D), kan het exemplaaraantal als gevolg van een kruisbesmetting tussen partities worden overschat. De afdichting procedure dient te worden verbeterd als zichtbaar op het oppervlak (Figuur 1C) is een plas van vloeistof (bijvoorbeelddoor de verzegeling enhancer voor 1 min achter elkaar opnieuw uit te voeren). Als er een ongelijke verdeling van positieve partities (Figuur 1E), kan het exemplaaraantal als gevolg van onvoldoende versterking of besmetting van de verzegeling vloeistof en water worden onderschat. De PCR voorwaarden moeten worden aangepast in dit geval [bijvoorbeelddoor tuning de temperatuur of de duur van de PCR (stap 3.11 van het protocol) of door ervoor te zorgen dat de afdichting vloeistof en water in de mal gegoten schoon]. Fluorescentie signalen worden ontdekt van de strip van de 8-vormige buis ondergedompeld in gedestilleerd water. Als luchtbellen aan het oppervlak van de buis houden, is er de mogelijkheid dat zij met het signaal detectie (figuur 1F interfereren kunnen). Daarom moeten bubbels worden gewist met behulp van een hulpmiddel, zoals een fijne pipette uiteinde. Bovendien, kunnen luchtbellen vormen binnen de buizen wanneer ze zijn ingesteld in de mal (Figuur 1G). Als de bubbels in de buizen groot genoeg zijn ter dekking van de chip, moeten ze ook worden gewist. De bubbels kunnen wissen als ze worden gelaten voor enkele minuten bij kamertemperatuur.

Sommige positieve partities mogelijk worden gedetecteerd in de NTC. Om te voorkomen dat een besmetting van de DNA-sjablonen, de Bank schoon te houden en, indien mogelijk, het maken van een schone ruimte met een ventilator filter eenheid. Als een van de DNA-sjablonen vermoed wordt, grondig reinigen van de ruimte en/of verwijderen van de gebruikte reagentia. Daarentegen, als de positieve partities van het referentie-allel niet in de aanwezigheid van gDNA gevonden zijn, bevestigen de concentraties van de gDNA, inleidingen en sondes. Met name werden de inleidingen gebruikt in een lagere concentratie in het representatieve experiment, in vergelijking met conventionele PCR (tabel 1)12. Het is ook cruciaal voor het bevestigen van de oprit tarief, die bijna nooit wordt gewijzigd in conventionele PCR.

Wat dPCR met de chip-in-a-tube formaat uniek maakt is het partitioneren van de PCR-mix binnen de universele 8-buis strip8,13. Een overdracht van de partitionering kamers in een PCR-buis is niet verplicht in dit systeem, waardoor het risico op besmetting. Er is ook een voordeel in het dPCR systeem met chip-in-a-tube formaat; duurt het < 4 h tot finish 96 testen in dat systeem van dPCR, terwijl het duurt ten minste 5 uur tot finish hetzelfde aantal testen in druppel gebaseerde dPCR14. De universele 8-buis strip maakt bovendien het gebruik van een conventionele thermische cycler, in tegenstelling tot een andere chip gebaseerde dPCR15, waarvoor een thermische cycler met een platte blok. Ook kunnen de opgebouwde kennis en reagentia voor conventionele PCR worden toegepast op het systeem van de dPCR. Dit is nuttig voor het uitbreiden van de toepassingen van dPCR.

Opgemerkt moet worden dat dPCR heeft verschillende beperkingen. In dPCR met de chip-in-a-tube formaat is het partitienummer van de chip relatief laag vergeleken met die van andere platformen dPCR. Verdere verbetering van de chip-apparaat zal moeten verhogen van het dynamisch bereik, die afhangt van het aantal partities. Omdat de interne ruimte van de universele buis beperkt is, is een ontwerp van de doorbraak voor de chip-apparaat vereist voor het verhogen van het aantal partities. De automatisering van het hele dPCR-procedure in de toekomst zou aanzienlijk minder menselijke fouten, resulterend in nog meer betrouwbare resultaten. Vanwege het karakter van high-throughput en hoog-gevoeligheid, wordt de dPCR met chip-in-a-tube formaat verwacht te worden toegepast voor de behandeling van een aantal monsters voor vloeibare biopsieën en milieu DNA.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door een Grant-in-Aid voor Scientific Research (C) van de Japan Society voor de promotie van wetenschap (JSPS) (nr. 15 K 08397) naar Tomoaki Kahyo, en subsidies uit het Japan Agency voor medisch onderzoek en ontwikkeling (AMED) (nr. 927960719), Grant-in-Aid voor verkennend onderzoek (nr. 16K 15256), uitgaven voor gekoppelde projecten van een Incentive speciale begroting voor de bevordering van een hervorming van de nationale universiteit in Management kosten subsidies (nr. 1019253) en de rookvrije Research Foundation te Haruhiko Sugimura. De auteurs bedanken Dr Iwaizumi en Dr Kurachi voor hun klinische steun. De financiers had geen rol in de voorbereiding van het manuscript. Figuur 3, Figuur 4en tabel 4 worden aangepast en herdruk van een artikel door Kahyo et al. 10, met toestemming van Elsevier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QIAamp DNA Blood Maxi Kit Qiagen 51194 Before Protocol 1: Extraction of genomic DNA
NanoDrop 1000 ThermoFisher SCIENTIFIC ND-8000 Before Protocol 1: Spectrophotometer
8-strip tube Agilent Technologies 401428 Protocol 1
Genomic DNA sample buffer Agilent Technologies 5067-5366 Protocol 1:
A component of Genomic DNA Screen Tape Assay
DNA ladder Agilent Technologies 5067-5366 Protocol 1:
A component of Genomic DNA Screen Tape Assay
MS3 Basic Small Shaker IKA 3617000 Protocol 1: Vortex mixer
Genomic DNA ScreenTape Agilent Technologies 5067-5365 Protocol 1: Gel device
2200 TapeStation system Agilent Technologies G2965AA Protocol 1: Electrophoresis instrument
TapeStation Analysis Software Agilent Technologies Bundled with G2965AA Protocol 1: Analysis software
DNA oligo primers IDT Custom order Protocol 2
LNA probes IDT Custom order Protocol 2
Software tool IDT Web site: http://biophysics.idtdna.com/ Protocol 2
dbSNP database NCBI Web site: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ Protocol 2
TE buffer ThermoFisher SCIENTIFIC 12090015 Protocol 3
DNase/RNase-Free Distilled Water ThermoFisher SCIENTIFIC 10977015 Protocol 3 (Table 1)
Clarity Digital PCR Probe Mastermix JN Medsys 12013 Protocol 3 (Table 1): 2xPCR Master Mix
A component of #10011
Clarity Sealing Fluid JN Medsys 12005 Protocol 3: Sealing fluid
A component of #10011
Clarity JN Solution JN Medsys 12006 Protocol 3 (Table 1): 20xdPCR solution
A component of #10011
Clarity Tube-strip JN Medsys 12007 Protocol 3: Chip-in-a-tube
A component of #10011
Clarity Sample Loading Kit JN Medsys 12008 Protocol 3: Loading platform and slider
A component of #10011
Clarity Auto Loader JN Medsys 11002 Protocol 3: Auto loader
A component of #10001
Clarity Sealing Enhancer JN Medsys 11003 Protocol 3: Sealing enhancer
A component of #10001
Clarity Reader JN Medsys 11004 Protocol 3: Reader
A component of #10001
Life Eco Thermal Cycler Bioer Technology TC-96GHbC Protocol 3: Thermal cycler
Clarity Software JN Medsys Bundled with #10001 Protocol 3: Analysis software
High Sensitivity D1000 screen tape Agilent Technologies 5067-5584 Protocol 4: Gel device for high sensitivity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Majumdar, N., Wessel, T., Marks, J. Digital PCR modeling for maximal sensitivity, dynamic range and measurement precision. PLoS One. 10, (3), 0118833 (2015).
  2. Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clinical Chemistry. 59, (6), 892-902 (2013).
  3. Chen, L., Liu, P., Evans, T. C., Ettwiller, L. M. DNA damage is a pervasive cause of sequencing errors, directly confounding variant identification. Science. 355, (6326), 752-756 (2017).
  4. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy. Cancer Discovery. 6, (5), 479-491 (2016).
  5. Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Analytical Chemistry. 80, (23), 8975-8981 (2008).
  6. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, (22), 8604-8610 (2011).
  7. Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314, (5804), 1464-1467 (2006).
  8. Low, H., Chan, S. J., Soo, G. H., Ling, B., Tan, E. L. Clarity™ digital PCR system: a novel platform for absolute quantification of nucleic acids. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, (7), 1869-1875 (2017).
  9. Iwaizumi, M., et al. A novel APC mosaicism in a patient with familial adenomatous polyposis. Human Genome Variation. 2, 15057 (2015).
  10. Kahyo, T., et al. Application of digital PCR with chip-in-a-tube format to analyze Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism. Clinica Chimica Acta. 475, 91-96 (2017).
  11. Kanai, Y., et al. The Japanese Society of Pathology Guidelines on the handling of pathological tissue samples for genomic research: Standard operating procedures based on empirical analyses. Pathology International. 68, (2), 63-90 (2018).
  12. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  13. Cao, L., et al. Advances in digital polymerase chain reaction (dPCR) and its emerging biomedical applications. Biosensors and Bioelectronics. 90, 459-474 (2017).
  14. Bio-Rad Laboratories. Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/Isr/literature/Bulletin_6311.pdf (2018).
  15. Thermo Fisher Scientific. Available from: https://www.garvan.org.au/research/capabilities/molecular-genetics/documents/qs-3d-user-guide.pdf (2013).
Digitale Polymerase Chain Reaction Assay voor de genetische variatie in een sporadische familiale adenomateuze Polyposis patiënt met behulp van de Chip-in-a-tube-indeling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kahyo, T., Sugimura, H. Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format. J. Vis. Exp. (138), e58199, doi:10.3791/58199 (2018).More

Kahyo, T., Sugimura, H. Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format. J. Vis. Exp. (138), e58199, doi:10.3791/58199 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter