디지털 연쇄 반응 (PCR) 단일 뉴클레오티드 이체와 DNA 복사 번호 이체의 고감도 검출을 위한 유용한 도구입니다. 여기, 칩에 튜브 형식으로 디지털 PCR를 사용 하 여 인간 게놈에 있는 드문 이체를 측정 하기 위한 주요 고려 사항을 설명 합니다.
인간 유전 변이의 정량 분석은 심각한 의료 조건, 종양 등의 분자 특성을 이해 하는 데 중요 합니다. 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) DNA 복사 번호 이체의 정확한 정량화를 사용 하기 때문에 그들은 약물 내성 돌연변이 등 희귀 유전자 변이 검출을 위한 필수적인 도구가 되고있다. 그것은 것으로 예상 된다 디지털 PCR (dPCR)를 사용 하 여 분자 진단 임상 연습에서 사용할 수 있는 가까운 미래에; 따라서, 인간의 유전 물질과 dPCR를 효율적으로 수행 하는 방법 뜨거운 주제가입니다. 여기, 용 대 대장균 (APC) 신체적인 mosaicism 8 dPCR 반응을 동시에 실시 될 수 있는 칩에 튜브 형식으로 dPCR를 사용 하 여 검색 하는 방법을 소개 합니다. 채우고는 및 밀봉 칩에 반응 혼합물 때 주의 해야 합니다. 이 문서에서는 오버 및 긍정적인 파티션의 과소를 방지 하는 방법을 보여 줍니다. 또한, 우리는 특정 증폭을 확인 하는 데 사용 될 수 있는 칩에는 파티션에서 dPCR 제품을 수집 하기 위한 간단한 절차를 제시. 우리는이 방법을 보고서는 dPCR 유전자 연구에서 칩–튜브 방법으로 홍보 도움이 될 것입니다 바랍니다.
정량 PCR (정량) 단일 뉴클레오티드 변종 (SNVs)를 포함 한 인간의 유전 변이 그리고 DNA 복사 번호 유사 (CNVs) 척도를 자주 사용 됩니다. 정량, 중 합 효소 반응 기존의 끝점 PCR에서 같은 방식으로 각 튜브에서 수행 됩니다 그리고 모든 열 주기 후 튜브에서 증폭 신호 획득. 대조적으로,이 보고서에 끝점 dPCR를 의미 하는 dPCR에 PCR 혼합에 로드 많은 현미경 챔버, 파티션 되 나, DNA 템플릿은 제시 또는 제한 희석 및 모든 파티션에 포함 된 PCR 혼합으로 평가에 결 석 음수 또는 완전 한 PCR 후 긍정적인. 부정적인 파티션에 있는 DNA는 서식 파일이 없습니다는 추정 하기 쉬운 반면, 그것 아니다 분명 DNA 서식 파일의 복사본은 긍정적인 파티션에 존재. 따라서, 긍정적인 파티션 서식 파일 DNA의 수는 부정적인 파티션1에서 수 포아송 분포에 따라 견적입니다. dPCR는 더 비싼 및 정량에 비해 작은 동적 범위는 하지만이 메서드는 절대 정량화를 가능 하 게 제공 하는 높은 감도 및 더 큰 정밀2.
DPCR의 주요 응용 프로그램 중 하나입니다 차세대 시퀀싱 (NGS)에 의해 식별 된 이체의 유효성 검사. 희소 한 이체, 의미 낮은 변형 분수의 경우 특히 유효성 검사는 NGS3에서 발생할 수 있는 시퀀싱 오류로 인해 중요 합니다. 동안 생어 시퀀싱 및 정량 SNVs 및 CNVs의 유효성 검사에 대 한 유용한 도구, 그들의 감도 dPCR에 비해 낮은. 따라서, dPCR 기술은 드문 이체 처리 하는 유전자 연구에 대 한 수요 이다. 최근, 약물 저항 같은 암 특성에 관련 된 드문 이체의 액체 생 검에 의해 감지 분자 진단 및 치료4에 화제가 되고있다. DPCR 기술 액체 생 검 연구에 적합 나타나고 개선 동적 범위와 관련 된 고 비용 구현 될 필요는 가까운 장래에, 중요 한 임상 응용을가지고 것으로 예상 된다.
상업적으로 사용할 수 있는 dPCR 기술은 드롭릿 및 칩 기반 플랫폼;으로 대략 분류 될 수 있다 차이점은 어떻게 DNA 템플렛은 분할 된5,,67. 칩에 튜브 형식으로 dPCR에 PCR 혼합 칩에 분할으로 모 세관 작용에 의해 배포 됩니다. 칩 내장 8 튜브 스트립,는 많은 실험실 직원은 이미 잘 알고 있을 것입니다, 그리고, 따라서, 8 개의 샘플 한 시간8에 대우 될 수 있다. 읽기 단계에서 < 96 샘플 칩 및 아니라 각 분할의 전체 이미지를 감지 하 여 치료를 1 시간 걸립니다. 칩에 튜브 형식으로 dPCR는 다른 dPCR 시스템에 비해 높은 처리량, 이후 성과 생산성은 사용자를 위한 주요 장점이 있습니다.
이 보고서에서 산발적 인 가족 용 대 환자의 APC 유전자의 신체적인 mosaicism 대표적인 경우로 사용 되 고 dPCR 그리고 NGS의 결과 비교. 이 보고서의 주요 목적은 명확 하 게 계량 칩에 튜브 형식으로 dPCR를 사용 하 여 단일 뉴클레오티드 변종 이다. 우리는이 보고서가 채택 하는 그들의 자신의 일에 대 한 dPCR 플랫폼에 관심 있는 연구원을 위한 도움이 바랍니다.
DIN 값은 gDNA의 고급 저하 낮은 품질 데이터에 발생할 수 있습니다 때문에 정량화 또는 시퀀싱 하기 전에 손상 된 DNA (예를 들면, 포 르 말린 고정 파라핀 끼워 넣어진 조직 으로부터 gDNA)을 평가 하기 위해 자주 사용 됩니다. DIN 평가, 따라서 되고있다 인간 gDNA11의 품질 관리에 중요 한 단계. 대표적인 실험에 사용 된 gDNA 혈액에서 자사의 추출 후 4-11 년 4 ° C에서 저장 했다, 이후 DIN 값 dPCR 분석 결과 전에 품질 관리에 대 한 결정 했다. 이 단계는 특히 좋습니다 자료 손상 된 것으로 의심 되는 경우. GDNA의 농도 또한 전기 이동 법에 의해 결정 되었다. DPCR의 동적 범위를 없기 때문에 정량의 제한 때문에 관해서는 넓은 gDNA 농도의 측정 성공적인 dPCR 분석 결과 대 한 중요 한 단계 이다. DNA dPCR 분석 결과에서 변형 및 참조 대립 유전자의 총 복사본 수 상관은 입력 금액으로 (R-제곱 = 0.935; 표 4), 전기 이동 법은 dPCR 분석 결과 전에 gDNA 농도 측정 하는 데 유용 합니다.
로드 및 프로세스를 씰링 성공적 결과 대 한 중요 한 단계가 있습니다. 그것은 플랫폼에 PCR 혼합물의 적절 한 설치를 확인 하 여 칩과 플랫폼 (그림 1A) 사이의 접촉 되도록 중요 합니다. 슬라이더에서 PCR 혼합물의 돌출 칩. 에 잘못 된 메일을 발생할 수 있습니다. 위치에 긍정적이 고 부정적인 파티션의 분포를 확인 하는 것은 DNA 템플렛은 임의로 챔버1분할 포아송 통계에서 가정 때문에 정확한 분석을 위해 필요한 또한. 대표 결과에 긍정적인 파티션은 칩 (그림 3)를 통해 배포 했다. 이 결과 포아송 통계에 대 한 요구 사항을 충족 하 고 로드 하 고 절차를 밀봉 했다 효과적인 반영 합니다. 씰링 증강에 튜브를 설정할 경우 칩 수 깨진 최고 뚜껑의 중앙 부분을 너무 강하게 누르면 (그림 1B). 이 방지 하려면 최고 뚜껑의 가장자리를 밀어 부드럽게. 긍정적인 파티션 (그림 1의D)의 인공 클러스터 경우 복사본 수 파티션 사이 교차 오염 때문과 대 수 있습니다. 액체의 물 웅덩이 표면 (그림 1C)에 표시 되 면 봉인 절차 개선 되어야 합니다 (예:순차적으로 1 분 동안 봉인 증강을 다시 실행 하 여). 긍정적인 파티션 (그림 1E)의 고르지 못한 배급이 있는 경우에, 복사 수 부족 증폭 또는 씰링 액체 및 물 오염 과소평가 될 수 있습니다. 이 경우 [예를들면, 온도 또는 PCR (단계 3.11 프로토콜)의 기간을 조정 또는 씰링 액체와 지 그에 부 어 물이 깨끗 하 여] PCR 상태를 조정 한다. 형광 신호는 증류수에 8 튜브 스트립에서 검색 됩니다. 기포 관 표면에 준수, 신호 검출 (그림 1 층) 방해할 수 가능성이 있다. 따라서, 거품이 미세 피 펫 팁 등의 도구를 사용 하 여 허가 한다. 또한, 지 그 (그림 1G)에 설정 하는 경우 튜브 안에 공기 방울 형태 수도 있습니다. 튜브 내부 거품 칩을 충당 하기 위해 충분히 큰 경우에, 그들은 삭제도 한다. 그들은 실 온에서 몇 분 동안 남아 거품 수 있습니다 선택을 취소 합니다.
일부 긍정적인 파티션은 NTC에서 검출 될 수 있습니다. DNA 템플렛의 오염을 방지 하려면 벤치 깨끗 한 유지 하 고 만약에 가능 하다 면, 팬 필터 유닛와 깨끗 한 공간을 만들. DNA 템플렛의 오염이 의심 되 면 철저 하 게 공간 청소 및/또는 사용된 시 약을 삭제. 대조적으로, 참조 대립 유전자의 긍정적인 파티션을 gDNA 존재 검색 되지 않습니다 경우 gDNA, 뇌관, 및 프로브 농도 재확인. 특히, 뇌관은 기존 PCR (표 1)12에 비해 대표적인 실험에서 낮은 농도에서 사용 되었다. 그것은 또한 기존의 PCR에 변경 거의 경사로 속도 확인 하는 중요 한입니다.
DPCR 칩에서 튜브 형식으로 고유 하 게 보편적인 8 튜브 스트립8,13안에 PCR 혼합물의 분할 이다. PCR 튜브로 분할 챔버의 이동이이 시스템에서 필요 하지 않습니다 따라서 오염 위험을 감소. 거기에 또한 이점을 칩에 튜브 형식; dPCR 시스템 그것은 적어도 5 h 드롭릿 기반 dPCR14에 분석 실험의 동일한 수를 완료 하는 동안 해당 dPCR 시스템에서 96 분석 완료 < 4 h 걸립니다. 또한, 범용 8 튜브 스트립 다른 칩 기반 dPCR15, 평면 블록 열 cycler는 달리 기존의 열 cycler의 사용을 수 있습니다. 또한, 축적 된 지식과 기존의 PCR 위한 시 약 dPCR 시스템에 적용할 수 있습니다. 이 dPCR의 애플 리 케이 션을 확장에 대 한 도움이 될 것입니다.
그 dPCR는 몇 가지 제한이 주목 한다. 칩에 튜브 형식으로 dPCR에 칩의 파티션 번호 다른 dPCR 플랫폼에 비해 상대적으로 낮은입니다. 추가 개선 칩 소자에 파티션 수에 따라 동적 범위를 증가 해야 합니다. 보편적인 튜브의 내부 공간 제한 때문에, 칩 소자에 대 한 획기적인 디자인 파티션 수를 증가 해야 합니다. 나중에 전체 dPCR 절차의 자동화 크게 훨씬 더 신뢰할 수 있는 결과에, 인간의 오류를 줄일 것 이다. 성격 때문에 그것의 높은 처리량 및 높은 감도, 칩에서 튜브 형식으로 dPCR 액체 biopsies을 환경 DNA에 대 한 샘플의 수를 치료에 적용 될 예정 이다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 일본 사회에는 프로 모션의 과학 (JSP) (No. 15 K 08397)에서 토모 Kahyo에 Scientific Research (C)에 대 한 특정 및 의료 연구 및 개발 (아메드) (No. 927960719), 일본 기관에서 교부 금에 의해 지원 되었다 탐색적 연구 (제 16 K 15256), 관리 비용 보조금 (No. 1019253), 그리고 흡연 연구 재단에서 국립 대학 개혁의 추진에 대 한 인센티브 특별 예산 관련된 프로젝트에 대 한 지출에 대 한 특정 Haruhiko Sugimura입니다. 저자는 그들의 임상 지원 박사 이와 이즈미와 박사 Kurachi을 감사합니다. Funders 원고 준비에 아무런 역할을 했다. 그림 3, 그림 4, 표 4 적응 그리고 Kahyo 그 외 여러분 에 의해 기사에서 증 쇄 10, Elsevier에서 허가입니다.
QIAamp DNA Blood Maxi Kit | Qiagen | 51194 | Before Protocol 1: Extraction of genomic DNA |
NanoDrop 1000 | ThermoFisher SCIENTIFIC | ND-8000 | Before Protocol 1: Spectrophotometer |
8-strip tube | Agilent Technologies | 401428 | Protocol 1 |
Genomic DNA sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5366 | Protocol 1: A component of Genomic DNA Screen Tape Assay |
DNA ladder | Agilent Technologies | 5067-5366 | Protocol 1: A component of Genomic DNA Screen Tape Assay |
MS3 Basic Small Shaker | IKA | 3617000 | Protocol 1: Vortex mixer |
Genomic DNA ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5365 | Protocol 1: Gel device |
2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2965AA | Protocol 1: Electrophoresis instrument |
TapeStation Analysis Software | Agilent Technologies | Bundled with G2965AA | Protocol 1: Analysis software |
DNA oligo primers | IDT | Custom order | Protocol 2 |
LNA probes | IDT | Custom order | Protocol 2 |
Software tool | IDT | Web site: http://biophysics.idtdna.com/ | Protocol 2 |
dbSNP database | NCBI | Web site: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ | Protocol 2 |
TE buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12090015 | Protocol 3 |
DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher SCIENTIFIC | 10977015 | Protocol 3 (Table 1) |
Clarity Digital PCR Probe Mastermix | JN Medsys | 12013 | Protocol 3 (Table 1): 2xPCR Master Mix A component of #10011 |
Clarity Sealing Fluid | JN Medsys | 12005 | Protocol 3: Sealing fluid A component of #10011 |
Clarity JN Solution | JN Medsys | 12006 | Protocol 3 (Table 1): 20xdPCR solution A component of #10011 |
Clarity Tube-strip | JN Medsys | 12007 | Protocol 3: Chip-in-a-tube A component of #10011 |
Clarity Sample Loading Kit | JN Medsys | 12008 | Protocol 3: Loading platform and slider A component of #10011 |
Clarity Auto Loader | JN Medsys | 11002 | Protocol 3: Auto loader A component of #10001 |
Clarity Sealing Enhancer | JN Medsys | 11003 | Protocol 3: Sealing enhancer A component of #10001 |
Clarity Reader | JN Medsys | 11004 | Protocol 3: Reader A component of #10001 |
Life Eco Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | Protocol 3: Thermal cycler |
Clarity Software | JN Medsys | Bundled with #10001 | Protocol 3: Analysis software |
High Sensitivity D1000 screen tape | Agilent Technologies | 5067-5584 | Protocol 4: Gel device for high sensitivity |