Nous présentons à utilisation de la microscopie 2 photons pour placer une micropipette au sein de l’espace urinaire de Bowman chez la souris, alliant 2 techniques fondamentales de physiologie rénale. Utilisation de la microscopie 2 photons surmonte les limites critiques de microscopie conventionnelle pour les études de physiologie rénale microponction.
Microponction rénale et l’imagerie rénale 2 photons sont techniques séminales de physiologie rénale. Cependant, microponction est limitée par la dépendance sur la microscopie conventionnelle aux caractéristiques de surface néphron et photon 2 études sont limitées car interventions ne peuvent être appréciées à l’orgue plutôt qu’au niveau du néphron. En particulier, des études de microponction des glomérules de souris ont été contestés par la rareté des glomérules surfaces chez les souris. Pour combler cette lacune afin de poursuivre des études d’aspirer de l’espace de Bowman dans les modèles physiologiques de souris, nous avons développé 2 photons microponction glomérulaire. Nous présentons une nouvelle préparation chirurgicale qui permet un accès latéral pour le rein tout en préservant la colonne d’imagerie verticale nécessaire pour la microscopie 2 photons. Administration de poids moléculaire élevé l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-dextran est utilisé pour restituer le système vasculaire rénal et donc de glomérules visible pour l’imagerie 2 photons. Une pipette de dot-enduit quantique est ensuite introduite sous guidage stéréotaxique à un glomérule sélectionné parmi les nombreux nombreux auxquels peuvent être visualisées dans la fenêtre d’imagerie. Dans ce protocole, nous fournir des détails de la préparation, les matériaux et les méthodes nécessaires pour effectuer la procédure. Cette technique facilite auparavant impossibles étude physiologique du rein, y compris la récupération de filtrat de l’espace de Bowman et tous les segments du néphron dans la limite de profondeur d’imagerie, environ 100 µm sous la capsule rénale. Pression, de charge et de débit peuvent tous être mesurés à l’aide de la pipette introduite. Ici, nous fournissons des données représentatives de liquid chromatography/mass spectrometry effectuée sur l’aspiration de l’espace de Bowman. Nous espérons que cette technique d’avoir large applicabilité dans enquête physiologique rénale.
Le but de cette procédure est de fournir des courants microponction accès à l’espace de Bowman et autres structures glomérulaires chez la souris. Microponction études de physiologie rénale ont été limitées à la microscopie 1-photon, qui peut seulement l’image au sein de quelques microns de la surface du rein, et qui offre une précision limitée dans la dimension z. Parce que les souris ont quelques glomérules de surface, il n’est pas toujours possible de trouver une surface glomérule par microscopie 1-photon, donc la plupart microponction études ont été menées chez des rats Wistar-Munich, qui ont plus nombreux glomérules de surface. Par conséquent, les avantages de travailler dans des modèles murins ont été limités à la microponction études1,2,3. Les progrès récents dans l’imagerie des technologies, y compris les micro-CT4,5, nanoparticules imagerie6et7 de la spectrométrie de masse d’imagerie ont grandement amélioré l’éventail des modalités applicables à la physiologie glomérulaire, mais il ne reste pas un substitut pour l’unique possibilité d’intervenir et de déguster ce microponction offre. Donc étendre l’utilisation de microponction en utilisant les techniques présentées ici est censé faciliter les études de physiologie rénale roman, en particulier, évaluation de la teneur du filtrat rénale (c’est-à-dire, métabolomique) et physiologie fondamentale de souris transgéniques, telles que les mesures de pression du filtrat et de la charge, exercées auparavant que chez les rats.
Dans cette technique, utilisation de la microscopie 2 photons permet la visualisation et l’accès aux structures rénales jusqu’à environ 100 µm micropipette sous la capsule rénale. Plusieurs glomérules (5 – 10) sont donc accessibles à la microponction dans chaque rein de souris jusqu’à présent imagé. Bien que cette technique partage certaines caractéristiques avec microponction rénale classique, il a été conçu de novo et des modifications majeures de la technique classique sont nécessaires. Dans ce protocole, nous démontrer l’aspiration du liquide de l’espace de Bowman et exemple les résultats de l’analyse ultérieure avec la spectrométrie de masse (nanoproteomics)8,9,10,11. L’utilisation en aval de la spectrométrie de masse nécessite un workflow de préparation échantillon spécialisées, comme en témoigne ici.
Nous présentons une méthode pour accéder à l’espace de Bowman de glomérules non surface chez les souris, facilitées par la microscopie 2 photons. Nous avons mis au point cette procédure pour résoudre une limitation clée de microponction glomérulaire, la rareté des glomérules surfaces adressables par microscopie de photons 1 chez la souris, afin de faciliter un objectif expérimental, aspiration de liquide depuis l’espace de Bowman pour analyse ultérieure. Développement et pratique de cette technique repose sur six étapes critiques. Tout d’abord, la nouvelle préparation chirurgicale doit être soigneusement effectuée afin que la colonne d’eau d’imagerie ne fonctionne pas éteinte la lamelle et la lamelle s’étend sur la surface du rein qui est la cible de la pipette. Deuxièmement, la pipette de verre utilisée pour la microponction doit être rendue visible pour la microscopie 2-photon, qui est réalisée en utilisant des points quantiques. Troisièmement, stéréotaxique technique est nécessaire pour positionner une pipette dans l’espace de Bowman en trois dimensions, jusqu’à 100 µm sous la surface du rein. Par conséquent, enregistrant les systèmes de coordonnées de la pipette et la scène avec précision est des étapes critiques. Quatrièmement, attentive sélection du glomérule cible est nécessaire pour assurer qu’est accessible à la pipette sans empiètement de la structure de support des reins et de la colonne d’imagerie. Enfin, attention il faut tenir compte des étapes analytiques à suivre la procédure d’acquisition, et le volume et le calendrier d’acquisition des échantillons de liquide doivent être adaptés à l’analyse et à la physiologie glomérulaire.
Nous avons conçu une procédure d’acquisition qui peut être étendue à nombreuses analyses, y compris les points de terminaison microponction traditionnels, tels que la photométrie de flamme, mesures de l’électrode sensible à ion ou mesures de pression, de volume ou de droit. En outre, nous pensons que cette technique sera favorable aux nouveaux points de terminaison analytiques dont la réaction en chaîne par polymérase (peut-être après transcription inverse pour miRNA) et métabolomique en aval de la spectrométrie de masse. Les modifications spéciales utilisées pour faciliter la spectrométrie de masse méritent discussion supplémentaire, et qu’elles imposent certaines limitations. Tout d’abord, bien que la spectrométrie de masse est très sensible, la teneur en protéines faible et le volume d’échantillons microponction rend l’analyse des protéines ci-dessous la gamme dynamique d’exploration classiques protéomiques et étaient donc simplifiés nanoproteomics nécessaire. 8 , 13 Deuxièmement, afin d’optimiser le rendement de protéine pour les premiers essais, nous avons déterminé que 200-300 ml d’aspirat était nécessaire, mais acquisition filtrat de novo du présent volume nécessiterait peut-être tant que 20 minutes d’aspiration si la souris GFR est seulement de 8 à 14 nL / min3. Tojo et Endou démontré qu’aspiration prolongée altère le contenu de l’albumine de début de fluide de tubule proximal14, nous avons élu à aspirer à plus de 6 minutes ; Cependant, cela signifie que notre taux d’aspiration dépasse le taux d’affluence de filtrat. Les utilisateurs de cette procédure sont encouragés à envisager la physiologie de la filtration glomérulaire dans leur système expérimental dans la conception de leur flux de travail. Spectrométrie de masse, une technique sensible, soient submergée par le signal à partir d’un distillat de pétrole introduites telles que l’huile minérale, qui est couramment utilisé dans la microponction font partie du réseau hydraulique pour aspiration et isoler les segments du néphron. Par conséquent, nous ne pouvions pas utiliser d’huile minérale à cet effet, ou utiliser son autre commune, quantification du volume des échantillons de gamme nanolitres. Au lieu de cela, nous remplissons le système avec perfluorodecalin qui est biologiquement inerte, ne perturbe pas la spectrométrie de masse, qui présente des caractéristiques optiques favorables. Nous croyons que les limitations imposées par perfluorodecalin sont surmontables et travaillent sur les innovations techniques supplémentaires dont nous attendons permettra à la mesure du volume de l’échantillon et le blocus du segment tubulaire.
La plupart des études de microponction ont été réalisées chez le rat Wistar-Munich, qui démontrent l’augmentation du nombre de glomérules de surface, mais cette étude physiologique grandement limitée de transport tubulaire et autre physiologie rénale en raison de la perte de la fondamentale outil de la biologie moléculaire, des souris transgéniques2,3. Parce qu’elle facilite l’accès de la micropipette à l’espace de Bowman chez la souris, cette nouvelle technique atténue donc ces limites critiques. Nous avons adopté cette technique afin d’accéder à filtrat rénale pour des études protéomiques par spectrométrie de masse haute sensibilité, appelée nanoproteomics,9. Cependant, il y a des applications supplémentaires probables. Par exemple, rénale étude physiologique des protéines filtrées a été grandement favorisé par l’utilisation de traceurs fluorescents avec 2 photons microscopie15,16,17. Ajout de microponction à la microscopie 2 photons offre la possibilité d’effectuer l’étude physiologique de néphron avec des molécules fluorescentes, permettant des néphrons non injection, voisins servir en tant que contrôles. Il est à espérer que cette explication claire des étapes nécessaires permettront largement adopté dans les laboratoires déjà équipés pour la microscopie 2 photons et/ou microponction. Bien qu’il soit complexe, maintenant, nous avons effectué cette procédure plusieurs fois et les raffinements présentés ici représentent une plate-forme stable pour la découverte et physiologique.
The authors have nothing to disclose.
NIDDK K08 DK090754 à Mi/h. NIGM P41 GM103493 à RDS. Ce matériau est le fruit du travail (par mi/h) qui a été pris en charge avec les ressources et l’utilisation des installations à la Portland Veterans Affairs Medical Center. Le contenu ne représente pas les vues du ministère américain des anciens combattants ou le gouvernement des États-Unis.
Upright 2 photon microscope | Zeiss | LSM 7MP | |
3 axis microscope stage controller | Sutter | MP-285 | |
3 axis headstage controller | Sutter | MP-225 | |
Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | |
Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
FITC-dextran 2000 kDa MW | Sigma-Aldrich | 52471-1G | |
borosilicate glass capillary tubes | Sutter | B150-110-7.5 | |
Micropipette puller | Sutter | P-97 | |
Quantum dots, 605 nm | Thermofisher | Q21701MP | |
Polysiloxane | Sugru | No cat number | www.sugru.com, "original formula". Any color. |
PE-50 tubing | Instech Labs | BTPE-50 | |
Microinjector | WPI | UMP-3 | |
Microinjector controller | WPI | Micro4 | |
Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | 306-94-5 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
Coverslip, 10 mm | Harvard Apparatus | 64-0718 | |
Headplate | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
Head fixation device | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
30 gauge needle | Becton-Dickinson | 125393 | For retroorbital injection |
Tuberculin syringe | Becton-Dickinson | 309626 | For retroorbital injection |