Summary
Nous présentons à utilisation de la microscopie 2 photons pour placer une micropipette au sein de l’espace urinaire de Bowman chez la souris, alliant 2 techniques fondamentales de physiologie rénale. Utilisation de la microscopie 2 photons surmonte les limites critiques de microscopie conventionnelle pour les études de physiologie rénale microponction.
Abstract
Microponction rénale et l’imagerie rénale 2 photons sont techniques séminales de physiologie rénale. Cependant, microponction est limitée par la dépendance sur la microscopie conventionnelle aux caractéristiques de surface néphron et photon 2 études sont limitées car interventions ne peuvent être appréciées à l’orgue plutôt qu’au niveau du néphron. En particulier, des études de microponction des glomérules de souris ont été contestés par la rareté des glomérules surfaces chez les souris. Pour combler cette lacune afin de poursuivre des études d’aspirer de l’espace de Bowman dans les modèles physiologiques de souris, nous avons développé 2 photons microponction glomérulaire. Nous présentons une nouvelle préparation chirurgicale qui permet un accès latéral pour le rein tout en préservant la colonne d’imagerie verticale nécessaire pour la microscopie 2 photons. Administration de poids moléculaire élevé l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-dextran est utilisé pour restituer le système vasculaire rénal et donc de glomérules visible pour l’imagerie 2 photons. Une pipette de dot-enduit quantique est ensuite introduite sous guidage stéréotaxique à un glomérule sélectionné parmi les nombreux nombreux auxquels peuvent être visualisées dans la fenêtre d’imagerie. Dans ce protocole, nous fournir des détails de la préparation, les matériaux et les méthodes nécessaires pour effectuer la procédure. Cette technique facilite auparavant impossibles étude physiologique du rein, y compris la récupération de filtrat de l’espace de Bowman et tous les segments du néphron dans la limite de profondeur d’imagerie, environ 100 µm sous la capsule rénale. Pression, de charge et de débit peuvent tous être mesurés à l’aide de la pipette introduite. Ici, nous fournissons des données représentatives de liquid chromatography/mass spectrometry effectuée sur l’aspiration de l’espace de Bowman. Nous espérons que cette technique d’avoir large applicabilité dans enquête physiologique rénale.
Introduction
Le but de cette procédure est de fournir des courants microponction accès à l’espace de Bowman et autres structures glomérulaires chez la souris. Microponction études de physiologie rénale ont été limitées à la microscopie 1-photon, qui peut seulement l’image au sein de quelques microns de la surface du rein, et qui offre une précision limitée dans la dimension z. Parce que les souris ont quelques glomérules de surface, il n’est pas toujours possible de trouver une surface glomérule par microscopie 1-photon, donc la plupart microponction études ont été menées chez des rats Wistar-Munich, qui ont plus nombreux glomérules de surface. Par conséquent, les avantages de travailler dans des modèles murins ont été limités à la microponction études1,2,3. Les progrès récents dans l’imagerie des technologies, y compris les micro-CT4,5, nanoparticules imagerie6et7 de la spectrométrie de masse d’imagerie ont grandement amélioré l’éventail des modalités applicables à la physiologie glomérulaire, mais il ne reste pas un substitut pour l’unique possibilité d’intervenir et de déguster ce microponction offre. Donc étendre l’utilisation de microponction en utilisant les techniques présentées ici est censé faciliter les études de physiologie rénale roman, en particulier, évaluation de la teneur du filtrat rénale (c'est-à-dire, métabolomique) et physiologie fondamentale de souris transgéniques, telles que les mesures de pression du filtrat et de la charge, exercées auparavant que chez les rats.
Dans cette technique, utilisation de la microscopie 2 photons permet la visualisation et l’accès aux structures rénales jusqu'à environ 100 µm micropipette sous la capsule rénale. Plusieurs glomérules (5 – 10) sont donc accessibles à la microponction dans chaque rein de souris jusqu'à présent imagé. Bien que cette technique partage certaines caractéristiques avec microponction rénale classique, il a été conçu de novo et des modifications majeures de la technique classique sont nécessaires. Dans ce protocole, nous démontrer l’aspiration du liquide de l’espace de Bowman et exemple les résultats de l’analyse ultérieure avec la spectrométrie de masse (nanoproteomics)8,9,10,11. L’utilisation en aval de la spectrométrie de masse nécessite un workflow de préparation échantillon spécialisées, comme en témoigne ici.
Protocol
Toutes les procédures décrites dans les présentes ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Committee of Oregon Health & Science University.
1. la configuration utilisée pour la démonstration
- Utiliser un microscope vertical de 2 photons, un contrôleur 3 axes stade, titulaire d’un préamplificateur/pipette et un contrôleur 3 axes pour le détenteur de préamplificateur/pipette ; tous les quatre de ces éléments sont nécessaires.
NOTE : Nombreuses configurations similaires sont disponibles et suffiront tant qu’indépendant contrôle quantitatif de 3 axes de la scène de pipette et microscope sont disponibles, et le microscope est mis en place pour l’imagerie in vivo verticale.
2. matériel nécessaire avant de commencer les protocoles expérimentaux
- Utilisez le FITC-dextran, 2 000 000 Da, solution à 5 % dans un soluté physiologique ou de tampon phosphate salin pour injection de retroorbital à l’occasion de la vascularisation rénale. Cette masse moléculaire (mm) est choisie parce qu’il reste dans le système vasculaire et ne filtre pas.
- Micropipettes de verre de borosilicate machine-tirée : tirer des micropipettes à 6 – 10 µm pointe en utilisant les paramètres de la pointe long cône, fermé (p. ex., chaleur = 610, vitesse = 150, temps = 250 ms, en boucle) sur un terrain de micropipettes. Biseau à 45° et flamme-polonais légèrement.
- Couche point quantique de micropipettes : enduire les conseils d’une micropipette avec points quantiques selon le protocole référencé. 12
- Rein de polysiloxane soutien/entretoise. Polysiloxane mastic permet de concevoir une rein soutien/entretoise. Mode pour un 1 x 1 cm2 de 5 mm épaisseur coudée rhomboïde (par exemple, un cube tronqué) de polysiloxane mastic. Enlever le milieu 70 % de la polysiloxane d’un bord et un cercle comprenant environ 70 % du centre de la rhomboïde. Permettre le polysiloxane à sécher pendant 24h. Voir la Figure 1.
- Préparation de la microinjector : pré-remplir une longueur de tube de polyéthylène (PE)-50 et le titulaire de la micropipette micropipette chargés avec de l’huile. Si la spectrométrie de masse est prévue, perfluorodecalin est nécessaire, sinon l’huile minérale peut être utilisé. Mettre en place le microinjector avec une seringue de Hamilton-type et les remplir à perfluorodecalin étanche au gaz. Il sera relié au tube PE-50 et titulaire de la pipette.
- Placez la pipette dans le support de la pipette avant remplir le tube PE-50 et la pipette, puis fixez l’extrémité proximale de la PE-50 tubes à la seringue remplie d’huile de Hamilton, la création d’un système hydraulique de pipette à seringue.
3. Pipette latérale rejoindre le rein dessous un fluide d’imagerie colonne en utilisant une nouvelle intervention chirurgicale
NOTE : L’assemblage du système d’imagerie de soutien et préparation chirurgicale est illustré à la Figure 1. La procédure décrite est effectuée sur des souris C57BL/6, 20 à 25 grammes.
- Peser la souris.
- Induire l’anesthésie à l’isoflurane 4 % et de maintenir à l’isoflurane 1,5 – 2,5 % dans le mélange air/oxygène. Confirmer que la souris est anesthésiée par l’absence de réponse au stimulus douloureux et baisse du rythme respiratoire.
- Lubrifier les yeux et placez l’animale latérale sur une plaque de base. Immobiliser les 4 extrémités à l’aide de ruban adhésif.
- Injecter par voie sous-cutanée de soluté physiologique, 200 µL et placer une sonde de température rectale. Température de régulation à l’aide d’une lampe chauffante pendant la chirurgie et un coussin chauffant en imagerie.
- Enlever tous les poils sur le côté gauche de la souris à l’aide d’une crème dépilatoire.
- Détecter la rate, qui est visible sous la peau, et repérer le rein gauche sur la face dorsale et caudale de rate.
- Faire une incision de 0,5 cm sur la peau et plus petite incision sur le péritoine, juste assez pour que le rein faire passer facilement.
- Extruder le rein avec une légère pression. Placez rein stabilisateur forme faite avec polysiloxane autour du rein et les fixer avec de la colle cyanoacrylate. Alignez le rein de l’entretoise telle que la surface latérale plus du rein s’étend au-delà du stabilisateur sur env. 1 mm.
- Fixer une plaque de tête à la forme de stabilisateur avec de la colle et monter la plaque de tête aux barres de montage sur la plaque de base.
- Remplir le puits dans le soutien de polysiloxane qui entoure le rein avec solution à 1 % d’agarose et placer la lamelle de 10 mm sur le dessus et maintenez jusqu'à ce que l’agarose est ferme. Sceller la lamelle couvre-objet sur la plaque de tête avec de la colle et créer un cercle autour de la lamelle avec du ciment dentaire.
- Injecter FITC-dextran (2 000 000 Da, solution à 5 %, 100 – 150 µL) rétro-orbitalement et déplacez le plateau de souris et de la fixation de la platine du microscope 2 photons rapidement, maintien d’anesthésie et assurer adéquate des déchets de gaz sur la platine du microscope.
4. sélection d’un glomérule approprié et la Pipette accès à l’espace de Bowman
-
Définitions :
- Décrivez X comme sur l’écran de gauche droite et gauche-droite, face au microscope
- Lu SX (étape X) du contrôleur de stage
- Qualifier de pipette X PX, composez le contrôleur sur la pipette
- Décrivez Y comme haut-bas sur l’écran et en avant vers le microscope en bas vers la configuration 2-photon
- Définir Z que jusqu'à vers le plafond, en bas vers le plancher et mesurée sur la scène avec la position de l’objectif Z.
- Define S (O) Z comme la hauteur de la scène (vraiment l’objectif).
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Trouver la surface du rein, identifiable à l’aide de paramètres de filtre de la protéine fluorescente verte (GFP) dans l’oculaire. En raison de l’injection de FITC-Dextran, la vascularisation sera vert vif.
- Identifier un glomérule approprié. Après avoir identifié la surface du rein à l’aide de l’oculaire, passez à 2 photons (mode non à balayage) et explorez la fenêtre d’imagerie. Voici les caractéristiques favorables pour microponction : distance verticale en dessous de la lamelle > 30 µm (pour prévenir un abordage entre la pipette et la lamelle lors de l’accès) et distance latérale de la capsule rénale latérale pour le glomérule < 400 µm (au-delà de cette distance la déviation de la pipette peut augmenter la probabilité d’un échec).
- Latérale record et la distance verticale et la piqûre point, un point sur la capsule rénale directement à la pipette du côté du glomérule.
- Soulever le point focal objectif dans la colonne d’eau, garder le x et scène coordonnées inchangé, une distance d’à peu près un centimètre.
- Enfoncer l’embout de la pipette dans la colonne d’eau et mettez 4', excitation (DAPI) 6-diamidino-2-phenylindol. Déplacez les dimensions de la pipette en x et y au point de fluorescence maximale de la pointe, ce sera le centre de l’objectif. Trouver la pipette dans l’oculaire est difficile sans ce prépositionnement précis. Parce que les points quantiques sont fluorescents à la longueur d’onde même (dans ce cas, rouge) quelle que soit la longueur d’onde excitation, l’excitation DAPI produit une fluorescence rouge qui se concentre fortement sur la pointe, illustrée à la Figure 2.
- Modifiez le paramètre d’excitation en protéine fluorescente rouge (DP) et visualiser la pipette dans l’oculaire, puis centrer précisément dans la vue oculaire.
- Basculez vers 2 photons et trouver la pipette sous 2-photon, placer précisément dans le centre de l’image. Il s’agit de la position de l’enregistrement.
- Enregistrer une image de la pipette.
- Enregistrer la scène et les coordonnées de contrôleur d’une micropipette.
Remarque : Utilisez le fichier .html supplémentaire, qui va exécuter des calculs à l’aide de code JavaScript, (avantageux sur les systèmes qui n’ont pas de logiciel installé) ou une feuille de calcul pour calculer le décalage entre la scène et pipette coordonnées et calculer les coordonnées de la cible pour le contrôleur de la pipette. - Retirez la pipette de la colonne d’eau dans l’axe des x, gardant z et y de la même chose.
- Déplacer la pipette Z vers le glomérule cible Z (c'est-à-dire déplacer la pipette vers le bas dans la direction Z sous la lamelle)
- Déplacer la pipette Y vers les coordonnées du glomérule Y cible.
- Déplacer la vue en direct 2-photon sur le glomérule cible Z puis sur le bord du rein et notez la SX.
- Calculer le bord rein PX à l’aide de l’offset de l’enregistrement SX.
- Déplacer la scène vers la pipette (augmentation de la SX) tel que le bord du rein est loin à la gauche de l’écran, mais encore visibles.
- Faire avancer rapidement la pipette à environ 100 µm de moins que l’arête de rein PX calculé ci-dessus.
- Placer l’embout de la pipette, avançant la pipette lentement. Augmenter le gain rouge et observez l’histogramme de pixel rouge (les pixels distribution déplacements avant que la pipette est photographiée sur la fenêtre, en raison de la luminosité extrême de points quantiques et fluorescence hors cible).
- Avancez vers le bord de rein sous live 2-photon imaging.
Remarque : Avant d’entrer dans la capsule rénale, il est possible de rediriger la pipette dans la dimension Y et Z. Toutefois, cela risque d’altérer l’embout de la pipette. Une mesure plus conservatrice, la pipette s’éloignent, est de se retirer dans la dimension X, jusqu'à 2 cm, redirection et puis retour dans la dimension X jusqu’au bord du rein. Une fois la pipette dans le tissu, mouvement dans n’importe quel axe autre que X conduit à flexion pipette nécessitant une grande expérience de faire usage d’et fréquemment conduit à la rupture. - Conduisez lentement la pipette dans l’axe des X vers la cible de glom PX, gardant un œil sur la SX. (Il est utile de revenir parfois au glomérule pour voir si elle a changé du tout lors de l’insertion de la micropipette).
- Lorsque vous êtes au bon endroit, position de document avec un z-stack.
NOTE : Avec une micropipette en place, médicaments, des protéines ou traceurs fluorescents peuvent être injectés, le liquide peut être aspiré pour une analyse ultérieure ou pression ou la charge par rapport à une autre électrode peut être mesurée.
5. aspiration de liquide depuis l’espace de Bowman
- Définir la micropompe à injecter 100 nL de perfluorodecalin pendant 2 min pour assurer la perméabilité de la pipette et réduire confondants de pipette Boucher pendant la saisie. Reimage afin d’assurer la position de la pipette.
- Attendre 4 à 6 min pour une filtration supplémentaire.
- Définir la micropompe à aspirer jusqu'à 300 nL à une vitesse de jusqu'à 50 nL/min.
NOTE : Changements dans la morphologie glomérulaire observent pas avec ce taux, suggérant qu'il ne modifie pas le taux de livraison de fluide à l’espace au cours de l’aspiration. Qu’il n’y a aucun bloc d’huile comme dans microponction classique, récupération du présent volume, nécessaire à la spectrométrie de masse, pourrait inclure certains perflourodecalin injecté et fluide tubulaire éventuellement. Pour les tests comme spectroscopie de fluorescence de mesures sensibles ion électrode, réaction en chaîne par polymérase et autres points de terminaison sensibles, baisse des volumes peuvent être utilisés. Si la spectrométrie de masse n’est pas le point de terminaison, l’huile minérale et microponction standard techniques utilisables pour mesurer le volume aspiré avant stockage. - Une fois de plus l’image.
- Retirer la pipette et la conservation de l’échantillon, ajoutant un tampon TRIS et stocker à-80 ° avant l’analyse.
- Euthanasier la souris à l’aide d’une surdose d’isoflurane ou autre moyen agréé.
Remarque : Le filtrat pénètre dans l’espace par filtration des capillaires glomérulaires. Le taux de filtration glomérulaire du néphron (NÉPHRON) chez la souris est rapporté entre 8 et 14 nL/min.3 forces de Starling régissent NÉPHRON, cependant, et la pression hydrostatique négative dans l’espace de Bowman peut donc augmenter NÉPHRON. Méthodes standard microponction utilisent blocage du tubule avec huile et pression neutre pour l’échantillonnage fluid tubulaire, mais ces composés interfèrent avec la spectrométrie de masse (voir ci-dessous) ; par conséquent, dans cette technique le tubule proximal au début reste brevet. En outre, au moment de l’aspiration, l’espace de Bowman contient un inconnu, mais positive volume de filtrat. Par conséquent, les taux d’aspiration liquide peut dépasser NÉPHRON.
Remarque : Dans les expériences décrites ici, l’objectif était d’obtenir une plus grande que l’échantillon habituel du filtrat glomérulaire pour analyse de spectrométrie de masse par des techniques de nanoproteomic. Étant donné que l’utilisation de la spectrométrie de masse s’oppose à l’utilisation de blocs d’huile avec l’huile minérale ou de la cire (mélanges complexes de molécules organiques qui réduisent le signal : bruit en spectrométrie de masse) perfluorodecalin est utilisé pour remplir la micropipette et la seringue. Perflourodecalin ne connaît pas de bloquer l’écoulement tubulaire, mais biologiquement inerte et n’interfère pas avec la spectrométrie de masse.
Representative Results
Cette procédure nécessite une préparation chirurgicale unique du rein pour 2-photon imaging et accès, qui est illustré à la Figure 1. Cette préparation ci-contre permet une colonne verticale d’imagerie avec l’objectif au-dessus du rein avec quelques changements de densité optique optimale pour la microscopie 2 photons simultanément avec accès latéral pour la pipette, conduit exclusivement à l’horizontale (x ) dimension. Extrusion partielle du rein empêche une tension excessive sur le pédicule rénal et préserve le flux vasculaire et construction d’un support personnalisé rein permet les deux objectifs de l’imagerie et l’accès. Le deuxième défi dans cette procédure, c’est un positionnement précis de la pipette dans le rein en 3 dimensions, qui exige l’enregistrement des pipette et stade des systèmes de coordonnées. L’étape cruciale de ce processus est illustré à la Figure 2, qui montre la pipette étant repérée dans la colonne d’eau du microscope 2 photons sous DAPI-excitation. Entrer dans la colonne d’eau et d’enregistrer les coordonnées de la pipette à celles de la phase avant d’entrer dans le rein sont essentielle pour permettre un positionnement précis stéréotaxique de la pipette dans l’espace de Bowman de la cible. La pipette pénètre dans la colonne d’eau d’imagerie de la droite. Avec excitation DAPI allumée, la pipette de dot-enduit rouge quantique émet une fluorescence vive dans le rouge-orangé, et peut être soigneusement placée sous le milieu de l’objectif. Comme le faisceau d’excitation passe par le centre de l’objectif, la pipette peut être déplacée librement jusqu’au point de fluorescence maximale, garantissant qu’il sera visible dans l’oculaire.
Bonne pipette tirant et glomérule sélection sont essentiels à la réussite de ce protocole, tel qu’illustré à la Figure 3, Figure 4, la Figure 5. Dans la Figure 3 a, on voit une micropipette de verre point quantique bien tiré, rouge-fluorescent photographiée sur la colonne de fluide pendant la phase d’enregistrement de pipette de la procédure. La pointe est de 6 microns de largeur. Dans la Figure 3 b, une pipette mal tiré avec 12 µm pointe est indiquée. Cette pipette ne peut pas pénétrer la capsule rénale sans causer un traumatisme vasculaire en raison des 12 µm de diamètre et la surface de la pointe irrégulière (note la fraise au sommet de l’angle de biseau). Dans la Figure 3 et 3D, est montré l’importance d’optimal positionnement plutôt que d’imagerie du glomérule cible. Le glomérule bel, près de la surface, illustré à la Figure 3 montre l’imagerie favorable (en raison de sa position de surface à 20 µm sous la capsule rénale), mais ne serait pas approprié pour l’accès par cette procédure parce qu’il est trop près de la surface, et la pipette frapperait la lamelle. Figure 3D, positionné de façon optimale les glomérules sont divulgués. Notez l’échelle différente utilisée pour illustrer les deux glomérules (échelle bars sont tous à 50 µm). Ces glomérules apparaissent moins nettes en raison de la réfraction provoquée par la profondeur ; Cette image a été prise à 70 µm sous la capsule rénale. Le bord latéral de rein est 250 µm à droite, tous deux de ces glomérules rendant accessible. Lors d’une procédure d’accès, l’imagerie est étroitement centrée sur le glomérule cible comme dans la Figure 4, et acquisition d’images de chaque seconde est utilisée, permettant à l’enquêteur d’observer avec précision de positionnement de la pipette dans l’espace de Bowman.
La figure 4 illustre une entrée typique rénale et le résultat, un embout de la pipette dans l’espace de Bowman. Dans la Figure 4 a, une projection de la densité moyenne d’une z-pile avec les vues orthogonales montre le bout de la pipette dans l’espace de Bowman. Notez qu’il est pipette rouge pointe spectrale (ballon rond de la fluorescence) en raison de la très brillante fluorescence des points quantiques disposées sur la partie conique de l’extrémité. Dans la Figure 4 b, une projection du volume de données z-pile montre une autre pipette dans l’espace de Bowman. Notez que la pipette traîné capsule de Bowman dans le sens de la marche à l’entrée, créant apparente sous la tente derrière l’extrémité comme indiqué dans le protocole.
Figure 5, les résultats d’une procédure ayant échouée sont divulgués dans lequel une pipette avec une trop grande ouverture s’est rompu à la capsule rénale, causant une hémorragie. La pipette est trop grossier ; à tenter de passer de la capsule rénale, la capsule a été Poussée devant l’embout de la pipette jusqu'à ce que la rupture s’est produite. Dans cette image, la capsule rénale est visible, renforcée par un saignement subcaspular, vert fluorescent FITC. FITC signal est visible dans la pipette elle-même, indiquant que le sang sous pression entré la lumière de la pipette. La flèche pointe sur de nombreux globules rouges visibles dans la lumière de la pipette comme vice de la FITC-dextran de remplissage.
La figure 6 représente un spectre de masse représentant provenant d’aspirer de l’espace de Bowman, protéines urinaires de souris 17 (MUP17). Le tableau 1 montre enfin résultats exemple de procédures d’aspiration réussie, énumérant les protéines identifiées par spectrométrie de masse nanométriques sur aspirat recueilli plus de 6 minutes de chacune des 3 souris. Dans chaque cas, la pipette a été imagée comme il a été retiré de l’espace de Bowman, et aucune fluorescence FITC a été observée au sein de l’espace de Bowman ou la lumière de la pipette, indiquant la non-contamination aspirer avec le plasma. 17 protéines, principalement de faible poids moléculaire, ont été identifiées d’un minimum de 2 peptides uniques par protéine. Comtes spectrales sont faibles, compatible avec les estimations antérieures de la protéine dans le filtrat glomérulaire, et connu des protéines filtrées, comme la protéine liant la vitamine D (VTDB), albumine (ALBU) et protéine urinaire majeure 17 (MUP17) sont présents.
Figure 1 : extrusion partielle du rein avec assistance personnalisée et d’immobilisation pour accès latéraux. Sur la gauche, les parties de l’appui d’imagerie de colonne et les reins sont indiquées, avec l’ensemble complet au centre. Sur la droite, rein montre la préparation avant (ci-dessus) et après (application du soutien en dessous). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : terminé rein préparation à l’étape d’inscription pipette du protocole. Ici, excitation DAPI est utilisée pour positionner la micropipette dans la colonne d’eau du microscope photonique 2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : imagerie des pipettes et le rein après injection de FITC-dextran, démontrant des glomérules appropriés et inappropriés pour microponction. A. une pipette bien tirée avec 6 µm pointe. B. une astuce à bords rugueux, émoussée. C. ce glomérule est bien défini, mais trop proche de la lamelle couvre-objet pour microponction. D. Convenablement positionné glomérules. Barreaux de l’échelle est tous 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : pipette succès passage mène à placement en l’espace de-visites Bowman de 2 procédures différentes. A. Z-pile avec projections orthogonales montre de pipette dans l’espace de Bowman, attenante à la touffe glomérulaire. Barre d’échelle est 50 µm. B. Rendu volumique de z-pile montre de la même façon une pipette dans l’espace de Bowman, attenante à la touffe glomérulaire. Barre d’échelle est 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : une procédure infructueuse en raison d’une pipette émoussée, déchirure de la capsule rénale et conduisant à un saignement dans la lumière de la pipette. Fluorescence FITC des épanchements de plasma et les globules rouges (flèche) sont visibles dans la pipette. Flèche pointe aux globules rouges visibles dans la lumière de la pipette. Barre d’échelle est 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : le spectre de masse pour la principale protéine urinaire 17 (MUP17), tiré de nanoscale liquid chromatography/mass spectrometry analyse d’aspirat espace de Bowman. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Protéine | MW (kD) | Veut dire comte spectrale |
| ACTA_MOUSE | 42 | 2 |
| ACTB_MOUSE | 42 | 1 |
| CLPX_MOUSE | 69 | 2.5 |
| DHSA_MOUSE | 73 | 1 |
| FOLR2_MOUSE | 29 | 1 |
| GBLP_MOUSE | 35 | 1 |
| ALBU_MOUSE | 66 | 6.7 |
| HBA_MOUSE | 15 | 2 |
| HBB1_MOUSE | 16 | 1 |
| MIB1_MOUSE | 110 | 1 |
| MUP17_MOUSE | 21 | 1 |
| PERI_MOUSE | 54 | 1 |
| RNAS4_MOUSE | 17 | 2 |
| SPTB1_MOUSE | 2 | 1 |
| VIME_MOUSE | 54 | 1 |
| VTDB_MOUSE | 53 | 1 |
Tableau 1 : Liste des protéines identifiées dans aspirat espace de Bowman de 3 souris.
La vidéo 1 : un rendu de volume d’une z-pile acquise après une pipette de positionnement dans l’espace de Bowman montre le bout de la pipette dans l’espace, attenante à la touffe capillaire. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Nous présentons une méthode pour accéder à l’espace de Bowman de glomérules non surface chez les souris, facilitées par la microscopie 2 photons. Nous avons mis au point cette procédure pour résoudre une limitation clée de microponction glomérulaire, la rareté des glomérules surfaces adressables par microscopie de photons 1 chez la souris, afin de faciliter un objectif expérimental, aspiration de liquide depuis l’espace de Bowman pour analyse ultérieure. Développement et pratique de cette technique repose sur six étapes critiques. Tout d’abord, la nouvelle préparation chirurgicale doit être soigneusement effectuée afin que la colonne d’eau d’imagerie ne fonctionne pas éteinte la lamelle et la lamelle s’étend sur la surface du rein qui est la cible de la pipette. Deuxièmement, la pipette de verre utilisée pour la microponction doit être rendue visible pour la microscopie 2-photon, qui est réalisée en utilisant des points quantiques. Troisièmement, stéréotaxique technique est nécessaire pour positionner une pipette dans l’espace de Bowman en trois dimensions, jusqu'à 100 µm sous la surface du rein. Par conséquent, enregistrant les systèmes de coordonnées de la pipette et la scène avec précision est des étapes critiques. Quatrièmement, attentive sélection du glomérule cible est nécessaire pour assurer qu'est accessible à la pipette sans empiètement de la structure de support des reins et de la colonne d’imagerie. Enfin, attention il faut tenir compte des étapes analytiques à suivre la procédure d’acquisition, et le volume et le calendrier d’acquisition des échantillons de liquide doivent être adaptés à l’analyse et à la physiologie glomérulaire.
Nous avons conçu une procédure d’acquisition qui peut être étendue à nombreuses analyses, y compris les points de terminaison microponction traditionnels, tels que la photométrie de flamme, mesures de l’électrode sensible à ion ou mesures de pression, de volume ou de droit. En outre, nous pensons que cette technique sera favorable aux nouveaux points de terminaison analytiques dont la réaction en chaîne par polymérase (peut-être après transcription inverse pour miRNA) et métabolomique en aval de la spectrométrie de masse. Les modifications spéciales utilisées pour faciliter la spectrométrie de masse méritent discussion supplémentaire, et qu’elles imposent certaines limitations. Tout d’abord, bien que la spectrométrie de masse est très sensible, la teneur en protéines faible et le volume d’échantillons microponction rend l’analyse des protéines ci-dessous la gamme dynamique d’exploration classiques protéomiques et étaient donc simplifiés nanoproteomics nécessaire. 8 , 13 Deuxièmement, afin d’optimiser le rendement de protéine pour les premiers essais, nous avons déterminé que 200-300 ml d’aspirat était nécessaire, mais acquisition filtrat de novo du présent volume nécessiterait peut-être tant que 20 minutes d’aspiration si la souris GFR est seulement de 8 à 14 nL / min3. Tojo et Endou démontré qu’aspiration prolongée altère le contenu de l’albumine de début de fluide de tubule proximal14, nous avons élu à aspirer à plus de 6 minutes ; Cependant, cela signifie que notre taux d’aspiration dépasse le taux d’affluence de filtrat. Les utilisateurs de cette procédure sont encouragés à envisager la physiologie de la filtration glomérulaire dans leur système expérimental dans la conception de leur flux de travail. Spectrométrie de masse, une technique sensible, soient submergée par le signal à partir d’un distillat de pétrole introduites telles que l’huile minérale, qui est couramment utilisé dans la microponction font partie du réseau hydraulique pour aspiration et isoler les segments du néphron. Par conséquent, nous ne pouvions pas utiliser d’huile minérale à cet effet, ou utiliser son autre commune, quantification du volume des échantillons de gamme nanolitres. Au lieu de cela, nous remplissons le système avec perfluorodecalin qui est biologiquement inerte, ne perturbe pas la spectrométrie de masse, qui présente des caractéristiques optiques favorables. Nous croyons que les limitations imposées par perfluorodecalin sont surmontables et travaillent sur les innovations techniques supplémentaires dont nous attendons permettra à la mesure du volume de l’échantillon et le blocus du segment tubulaire.
La plupart des études de microponction ont été réalisées chez le rat Wistar-Munich, qui démontrent l’augmentation du nombre de glomérules de surface, mais cette étude physiologique grandement limitée de transport tubulaire et autre physiologie rénale en raison de la perte de la fondamentale outil de la biologie moléculaire, des souris transgéniques2,3. Parce qu’elle facilite l’accès de la micropipette à l’espace de Bowman chez la souris, cette nouvelle technique atténue donc ces limites critiques. Nous avons adopté cette technique afin d’accéder à filtrat rénale pour des études protéomiques par spectrométrie de masse haute sensibilité, appelée nanoproteomics,9. Cependant, il y a des applications supplémentaires probables. Par exemple, rénale étude physiologique des protéines filtrées a été grandement favorisé par l’utilisation de traceurs fluorescents avec 2 photons microscopie15,16,17. Ajout de microponction à la microscopie 2 photons offre la possibilité d’effectuer l’étude physiologique de néphron avec des molécules fluorescentes, permettant des néphrons non injection, voisins servir en tant que contrôles. Il est à espérer que cette explication claire des étapes nécessaires permettront largement adopté dans les laboratoires déjà équipés pour la microscopie 2 photons et/ou microponction. Bien qu’il soit complexe, maintenant, nous avons effectué cette procédure plusieurs fois et les raffinements présentés ici représentent une plate-forme stable pour la découverte et physiologique.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
NIDDK K08 DK090754 à Mi/h. NIGM P41 GM103493 à RDS. Ce matériau est le fruit du travail (par mi/h) qui a été pris en charge avec les ressources et l’utilisation des installations à la Portland Veterans Affairs Medical Center. Le contenu ne représente pas les vues du ministère américain des anciens combattants ou le gouvernement des États-Unis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright 2 photon microscope | Zeiss | LSM 7MP | |
| 3 axis microscope stage controller | Sutter | MP-285 | |
| 3 axis headstage controller | Sutter | MP-225 | |
| Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| FITC-dextran 2000 kDa MW | Sigma-Aldrich | 52471-1G | |
| borosilicate glass capillary tubes | Sutter | B150-110-7.5 | |
| Micropipette puller | Sutter | P-97 | |
| Quantum dots, 605 nm | Thermofisher | Q21701MP | |
| Polysiloxane | Sugru | No cat number | www.sugru.com, "original formula". Any color. |
| PE-50 tubing | Instech Labs | BTPE-50 | |
| Microinjector | WPI | UMP-3 | |
| Microinjector controller | WPI | Micro4 | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | 306-94-5 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| Coverslip, 10 mm | Harvard Apparatus | 64-0718 | |
| Headplate | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
| Head fixation device | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
| 30 G needle | Becton-Dickinson | 125393 | For retroorbital injection |
| Tuberculin syringe | Becton-Dickinson | 309626 | For retroorbital injection |
References
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