Summary
Мы представляем использование 2-Фотон микроскопии поставить микропипеткой боуменова мочевыводящих пространстве в мышей, сочетая 2 основополагающими методами почечной физиологии. Использование 2-Фотон микроскопии преодолевает критические ограничения обычных микроскопии для исследования почек физиологии micropuncture.
Abstract
Почечная micropuncture и почечной 2-фотонных изображений являются семенных методы в физиологии почек. Однако micropuncture ограничивается зависимость от обычных микроскопии поверхности нефрон функции, и 2-Фотон исследования ограничены в том, что вмешательство может оцениваться только на орган, а не на уровне нефрон. В частности micropuncture исследования клубочков мышей были оспорены, нехватки поверхностных клубочков мышей. Чтобы устранить это ограничение для того, чтобы проводить исследования аспирата из боуменова пространства в физиологической модели мыши, мы разработали 2-Фотон клубочковых micropuncture. Мы представляем Роман хирургической подготовки, что позволяет боковой доступ к функции почек при сохранении вертикальных изображений столбец требуется для 2-Фотон микроскопии. Администрация высокой молекулярной массой флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-декстрана используется для отображения видимой для визуализации 2-Фотон почечной сосудистую и, следовательно, клубочков. Квантовая точка покрытием пипетки затем представил под стереотаксической руководством по glomerulus, выбранные из несколько, чтобы многие из которых могут быть визуализированы в окне визуализации. В этом протоколе мы предоставляем подробную информацию о подготовке, материалы и методы, необходимые для выполнения процедуры. Эта технология облегчает ранее невозможно физиологическое исследование почек, включая восстановление фильтрата из боуменова пространства и все сегменты нефрон внутри изображений предел глубины, около 100 мкм ниже почечной капсулу. Давление, заряд и поток может все измерить введено пипеткой. Здесь мы предоставляем репрезентативных данных из жидкого хроматография/масс-спектрометрии, выполнена на аспирата из боуменова пространства. Мы ожидаем эту технику, чтобы иметь широкое применение в почечной физиологические исследования.
Introduction
Цель этой процедуры является рутинной micropuncture доступа к боуменова пространства и других клубочковых структур в мышах. Micropuncture исследования для почечной физиологии были ограничены 1-Фотон микроскопии, который может только изображения в несколько микрон поверхности почек, и который предлагает ограниченной точности в измерении z. Потому что мышей несколько поверхности клубочков, это не всегда возможно найти поверхности glomerulus на 1 Фотон микроскопии, поэтому большинство micropuncture исследования были проведены в Мюнхене-крыс, которые имеют более многочисленные поверхности клубочков. Таким образом преимущества работы в моделях мыши были ограничены в micropuncture исследования,12,3. Последние достижения в технологии, включая микро CT4,5, imaging наночастиц изображений6и изображений масс-спектрометрии7 значительно расширили спектр механизмов, применимых к клубочковых физиологии, но по-прежнему существует не заменит для уникальной предоставляет возможность вмешаться и образец что micropuncture. Поэтому расширение использования micropuncture с использованием представленные здесь методики, как ожидается, облегчить Роман почечной физиологии исследования, в частности, оценки содержания почечной фильтрата (то есть, метаболомики) и основные физиологии трансгенных мышей, такие как измерения давления фильтрата и обязанности, ранее выполнявшиеся только у крыс.
В этой технике использование 2-Фотон микроскопии позволяет визуализации и микропипеткой доступ к почечной структур до около 100 мкм ниже почечной капсулу. Несколько (5-10) клубочков таким образом доступны для micropuncture в каждой мыши почек отображаемого в данный момент. Хотя этот метод имеет общие черты с обычными почечной micropuncture, он был разработан de novo и требуются обширные изменения от обычного метода. В этом протоколе мы продемонстрировать стремление жидкости из пространства боуменова и показать пример результаты последующего анализа с масс-спектрометрия (nanoproteomics)8,9,10,11. Вниз по течению масс-спектрометрии для использования специализированных образец рабочего процесса подготовки, который также продемонстрировали здесь.
Protocol
Все описываемые процедуры были одобрены институциональный уход животных и использование Комитета Oregon Health и науки университета.
1. установки, используемые для демонстрации
- Используйте вертикальный 2-Фотон Микроскоп, этап 3-оси контроллера, headstage/пипеткой держателя и контроллером 3-оси для держателя headstage/пипетку; все четыре из этих элементов не требуется.
Примечание: Много аналогичных установок доступны и будет достаточно до тех пор, как независимый контроль количественных 3-оси пипетки и микроскоп этапа доступны, и Микроскоп настроен для обработки изображений в vivo вертикально.
2. материалы, необходимые до начала экспериментальной протоколы
- Используйте FITC-декстрана, 2000000 Да, 5% раствор в нормальное saline или фосфата в буфер солевой раствор для инъекций retroorbital в ознаменование почечной сосудистую. Это молекулярный вес (МВт) выбрано потому, что он остается в сосудистую и не фильтровать.
- Micropipettes машины вытащил боросиликатного стекла: тянуть micropipettes 6 – 10 мкм отзыв с помощью параметров Лонг конические, закрытых отзыв (например, тепла = 610, скорость = 150, время = 250 мс, петельные) на микропипеткой съемник. Наклона 45 ° и пламя польский слегка.
- Квантовая точка покрытие micropipettes: Пальто микропипеткой советы с квантовых точек согласно указанный протокол. 12
- Полисилоксан поддержки почек/разделители. Используйте замазку полисилоксан ремесло почки поддержки/разделители. Мода 1 x 1 см2 на 5 мм толщиной углом Ромбоид (то есть, усеченного куба) от замазки полисилоксан. Удаление среднего 70% полисилоксан от одного края и составляет около 70% центра Ромбоид круг. Разрешить полисилоксан сохнуть в течение 24 ч. Смотрите Рисунок 1.
- Microinjector подготовка: заполнять длину труб из полиэтилена (ПЭ)-50 и микропипеткой загружен микропипеткой держатель с маслом. Если планируется масс-спектрометрии, Перфтордекалин требуется, в противном случае может использоваться минеральное масло. Настройка microinjector с газонепроницаемым Гамильтон тип шприца и заполнить с Перфтордекалин. Это будет связано с труб PE-50 и держатель пипеткой.
- Поместите дозатор в пипетку держатель и вперед заполнения труб PE-50 и пипеткой, а затем прикрепить проксимальный конец PE-50 трубки для маслонаполненных Гамильтон шприц, создавая гидравлической системы с пипеткой в шприц.
3. боковой дозатор доступ к почки ниже жидкости изображений столбец через роман хирургическая процедура
Примечание: Ассамблея тепловизионные системы поддержки и хирургические prep показан на рисунке 1. Процедура, описанная выполняется на мышей C57BL/6, весом 20-25 г.
- Вес мыши.
- Вызвать обезболивание с помощью 4% изофлюрановая и поддерживать с изофлюрановая 1,5-2,5% в смеси кислородом воздуха. Убедитесь, что мышь под наркозом, отсутствие реакции на болезненный стимул и снижение частоты дыхания.
- Смазывать глаза и положение животных сбоку на плите. Иммобилизации 4 конечностей с использованием ленты.
- Придать физиологический, 200 мкл, подкожно и место ректальной температуры зонда. Контроль температуры с использованием лампой Отопление во время операции и грелку во время визуализации.
- Удалите все волосы на левой стороне мыши, с помощью депиляционный крем.
- Найдите селезенки, которая видна под кожей, и найдите левой почки на спинной и хвостовой части селезенки.
- Сделать 0,5 см надрез на коже и меньших разрез на брюшине, просто достаточно для почек протолкнуть легко.
- Выдавливание почек с нежным давлением. Место почек стабилизатор формы с полисилоксан вокруг почек и исправить с Цианакрилатный клей. Линия почки с распоркой таким образом, чтобы боковые большинство поверхности почки выходит за пределы стабилизатор около 1 мм.
- Исправить траверсой в форму стабилизатор с клеем и смонтировать голову пластина для монтажа баров на плите основания.
- Заполните также в поддержке полисилоксан вокруг почек с агарозы 1% раствор и место 10 мм coverslip на вершине и удерживайте до тех пор, пока агарозы фирмы. Печать coverslip на головы пластину с клеем и создать кольцо вокруг coverslip с стоматологического цемента.
- Ретро орбитально придать FITC-декстрана (2,000,000 да, 5% раствор, 100-150 мкл) и переместить мышь и фиксации пластины 2-Фотон микроскопа быстро, поддержание анестезии и обеспечение адекватной отходов газовой очистки на микроскопа.
4. Выбор подходящего Glomerulus и пипетки доступ к боуменова пространства
-
Определения:
- Определить X слева направо на экране и влево вправо перед Микроскоп
- Читать SX (этап X) из стадии контроллера
- Определить PX как Пипетка X, наберите на дозатор контроллер
- Определяет Y как вверх вниз на экране и вперед к Микроскоп и обратно к установке 2-Фотон
- Определить Z как вверх к потолку, вниз к полу и измерена на сцене с целью Z позиции.
- Определите S (O) Z как высота этап (действительно цель).
-
Найти на поверхности почек, идентифицируемых с помощью зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) параметры фильтра в окуляр. Из-за введения FITC-декстрана сосудистую будет ярко-зеленый.
- Определите подходящий glomerulus. После определения поверхности почек с помощью окуляра, переключитесь на 2-Фотон (режим-сканирование) и исследовать окна визуализации. Благоприятные характеристики для micropuncture являются следующие: вертикальное расстояние ниже coverslip > 30 мкм (для предотвращения столкновений между пипетки и coverslip во время доступа) и боковое расстояние от боковых почек капсулы glomerulus < 400 мкм (за это расстояние отклонение пипеткой может увеличить вероятность Мисс).
- Запись боковое и вертикальное расстояние до пункции точку, точку на почечной капсулы непосредственно в сторону пипеткой по glomerulus.
- Поднять объективных координационным центром в толщу воды, сохраняя x и координаты y стадии без изменений, на расстоянии всего около сантиметра.
- Вбить наконечник пипетки в толщу воды и включите 4', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) возбуждения. Переместите пипетку в x и y размеры к точке максимального флуоресценции кончика, это будет центр цели. Нахождение пипеткой в окуляр трудно без этой точной настройкой. Потому что квантовых точек флуоресцировать на же (в данном случае, красный) волны независимо от длины волны возбуждения, DAPI возбуждения производит красной флуоресценцией, который плотно сосредоточены на кончике, показано на рисунке 2.
- Измените настройку возбуждения на красный флуоресцирующий белок (ППП) и визуализировать пипетку в окуляр, а затем точно центр в представлении глазной.
- Переключиться на 2-Фотон и найти пипеткой под 2-фотон, поместив его точно в центре изображения. Это позиция регистрации.
- Сохраните изображение пипеткой.
- Зарегистрируйте сцену и микропипеткой контроллер координатах.
Примечание: Используйте дополнительные HTML-файл, который будет выполнять вычисления, с помощью кода JavaScript, (выгодные на системах, которые не имеют установленного таблицы программного обеспечения) или электронную таблицу для вычисления смещение между стадии и пипетки координаты и вычислить координаты цели для контроллера пипеткой. - Удаление пипеткой из столбца воды в оси x, сохраняя z и y, то же самое.
- Переместите пипетку Z целевой glomerulus Z (т.е. Перемещение пипетки вниз в направлении Z ниже coverslip)
- Переместите пипетку Y glomerulus Y координат целевого объекта.
- Переместить 2-Фотон просмотра целевой glomerulus Z, а затем края почек и отмечаем SX.
- Вычислите края почек PX, используя смещение от регистрации SX.
- Переместите этап к пипетки (увеличение SX), таким образом, чтобы край почки находится далеко в левой части экрана, но все еще видны.
- Заранее пипеткой быстро около 100 мкм меньше PX, рассчитанных выше края почек.
- Найдите кончика пипетки, продвижения пипеткой медленно. Увеличение красный выгоды и смотреть гистограммы красный пиксель (пикселей распределения сдвиги прежде чем пипеткой, отображаемого в окне, из-за экстремальных яркости квантовых точек и пробить флуоресценции).
- Выдвинуться к краю почки под живой 2-фотонных изображений.
Примечание: Перед входом почечной капсула, можно перенаправить пипетку в измерениях Y и Z. Однако это может нарушить наконечник пипетки. Более консервативные меры, если дозатор створ, является вывести в измерении X до 2 см, перенаправление и затем вернуться к краю почек в измерении X. После пипеткой внутри ткани, движение в любой оси помимо X приводит к пипеткой сгибания, которая требует большой опыт, чтобы сделать использование и часто приводит к поломке. - Привод пипеткой в оси X медленно к glom цели PX, держать глаз на SX. (Это полезно иногда вернуться к glomerulus, чтобы увидеть, если он сместился на всех после вставки микропипеткой).
- Когда Вы находитесь в правильном месте, документ позицию с z стека.
Примечание: С микропипеткой в месте, наркотики, белки или люминесцентные Индикаторы могут вводиться, жидкость может быть придыхательным для последующего анализа или давления или обязанности по отношению к другой электрод может быть измерена.
5. стремление жидкости из пространства Боуман
- Установите микронасосом придать 100 nL Перфтордекалин более 2 мин для обеспечения проходимости пипетки и сокращения, смешанным с пипеткой подключения во время входа. Reimage для обеспечения, чтобы позиции пипеткой.
- Ждать 4-6 мин для дополнительной фильтрации.
- Установите микронасосом аспирационная до 300 nL со скоростью до 50 нл/мин.
Примечание: Изменения в клубочковых морфология не наблюдается с такой скоростью, предполагая, что оно не изменяет скорость доставки жидкости в пространство при аспирации. Как блок не масло как в обычных micropuncture, восстановления этого объема, необходимого для масс-спектрометрии, могли бы включать некоторые из вводят perflourodecalin и возможно трубчатых жидкости. Для анализов электроде Ион чувствительных измерения флуоресцентной спектроскопии, полимеразной цепной реакции и других чувствительных конечных точек Нижняя тома могут быть использованы. Если масс-спектрометрия не является конечной точкой, минеральные масла и стандартных micropuncture методов может использоваться для измерения объема без наддува до хранения. - Изображение еще раз.
- Снять пипетки и сохранить образец, добавление буфера TRIS и хранения при температуре-80 ° до анализа.
- Усыпить мыши, с помощью передозировки изофлюрановая или другого утвержденного метода.
Примечание: Фильтрата входит пространство путем фильтрации от клубочковых капилляров. Скорость клубочковой фильтрации сингл нефрон (SNGFR) в мышей сообщается между 8-14 нл/мин3 Старлинг силы регулируют SNGFR, однако, и отрицательные гидростатического давления в пространстве боуменова поэтому может увеличить SNGFR. Стандартные micropuncture методы используют трубчатые блокады с маслом и нейтральный давления для трубчатых жидкости выборки, однако эти соединения вмешиваться с масс-спектрометрия (см. ниже); Таким образом в этой технике раннего проксимальных канальцах остается патент. Кроме того в то время аспирации, боуменова пространства содержит неизвестный, но положительного объема фильтрата. Таким образом скорость аспирации жидкости может превышать SNGFR.
Примечание: В эксперименты, описанные здесь, цель заключалась в получении больше чем обычно образец клубочковых фильтрата для масс-спектрометрии анализа методами nanoproteomic. Поскольку использование масс-спектрометрии исключает использование блоков масла с минеральным маслом или воском (сложные смеси органических молекул, которые уменьшают сигнал: шум в масс-спектрометрия) Перфтордекалин используется для заполнения микропипеткой и шприц. Perflourodecalin известен не блокировать трубчатых потока, но биологически инертен и не вмешиваться с масс-спектрометрии.
Representative Results
Эта процедура требует уникальный хирургической подготовки почки для доступа, который иллюстрируется на рисунке 1и 2-фотонных изображений. Эта подготовка, показанный здесь позволяет вертикальных изображений столбец с целью выше почки с несколько изменения плотности для оптики лучшие возможности для микроскопии 2-Фотон одновременно с боковой доступ для дозаторов, исключительно в горизонтальной (x ) измерение. Частичное экструзии почки предотвращает избыточное напряжение на ножке почек и сохраняет кровоток, и строительство пользовательских почек поддержки позволяет две цели визуализации и доступа. Второй задачей в этой процедуре является точное позиционирование пипеткой внутри почек в 3 измерениях, который требует регистрации систем координат пипетки и стадии. Важный шаг для этот процесс проиллюстрирован в Рисунок 2, который показывает пипеткой быть заметили в столбце воды 2-Фотон микроскопа под DAPI-возбуждения. Ввод толщу воды и регистрации координаты пипеткой тем этапа перед входом почки имеет решающее значение для точного позиционирования стереотаксической пипеткой внутри Боумен целевого пространства. Дозатор поступает изображений водяного столба от права. С возбуждением DAPI включено красный Квантовая точка покрытием пипеткой флуоресцирует ярко в красно оранжевый, и он тщательно может располагаться в середине цели. Как возбуждения луч проходит через центр цели, дозатор может свободно переехал в точке максимальной флуоресценции, обеспечение того, что она будет видна в окуляр.
Выбор надлежащего пипеткой потянув и glomerulus решающее значение для успеха этого протокола, как показано на рисунке 3, Рисунок 4, на рисунке 5. В рисунке 3Aможно увидеть должным образом вытягивано, красный люминесцентные Квантовая точка покрытием стекла микропипеткой, отображаемого в столбце жидкости во время регистрации часть пипетки процедуры. Tip – 6 микрон в ширину. В рисунке 3Bпоказано с 12 мкм кончиком пипетки, плохо вытащил. Этот пипетки не может проникнуть почечной капсула не вызывая сосудистой травмы в результате 12 мкм диаметром и нерегулярных кончик поверхности (Примечание Бур в верхней части скоса). В рисунке 3 c и 3Dпоказана важность оптимального позиционирования вместо изображений из целевого glomerulus. Красивые, вблизи поверхности glomerulus, показано на рисунке 3 c демонстрирует благоприятные изображений (из-за своей поверхности позиции в 20 мкм ниже капсула почек), но не будут пригодны для доступа к этой процедуре, потому что это слишком близко к поверхности, и Дозатор бы ударил coverslip. В рисунке 3Dпоказываются оптимально позиционируется клубочков. Обратите внимание на различные шкалу, используемый для иллюстрации оба клубочков (Масштаб гистограммы являются все 50 мкм). Эти клубочков появляются менее острым из-за рефракции, вызванных глубины; Этот образ был взят на 70 мкм ниже почечной капсулу. Край боковых почек — 250 мкм справа, оба этих клубочков доступности. Во время процедуры доступа изображения плотно сосредоточена на целевой glomerulus как показано на рисунке 4, и захвата изображений каждый второй используется, позволяя следователь точно соблюдать позиционирование пипетку в пространстве Боуман.
Рисунок 4 иллюстрирует типичный почечной вход и результат, наконечник пипетки боуменова пространстве. В рисунке 4Aпроекции средней интенсивности от z стека с ортогональных демонстрирует наконечник пипетки в пространстве Боуман. Обратите внимание, что красная пипеткой кончик спектральных артефакт (круглый шар флуоресценции) из-за чрезвычайно яркий флуоресцентной квантовых точек, расположенных на конической части кончика. В Рисунок 4Bтома проекция z стек данных демонстрирует другой пипетку в пространстве Боуман. Обратите внимание, что пипетки вытащили Bowman's капсула в направлении движения на въезд, создавая очевидной палаток за кончик, как описано в протоколе.
На рисунке 5результаты неудачных процедуры указаны в котором пипетки с слишком большим отверстием сломал в почечной капсула, вызывая кровотечение. Пипеткой был слишком тупой; При попытке пройти почечной капсулу, капсулу толкнул впереди наконечник пипетки пока поломка произошла. В этот образ капсула почек является видимым, усиливается subcaspular кровотечение, FITC-флуоресцентный зеленый. FITC сигнал видимым в пипетку, сам, указывающее крови под давлением вступил пипеткой люмен. Стрелка указывает много красных кровяных клеток, видимый в пределах пипеткой просвета как замещения дефектов в FITC-декстрана.
Рисунок 6 изображает представитель массовых спектр полученные от боуменова пространства аспирата, мыши моче белок 17 (MUP17). Наконец Таблица 1 демонстрирует пример результаты успешных стремление процедур, листинг белки, выявленных с помощью масс-спектрометрии наноразмерных на аспирата, собраны более 6 минут от каждой из 3 мышей. В каждом случае пипеткой был образ он был отозван из боуменова пространства, а не FITC флуоресценции наблюдалось в пределах боуменова пространства или пипетки люмен, что указывает отсутствие загрязнения аспирата с плазмой. 17 белков, главным образом низкой молекулярной массой, были определены от минимум 2 уникальных пептидов на белок. Спектральная графов низкий, в соответствии с предварительной оценки белка в клубочковых фильтрата, и известный отфильтрованных белков, таких как витамин D связывания белков (VTDB), альбумина (АЛБУ) и основных моче белок 17 (MUP17) присутствуют.
Рисунок 1: частичное экструзии почки с пользовательской поддержки и иммобилизации для боковых доступа. Слева показаны части поддержка обработки изображений столбец и почек, с полным собранием в центре. Справа, подготовка почек показано до (см. выше) и после (применения поддержки см. ниже). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: завершено почек prep на этапе регистрации пипеткой протокола. Здесь DAPI возбуждения используется для позиционирования микропипеткой в толщу воды 2 фотона микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Imaging пипетки и почек после инъекции FITC-декстрана, демонстрируя подходящих и неподходящих клубочков для micropuncture. A. хорошо вытащил пипетку с 6 мкм кончиком. B. грубой обрезная, тупой совет. C. эта glomerulus четко, но слишком близко к coverslip для micropuncture. D. Подходяще позиционируется клубочков. Масштаб гистограммы являются все 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: успешный пипеткой проход приводит к размещение в боуменова пространства вид от 2 различных процедур. A. Z-стек с ортогональной проекции демонстрирует наконечник пипетки в пространстве боуменова примыкающих клубочковых пучок. Шкалы бар-50 мкм. б. Объемный рендеринг из z стека аналогичным образом демонстрирует пипетки в пространстве боуменова примыкающих клубочковых пучок. Шкалы бар-100 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: процедура неудачной из-за тупой пипетки, разрывая почечной капсулы и ведущих к кровотечению в пипетку люмен. FITC флуоресценции из extravasated плазмы и эритроцитов (стрелка) видны в пипетку. Стрелка указывает на красные кровяные клетки видимым в пипетку люмен. Шкалы бар-50 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: массовые спектр для основных моче белок 17 (MUP17), полученные из наноразмерных жидкой хроматография/масс спектрометрии анализ аспирата пространства боуменова. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Белка | МВт (kD) | Значит, спектральные фото |
| ACTA_MOUSE | 42 | 2 |
| ACTB_MOUSE | 42 | 1 |
| CLPX_MOUSE | 69 | 2.5 |
| DHSA_MOUSE | 73 | 1 |
| FOLR2_MOUSE | 29 | 1 |
| GBLP_MOUSE | 35 | 1 |
| ALBU_MOUSE | 66 | 6.7 |
| HBA_MOUSE | 15 | 2 |
| HBB1_MOUSE | 16 | 1 |
| MIB1_MOUSE | 110 | 1 |
| MUP17_MOUSE | 21 | 1 |
| PERI_MOUSE | 54 | 1 |
| RNAS4_MOUSE | 17 | 2 |
| SPTB1_MOUSE | 2 | 1 |
| VIME_MOUSE | 54 | 1 |
| VTDB_MOUSE | 53 | 1 |
Таблица 1: Список белков, выявленных в боуменова пространства аспирата из 3 мышей.
Дополнительные видео 1: объемный рендеринг из z стека, приобретенные после позиционирования пипетки в пространстве боуменова демонстрирует наконечник пипетки в пространстве, примыкающих капиллярных Клок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Мы представляем метод для доступа к боуменова пространства-поверхность клубочков в мышей, облегчается 2-Фотон микроскопии. Мы разработали эту процедуру для решения ключевых ограничение клубочковых micropuncture, редкость поверхности клубочков адресуются по микроскопии 1-Фотон в мышей, для облегчения объективной экспериментальный, аспирации жидкости из боуменова пространства для последующий анализ. Развития и практики этого метода основывается на шести важных шагов. Во-первых Роман хирургической подготовки должны тщательно осуществляться таким образом, что изображений водяного столба не бежать coverslip и coverslip простирается над районом почки, который является целевым объектом пипеткой. Во-вторых стеклянные пипетки для micropuncture должно быть вынесено видимым для микроскопии 2-фотон, которая достигается использованием квантовых точек. В-третьих, стереотаксическая техника требуется точно позиционировать пипетки в пространстве боуменова в трех измерениях, до 100 мкм ниже поверхности почек. Таким образом регистрации систем координат пипетки и стадии с точностью являются важнейшие шаги. В-четвертых, тщательный выбор целевого glomerulus необходимо убедиться, что она доступна для пипетки без покушение структуры поддержки почек и изображений столбец. И наконец внимание должно уделяться аналитически шаги следовать процедуре приобретения, и объем и сроки приобретения жидкости образцов должны соответствовать к анализу и клубочковых физиологии.
Мы разработали процедура приобретения, которая может быть распространена на многие анализов, включая традиционные micropuncture конечных точек, например пламенной фотометрии, Ион чувствительных Электроды измерения или измерения давления, объема или заряда. Кроме того мы считаем, что этот метод будет поддаваться Роман аналитически конечных точек, включая полимеразной цепной реакции (возможно после обратной транскрипции для miRNA) и метаболомики вниз по течению, масс-спектрометрии. Специальные модификации, используемых для облегчения масс-спектрометрии, заслуживают дополнительного обсуждения, и они налагают определенные ограничения. Во-первых хотя масс-спектрометрия очень чувствительна, Низкопротеиновое содержание и объем micropuncture образцов оказывает анализа белка ниже динамический диапазон обычных протеомических исследований, и поэтому были упрощенный nanoproteomics необходимости. 8 , 13 во-вторых, чтобы оптимизировать урожайность белка для раннего анализов, мы определили, что 200-300 nL аспирата было необходимо, но de novo фильтрата приобретение этого тома может быть столько, сколько 20 минут аспирации потребовало бы если мышь Федеративная Республика Германия является только 8-14 nL 3/мин. Как Тодзио и Endou показали, что длительное стремление изменяет содержание альбумина ранних проксимальных канальцах жидкости14, мы избрали аспирационная более 6 минут; Однако это означает, что наши стремления скорость превышает скорость приток фильтрата. Пользователям этой процедуры рекомендуется рассмотреть физиологии клубочковой фильтрации в их экспериментальной системы в разработке их рабочего процесса. Масс-спектрометрия, чувствительной технологией, будут перегружены сигнал от введено нефтяной дистиллят как минеральное масло, которое широко используется в micropuncture составляют гидравлической системы для аспирации и изолировать сегментов нефрон. Таким образом мы не могли использовать минеральное масло для этой цели, или его общего использования, количественная оценка объема nanoliter диапазон образцов. Вместо этого мы заполняем систему Перфтордекалин, который является биологически инертным, не беспокоить масс-спектрометрии и имеет благоприятные оптические характеристики. Мы считаем, что ограничения, налагаемые Перфтордекалин преодолимыми и работают на дополнительных технических инноваций, которые мы ожидаем, что позволит измерение объема выборки и блокады трубчатых сегмента.
Большинство micropuncture исследования были проведены в Мюнхене-крыс, которые демонстрируют увеличение числа поверхности клубочков, но это значительно ограничены физиологическое исследование трубчатых транспорта и других почечных физиологии за потери основных инструмент, молекулярной биологии, трансгенных мышей2,3. Потому что он облегчает доступ микропипеткой боуменова пространства в мышей, Роман технику поэтому снижает эти критические ограничения. Мы приняли этот метод для доступа к почечной фильтрата для протеомических исследований с помощью масс-спектрометрии высок чувствительности, известный как nanoproteomics9. Однако есть вероятно дополнительного приложения. К примеру почечной физиологическое исследование отфильтрованных белка был значительно помог с использованием трасеров флуоресцентной с 2-Фотон микроскопии15,16,17. Дополнение micropuncture к 2-Фотон микроскопии предлагает возможность выполнения сингл нефрон физиологическое исследование с флуоресцентных молекул, позволяя соседних, не вводили нефронов в качестве элементов управления. Остается надеяться, что это четкое объяснение необходимые шаги позволят широкое принятие в лабораториях, уже оборудованы 2-Фотон микроскопии и/или micropuncture. Хотя это сложный, мы выполнили эту процедуру сейчас много раз и уточнения, представленные в настоящем документе представляют собой стабильную платформу для физиологического обнаружения.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
NIDDK K08 DK090754 до GM103493 Миль/ч. NIGMS P41 службы удаленных рабочих столов. Этот материал является результатом работы (по миль/ч), которая была поддержана с ресурсами и использования помещений в медицинском центре дел ветеранов Портленд. Содержимое не представляют взгляды Департамента США по делам ветеранов или правительства Соединенных Штатов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright 2 photon microscope | Zeiss | LSM 7MP | |
| 3 axis microscope stage controller | Sutter | MP-285 | |
| 3 axis headstage controller | Sutter | MP-225 | |
| Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| FITC-dextran 2000 kDa MW | Sigma-Aldrich | 52471-1G | |
| borosilicate glass capillary tubes | Sutter | B150-110-7.5 | |
| Micropipette puller | Sutter | P-97 | |
| Quantum dots, 605 nm | Thermofisher | Q21701MP | |
| Polysiloxane | Sugru | No cat number | www.sugru.com, "original formula". Any color. |
| PE-50 tubing | Instech Labs | BTPE-50 | |
| Microinjector | WPI | UMP-3 | |
| Microinjector controller | WPI | Micro4 | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | 306-94-5 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| Coverslip, 10 mm | Harvard Apparatus | 64-0718 | |
| Headplate | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
| Head fixation device | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
| 30 G needle | Becton-Dickinson | 125393 | For retroorbital injection |
| Tuberculin syringe | Becton-Dickinson | 309626 | For retroorbital injection |
References
- Schnermann, J. Micropuncture analysis of tubuloglomerular feedback regulation in transgenic mice. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (12), 2614-2619 (1999).
- Lorenz, J. N. Micropuncture of the kidney: a primer on techniques. Comprehensive Physiology. 2 (1), 621-637 (2012).
- Vallon, V. Micropuncturing the nephron. Pflugers Archive. European Journal of Physiology. 458 (1), 189-201 (2009).
- Perrien, D. S., et al. Novel methods for microCT-based analyses of vasculature in the renal cortex reveal a loss of perfusable arterioles and glomeruli in eNOS-/- mice. BMC Nephrology. 17, 24 (2016).
- Ehling, J., et al. Quantitative Micro-Computed Tomography Imaging of Vascular Dysfunction in Progressive Kidney Diseases. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (2), 520-532 (2016).
- Gimenez, Y., et al. 3D Imaging of Nanoparticle Distribution in Biological Tissue by Laser-Induced Breakdown Spectroscopy. Scientific Reports. 6, 29936 (2016).
- Miyamoto, S., et al. Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator. EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).
- Piehowski, P. D., Zhao, R., Moore, R. J., Clair, G., Ansong, C. Quantitative proteomic analysis of mass limited tissue samples for spatially resolved tissue profiling. Methods in Molecular Biology. , (2017).
- Yi, L., Piehowski, P. D., Shi, T., Smith, R. D., Qian, W. J. Advances in microscale separations towards nanoproteomics applications. Journal of Chromatography A. 1523, 40-48 (2017).
- Clair, G., et al. Spatially-resolved proteomics: Rapid quantitative analysis of laser capture microdissected alveolar tissue samples. Scientific Reports. 6, 39223 (2016).
- Huang, E. L., et al. SNaPP: Simplified nanoproteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities. Endocrinology. 157 (3), 1307-1314 (2016).
- Andrasfalvy, B. K., et al. Quantum dot-based multiphoton fluorescent pipettes for targeted neuronal electrophysiology. Nature Methods. 11 (12), 1237-1241 (2014).
- Huang, E. L., et al. SNaPP: Simplified nano-proteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities. Endocrinology. 157 (3), (2016).
- Tojo, A., Endou, H. Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique. American Journal of Physiology. 263 (4 Pt 2), F601-F606 (1992).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).
- Sandoval, R. M., Kennedy, M. D., Low, P. S., Molitoris, B. A. Uptake and trafficking of fluorescent conjugates of folic acid in intact kidney determined using intravital two-photon microscopy. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 287 (2), C517-C526 (2004).
- Salmon, A. H., et al. Loss of the endothelial glycocalyx links albuminuria and vascular dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (8), 1339-1350 (2012).
