Summary
Vi presenterer bruk av 2-fotonet mikroskopi å plassere brønnene i Bowmans urin plass i mus, kombinere 2 grunnleggende teknikker av nyre fysiologi. Bruk av 2-fotonet mikroskopi overvinner kritiske begrensninger av konvensjonelle mikroskopi for micropuncture nyre fysiologi studier.
Abstract
Nyre micropuncture og nyre 2-fotonet tenkelig er banebrytende teknikker i nyre fysiologi. Men micropuncture er begrenset av avhengighet av konvensjonelle mikroskopi til overflaten nyre funksjoner, og 2-fotonet studier er begrenset i at intervensjoner kan bare vurderes på orgel, i stedet for nyre nivået. Spesielt har micropuncture studier av glomeruli mus blitt utfordret av mangelen på overflaten glomeruli i mus. For å løse denne begrensningen for studier av leveringstanken fra Bowmans plass i musen fysiologiske modeller, utviklet vi 2-fotonet glomerular micropuncture. Vi presenterer en ny kirurgisk forberedelse som gir lateral tilgang til nyrene samtidig bevare den nødvendige loddrette tenkelig kolonnen for 2-fotonet mikroskopi. Administrasjon av høy molekylvekt fluorescein isothiocyanate (FITC)-dekstran brukes til å gjengi den nyre blodkar og derfor glomeruli synlig for 2-fotonet bildebehandling. En quantum dot-belagt pipette er deretter innført under stereotactic veiledning til en glomerulus valgt fra flere mange som kan visualiseres i vinduet tenkelig. I denne protokollen gir vi detaljene av forberedelse, materialer og metoder som er nødvendig for å utføre prosedyren. Denne teknikken gjør tidligere umulige fysiologiske studie av nyre, inkludert utvinning av filtratet fra Bowmans plass og alle segmenter av nyre innen bildebehandling dybde, ca 100 µm under nyre kapselen. Press, kostnad og flyt kan alle bli målt ved hjelp av introduserte pipette. Her gir vi representant data fra flytende kromatografi/massespektrometri på leveringstanken fra Bowman's space. Vi forventer denne teknikken å ha bred anvendelse i nyre fysiologiske etterforskning.
Introduction
Formålet med denne fremgangsmåten er rutinemessig micropuncture tilgang til Bowmans plass og andre glomerular strukturer i mus. Micropuncture studier for nyre fysiologi har vært begrenset til 1-fotonet mikroskopi, som kan bare bildet innenfor noen få mikroner av nyre overflaten, og som tilbyr begrensede presisjon i z-dimensjonen. Fordi mus har noen overflate glomeruli, det er ikke alltid mulig å finne en overflate glomerulus av 1-fotonet mikroskopi, derfor de fleste micropuncture studier er utført i München-Wistar rotter, som har flere overflaten glomeruli. Derfor har fordelene ved å jobbe i musen modeller vært begrenset i micropuncture studier1,2,3. Nylige fremskritt innen bildebehandling teknologier, inkludert mikro-CT4,5, hydrogenion imaging6og imaging massespektrometri7 har kraftig forbedret utvalget av modaliteter for glomerular fysiologi, men Det er ingen erstatning for den unike muligheten til å gripe inn og prøve det micropuncture gir. Derfor utvide bruken av micropuncture ved hjelp av teknikker som presenteres her er forventet å lette romanen nyre fysiologi studier, spesielt evaluering av innholdet i nyre filtratet (dvs., metabolomics) og grunnleggende fysiologi av transgene mus, for eksempel målinger av filtratet press og kostnad, tidligere utført bare i rotter.
I denne teknikken kan bruk av 2-fotonet mikroskopi visualisering og brønnene tilgang til nyre strukturer til ca 100 µm under nyre kapselen. Flere (5-10) glomeruli er derfor tilgjengelig for micropuncture i hver mus nyre hittil fotografert. Selv om denne teknikken deler noen funksjoner med konvensjonelle nyre micropuncture, det var designet de novo og omfattende endringer fra konvensjonelle teknikk er nødvendig. I denne protokollen vi demonstrere aspirasjon av væske fra Bowmans plass og viser eksempel resultatene av påfølgende analyse med massespektrometri (nanoproteomics)8,9,10,11. Nedstrøms krever massespektrometri en spesialisert eksempel forberedelse arbeidsflyt som er også vist her.
Protocol
Alle prosedyrene som er beskrevet her ble godkjent av den institusjonelle Animal Care og bruk Committee of Oregon Health & Science University.
1. installasjon brukt
- Bruke en oppreist 2-fotonet mikroskop, en 3-akse scenen kontroller, en headstage/pipette holder og en 3-akse kontroller for headstage/pipette abonnenten; alle fire av disse elementene er nødvendig.
Merk: Mange lignende oppsett er tilgjengelige og vil nok så lenge uavhengig kvantitative 3-akse kontroll av pipette og mikroskopet scenen er tilgjengelige, og mikroskopet er satt opp for i vivo oppreist bildebehandling.
2. materiale som er nødvendig før du starter eksperimentelle protokoller
- Bruk FITC-dekstran, 2.000.000 Da, 5% løsning i vanlig saltvann eller fosfat-bufret saltløsning i retroorbital injeksjon for å markere den nyre blodkar. Denne molekylvekt (MW) velges fordi det er fortsatt i blodkar og filtrere.
- Maskin-trakk Borosilikatglass Mikropipetter: trekke Mikropipetter 6 – 10 µm tips med lang-taper, lukket tips innstillinger (f.eks varme = 610, hastighet = 150, tid = 250 ms, løkker) på en brønnene avtrekker. Skråkant til 45° og flamme-polske lett.
- Quantum-dot belegg av Mikropipetter: Coat brønnene tips med kvante prikker i henhold til refererte protokollen. 12
- Polysiloxane nyre støtte/spacer. Bruk polysiloxane putty for å utforme en nyre støtte/avstand. Mote en 1 x 1 cm2 av 5 mm tykk rettvinklede rhomboid (dvs., en avstumpet kube) fra polysiloxane putty. Fjern midten 70% av polysiloxane fra en kant og en sirkel bestående av ca 70% av sentrum av rhomboid. Tillat polysiloxane tørke for 24 timer. Se figur 1.
- Microinjector forberedelse: Prefill en lengde av polyetylen-50 rør og brønnene lastet brønnene holder med olje. Hvis massespektrometri er planlagt, perfluorodecalin er nødvendig, ellers mineralolje kan brukes. Definer microinjector med en gass-tette Hamilton-type sprøyten og fyll med perfluorodecalin. Dette vil være koblet til PE-50 rør og pipette holderen.
- Plasser Pipetter i pipette innehaveren frem fylle PE-50 rør og pipette, og den proksimale enden av PE-50 rør til olje-fylt Hamilton sprøyten, skape et hydraulisk system fra pipette å sprøyte.
3. lateral Pipette tilgang til nyrene under en væske Imaging kolonnen via en roman kirurgisk prosedyre
Merk: Montering av tenkelig støtte systemet og kirurgisk prep er vist i figur 1. Fremgangsmåten utføres på C57BL/6 mus veier 20-25 g.
- Veie musen.
- Indusere anestesi med 4% isoflurane og vedlikehold med 1.5-2.5% isoflurane i luft/oksygen blanding. Bekreft at musen er anesthetized ved fravær av svar smertefulle stimuli og redusert respirasjonsfrekvens.
- Smør øynene og plasser dyr sideveis på en plate. Nakkens 4 ekstremiteter med tape.
- Injisere normal saline, 200 µL, subcutaneously og plassere en endetarms temperatur probe. Kontroll temperatur bruke en varme lampe kirurgi og en heten pute under bildebehandling.
- Fjerne alle hår på venstre side av musen bruker en depilatory fløte.
- Finn milten, synlig under huden og finne venstre nyre på rygg og caudal side av milten.
- Gjøre en 0,5 cm snitt i huden og mindre snitt på peritoneum, akkurat nok for nyrene å presse gjennom lett.
- Extrude nyrene med lett press. Plasser nyre stabilisator skjemaet laget med polysiloxane rundt nyre og fikse med cyanoakrylatlim. Linje nyrene med avstandsstykket slik at lateral mest overflaten av nyre strekker seg utover stabilisatoren av ca 1 mm.
- Fikse en hodet plate for å stabilisere skjemaet med lim og montere hodet platen til montering barer på bunnplate.
- Fylle brønnen i polysiloxane støtte rundt nyrene med 1% agarose løsning og plasser 10 mm dekkglassvæske på og hold agarose er fast. Seal dekkglassvæske til hodet plate med lim og opprette en ring rundt dekkglassvæske med dental sement.
- Injisere FITC-dekstran (2.000.000 Da, 5% løsning, 100-150 µL) retro-orbitally og flytte musen og fiksering platen til 2-fotonet mikroskop scenen raskt, opprettholde anestesi og sikre tilstrekkelig røykgass scavenging på mikroskopet scenen.
4. valg av en egnet Glomerulus og Pipette tilgang til Bowmans plass
-
Definisjoner:
- Definere X som venstre-høyre på skjermen og venstre-høyre mot mikroskopet
- Les SX (trinn X) fra scenen kontrolleren
- Definere PX som pipette X, på pipette ringe kontrolleren
- Definere Y som opp-ned på skjermen og fremover mot mikroskopet og tilbake mot 2-fotonet oppsettet
- Definere Z så opp mot taket, ned mot gulvet, og målt på scenen med målet Z posisjon.
- Definere S (O) Z som scenen (virkelig målet) høyden.
-
Finne overflaten av nyrene identifiserbar bruker innstillinger for grønne fluorescerende protein (GFP) i okulær. På grunn av injeksjon av FITC-dekstran blir er blodkar lys grønn.
- Identifisere en passende glomerulus. Etter å identifisere overflaten av nyrene ved hjelp av okulære, Bytt til 2-fotonet (ikke-skanning modus) og utforske vinduet tenkelig. Gunstige egenskaper for micropuncture er følgende: loddrett avstand under dekkglassvæske > 30 µm (for å unngå kollisjon mellom pipette og dekkglassvæske under tilgang) og lateral avstanden fra laterale nyre kapselen til glomerulus < 400 µm (utover denne avstanden avviket i pipette kan øke sannsynligheten for en glipp).
- Registrere laterale og loddrett avstand til punktering punkt, et punkt på nyre kapselen direkte til pipette-siden på glomerulus.
- Høyne objektive fokuspunkt i kolonnen vann, holde x og y scenen koordinatene uendret, en avstand på bare om en centimeter.
- Kjøre pipette spissen i vannsøylen og aktivere 4', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) eksitasjon. Flytte Pipetter i x- og y dimensjoner til poenget med maksimal fluorescens tips, vil dette være midten av målet. Finne Pipetter i okulær er vanskelig uten denne presise prepositioning. Fordi kvante prikker fluoresce på samme (i dette tilfellet, rød) bølgelengde uansett eksitasjon bølgelengde, produserer DAPI magnetisering røde fluorescens som er tett fokusert på spissen, illustrert i figur 2.
- Endre innstillingen eksitasjon røde fluorescerende protein (RFP) og visualisere Pipetter i okulær, så nøyaktig Midtstiller den i visningen okulær.
- Bytt til 2-fotonet og finne pipette under 2-fotonet, plasserer den nøyaktig i midten av bildet. Dette er registrering posisjonen.
- Lagre et bilde av pipette.
- Registrere scenen og brønnene kontrolleren koordinatene.
Merk: Bruk ekstra HTML-fil, som vil utføre beregninger ved hjelp av JavaScript-kode, (fordelaktig på systemer som ikke har installert regneark) eller et regneark til å beregne forskyvningen mellom scenen og pipette koordinater og beregne målkoordinaten for pipette-kontrolleren. - Fjern pipette fra kolonnen vann i x-aksen, holde z og y den samme.
- Flytte pipette Z til målet glomerulus Z (dvs. flytte pipette ned i Z-retningen under dekkglassvæske)
- Flytte pipette Y til målet glomerulus Y-koordinat.
- Flytte 2-fotonet live view målet glomerulus Z og deretter kanten av nyrene og Merk SX.
- Beregne nyre kanten PX bruker forskyvningen fra registrering SX.
- Flytte scenen mot Pipetter (økning SX) slik at kanten av nyre er langt til venstre på skjermen, men fortsatt synlig.
- Videre pipette raskt til ca 100 µm mindre enn nyre kanten PX beregnet ovenfor.
- Finn pipette spissen, fremme pipette sakte. Øke rød gevinsten og se røde pixel histogrammet (piksel distribusjon Skift før pipette er avbildet i vinduet på grunn av ekstrem lysstyrken i kvante prikker og off-målet fluorescens).
- Forhånd nyre kanten under live 2-fotonet bildebehandling.
Merk: Før inn nyre kapselen, det er mulig å omdirigere Pipetter i Y og Z-dimensjonene. Dette kan imidlertid bryte pipette spissen. En mer konservativ tiltak, er hvis pipette er nådd, å trekke i X-dimensjon opptil 2 cm, viderekobling og deretter tilbake i X dimensjonen nyre kanten. Når pipette er i vevet, bevegelse i alle akse enn X fører til pipette refleksjoner som krever stor erfaring å gjøre bruk av, og ofte fører til brudd. - Kjøre Pipetter i X-aksen sakte glom målet PX, for å holde et øye på SX. (Det er nyttig å noen ganger gå tilbake til glomerulus å se hvis flyttet hele ved innsetting av brønnene).
- Når du er på riktig lokasjon, dokumentposisjon med en z-stabel.
Merk: Med brønnene på plass, narkotika, proteiner eller fluorescerende tracers kan injiseres, væske kan være aspirated for senere analyse eller trykk eller kostnader i forhold til en annen elektrode kan måles.
5. aspirasjon av væske fra Bowmans plass
- Angi micropump å injisere 100 nL av perfluorodecalin over 2 min å sikre patency av pipette og redusere confounding fra pipette koble under oppføringen. Reimage slik pipette posisjon.
- Vent 4-6 min for ekstra filtrering.
- Angi micropump som inneholder opptil 300 nL med en hastighet på opptil 50 nL/min.
Merk: Endringer i glomerular morfologi er ikke observert med denne hastigheten, tyder det ikke endrer prisen for levering av væske til plass under aspirasjon. Som det er ingen olje-blokkere som konvensjonelle micropuncture, kan utvinning av dette volumet, nødvendig for massespektrometri, inneholde noen av de injiserte perflourodecalin og muligens rørformede væske. For analyser som ion-sensitive elektrode målinger fluorescens spektroskopi, polymerasekjedereaksjons og andre sensitive endepunktene, kan lavere volumer brukes. Hvis massespektrometri ikke er sluttpunktet, kan mineralolje og standard micropuncture teknikker brukes til å måle aspirerede volumet før lagring. - Bildet igjen.
- Ta ut pipette og bevare prøven, legge TRIS buffer og lagring på-80 ° før analyse.
- Euthanize musen bruker en overdose av isoflurane eller annen godkjent metode.
Merk: Filtratet inn i rommet ved filtrering fra glomerular kapillærene. Single-nyre glomerular filtrering ofte (SNGFR) i mus er rapportert mellom 8 – 14 nL/min.3 Starling styrker styrer SNGFR, imidlertid, og negative hydrostatisk trykk i Bowmans plass derfor kan øke SNGFR. Standard micropuncture metoder bruker rørformet blokaden med olje og nøytrale press for rørformede fluid sampling, men disse forbindelsene forstyrre massespektrometri (se nedenfor) Derfor i denne teknikken fortsatt i tidlig proksimale tubule patent. Videre, ved aspirasjon, Bowmans plass inneholder en ukjent, men positivt antall filtratet. Derfor overskride væske aspirasjon rate SNGFR.
Merk: I eksperimenter beskrevet her, målet var å få et større enn vanlig eksempel på glomerular filtratet for massespektrometri analyse av nanoproteomic teknikker. Siden bruken av massespektrometri utelukker bruk av olje blokker med mineral olje eller voks (komplekse blandinger av organiske molekyler som reduserer signal: støy i massespektrometri) brukes perfluorodecalin til å fylle brønnene og sprøyten. Perflourodecalin er ikke kjent for å blokkere rørformede flyt, men er biologisk inert og forstyrrer ikke massespektrometri.
Representative Results
Denne prosedyren krever en unik kirurgisk forberedelse av nyre for 2-fotonet bildebehandling og access, som er illustrert i figur 1. Dette preparatet vises her gjør en vertikal tenkelig kolonne med mål over nyrene med få tetthet endringer for best mulig optikk for 2-fotonet mikroskopi samtidig med lateral tilgang for pipette, drevet utelukkende i horisontal (x ) dimensjon. Delvis utelukkelse av nyre hindrer overflødig spenning på den nyre pedicle og bevarer vaskulær flyt, og byggingen av en egendefinert nyre-støtte lar to målene for bildebehandling og tilgang. Den andre utfordringen i denne fremgangsmåten er nøyaktig posisjonering av Pipetter i nyrene i 3 dimensjoner, som krever registrering av koordinatsystemer pipette og scene. Det kritiske trinnet for denne prosessen er illustrert i figur 2, som viser pipette ble oppdaget i kolonnen vann 2-fotonet mikroskopet under DAPI-eksitasjon. Inn vannsøylen og registrere koordinatene til Pipetter til de av scenen før inn nyre er avgjørende å aktivere presis stereotactic plassering av pipette innen målet Bowman's. Pipette inn tenkelig vannsøylen fra høyre. Rød quantum dot-belagt pipette fluoresces lyst i rød-oransje DAPI eksitasjon slått på, og det kan være nøye plassert under midten av målet. Som eksitasjon strålen går gjennom midten av målet, kan pipette flyttes fritt til poenget med maksimal fluorescens, sikre at det vil være synlig i i okularet.
Riktig pipette trekke og glomerulus utvalg er avgjørende for suksessen til denne protokollen, som vist i Figur 3, Figur 4, figur 5. I figur 3A, kan riktig trakk, rød-fluorescerende quantum dot-belagt glass brønnene fotografert i kolonnen væske under delen pipette registrering prosedyren sees. Spissen er 6 mikron i bredde. Figur 3Bvises en dårlig trukket pipette med 12 µm spissen. Denne pipette trenge ikke nyre kapselen uten å forårsake vaskulær traumer 12 µm diameter og uregelmessig tips overflaten (Merk bur på toppen av skråkant). I Figur 3 c og 3Dvises viktigheten av optimal plassering i stedet for imaging av målet glomerulus. Den vakre, nær overflaten glomerulus illustrert i Figur 3 c viser gunstige imaging (på grunn av sin overflaten posisjon på 20 µm under nyre kapselen) men ikke ville være egnet for tilgang av dette fordi det er for nær overflaten, og pipette ville rammet av dekkglassvæske. I figur 3Dvises optimalt plassert glomeruli. Merk forskjellige målestokk å illustrere både glomeruli (skala barer er alle 50 µm). Disse glomeruli vises mindre skarp på grunn av brytning forårsaket av dybden; Dette bildet ble tatt på 70 µm under nyre kapselen. Lateral nyre kanten er 250 µm til høyre, slik at begge disse glomeruli er tilgjengelig. Under en tilgang prosedyren imaging er tett fokusert på målet glomerulus som i Figur 4, og alle andre bildeopptak brukes, slik at etterforsker å observere nøyaktig plassering av Pipetter i Bowmans plass.
Figur 4 illustrerer en typisk nyre post og resultatet, en pipette tips innen Bowman's. I figur 4Aviser en mener intensitet projeksjon fra en z-stabel med ortogonale utsikt pipette tipset i Bowmans plass. Merk at det røde pipette tips spectral gjenstand (runde ballen av fluorescens) på grunn av svært lyse fluorescens til quantum prikkene arrangert på delen konisk tips. Figur 4Bviser en volum projeksjon av z-stack data en pipette i Bowmans plass. Merk at pipette dratt Bowman's capsule i kjøreretningen på oppføring, opprette tilsynelatende Notting bak spissen som beskrevet i protokollen.
I figur 5vises resultatene av en mislykket prosedyre der en pipette med en altfor store åpning brøt på nyre kapselen, forårsaker blødninger. Pipette var altfor sløv; på forsøker å passere nyre kapselen, ble kapselen presset foran pipette spissen før brekkasje oppstod. I dette bildet er nyre kapselen synlig, forsterket av subcaspular blødning, i FITC-fluorescerende grønne. FITC signalet er synlig pipette, indikerer at blod presset inn pipette lumen. Pilen peker på mange røde blodlegemer synlig pipette lumen som fyller feil i FITC-dekstran.
Figur 6 viser et representativt masse spekter fra Bowmans plass leveringstanken, musen urin protein 17 (MUP17). Til slutt, tabell 1 viser eksempel resultatene av vellykkede aspirasjon prosedyrer, oppføring proteiner identifisert med nanoskala massespektrometri på leveringstanken samlet over 6 minutter fra hver av 3 mus. I hvert tilfelle, ble pipette avbildet som den tilbake fra Bowmans plass, og ingen FITC fluorescens ble observert i Bowmans plass eller pipette lumen, som indikerer manglende leveringstanken forurensning med plasma. 17 proteiner, hovedsakelig av lav molekylvekt, ble identifisert av minst 2 unike peptider per protein. Spectral teller er lave, konsekvent med tidligere anslag av proteinet i glomerular filtratet kjent filtrerte proteiner, som vitamin D bindende protein (VTDB), albumin (ALBU) og store urin protein 17 (MUP17) er tilstede.
Figur 1: delvis utelukkelse av nyrene med tilpasset støtte og immobiliseringsløsninger til laterale tilgang. Til venstre vises deler av tenkelig kolonne og nyre støtte, med hele samlingen i sentrum. Til høyre vises nyre forberedelse før (over) og etter (under) av støtte. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: fullført nyre prep på pipette registrering trinn av protokollen. Her brukes DAPI eksitasjon til å plassere brønnene i kolonnen vann 2 Foton mikroskopet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Imaging Pipetter og nyre etter injeksjon av FITC-dekstran, demonstrere passende og upassende glomeruli for micropuncture. A. en godt trakk pipette med 6 µm spissen. B. en ujevne kanter, butt tupp. C. denne glomerulus er godt definert, men for nær dekkglassvæske for micropuncture. D. Plassert passende glomeruli. Skala barer er alle 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: vellykket pipette passasje fører til plassering i Bowmans plass-utsikt fra 2 ulike prosedyrer. A. Z stabel med orthogonal anslag viser pipette tips i Bowmans plass tilstøtende glomerular tuft. Skala bar er 50 µm. B. Volum rendering fra z-stack tilsvarende demonstrerer en pipette i Bowmans plass tilstøtende glomerular tuft. Skala bar er 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: en mislykket prosedyre på grunn av en stump pipette, rive nyre kapselen og fører til blødning i pipette lumen. FITC fluorescens fra extravasated plasma og røde blodlegemer (pil) er synlige i pipette. Pilen peker på røde blodlegemer synlig pipette lumen. Skala bar er 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: mass spekteret for store urin protein 17 (MUP17), fra nanoskala flytende Ture/mass massespektrometri analyse av Bowmans plass leveringstanken. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Protein | MW (kD) | Mener Spectral teller |
| ACTA_MOUSE | 42 | 2 |
| ACTB_MOUSE | 42 | 1 |
| CLPX_MOUSE | 69 | 2.5 |
| DHSA_MOUSE | 73 | 1 |
| FOLR2_MOUSE | 29 | 1 |
| GBLP_MOUSE | 35 | 1 |
| ALBU_MOUSE | 66 | 6.7 |
| HBA_MOUSE | 15 | 2 |
| HBB1_MOUSE | 16 | 1 |
| MIB1_MOUSE | 110 | 1 |
| MUP17_MOUSE | 21 | 1 |
| PERI_MOUSE | 54 | 1 |
| RNAS4_MOUSE | 17 | 2 |
| SPTB1_MOUSE | 2 | 1 |
| VIME_MOUSE | 54 | 1 |
| VTDB_MOUSE | 53 | 1 |
Tabell 1: Liste over proteiner i Bowmans plass leveringstanken fra 3 mus.
Ekstra Video 1: en volumgjengivelse fra en z-stabel ervervet etter posisjonering en pipette i Bowmans plass demonstrerer pipette spissen innen, tilstøtende kapillær tuft. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Vi presenterer en metode for å få tilgang til Bowmans plass på ikke-overflate glomeruli i mus, tilrettelagt av 2-fotonet mikroskopi. Vi utviklet denne fremgangsmåten for å løse en nøkkel begrensning av glomerular micropuncture, sjeldenhet av overflaten glomeruli adresserbart i 1-fotonet mikroskopi i mus, for å lette en eksperimentell objektiv, aspirasjon av væske fra Bowmans plass for påfølgende analyse. Utvikling og praksis av denne teknikken hviler på seks viktige trinn. Først må romanen kirurgisk utarbeidelse være nøye gjennomført slik at tenkelig vannsøylen kjører ikke av dekkglassvæske og dekkglassvæske strekker seg over området av nyre som er målet for pipette. Glass pipette brukes for micropuncture må andre gjengis synlig for 2-fotonet mikroskopi, som gjøres ved hjelp av kvante prikker. Tredje, stereotactic teknikk er nødvendig å plassere nøyaktig en pipette i Bowmans plass i tre dimensjoner, opptil 100 µm under nyre overflaten. Registrere koordinatsystemene pipette og scenen med presisjon er derfor avgjørende skritt. Fjerde, forsiktig utvalg av mål-glomerulus er nødvendig for å sikre den er tilgjengelig for pipette uten impingement av nyre støttestruktur og tenkelig kolonnen. Til slutt, nøye overveielse må gis til analytiske trinnene å følge oppkjøpet prosedyren, og volum og timing på oppkjøp av prøver må være tilpasset analysen og glomerular fysiologi.
Vi utviklet en oppkjøpet prosedyre som kan utvides til mange analyser, inkludert tradisjonelle micropuncture endepunkt, som flamme fotometri, ion-sensitive elektrode målinger eller målinger av press, volum eller kostnad. I tillegg tror vi denne teknikken vil være mottagelig romanen analytiske endepunktene inkludert polymerasekjedereaksjons (kanskje etter omvendt transkripsjon for miRNA) og metabolomics nedstrøms av massespektrometri. Spesielle endringene ansatt å lette massespektrometri fortjener ytterligere diskusjon, og de innføre noen begrensninger. Først, selv om massespektrometri er svært sensitive, lav proteininnhold og volum av micropuncture prøver gjengir analyse av protein under dynamikkområdet konvensjonelle proteomic leting, og derfor forenklet nanoproteomics var nødvendig. 8 , 13 det andre for å optimalisere protein avkastningen for tidlig analyser, vi har funnet ut at 200-300 nL av leveringstanken var nødvendig, men de novo filtratet oppkjøpet av dette volumet krever kanskje så lenge som 20 minutter av aspirasjon Hvis musen GFR er bare 8-14 nL / minutt3. Som Tojo og Endou vist at langvarig aspirasjon endrer albumin innholdet i tidlig proksimale tubule væske14, valgt vi inneholder over 6 minutter; men dette betyr at vår aspirasjon hastighet overstiger filtratet tilsig veksten. Brukere av denne prosedyren oppfordres til å vurdere fysiologi av glomerular filtrering i deres eksperimentelle system utforme arbeidsflyten. Massespektrometri, en følsom teknikk, ville bli overveldet av signalet fra en introdusert petroleum destillatet som mineralolje, som er vanlig i micropuncture utgjør hydraulikksystemet for aspirasjon og isolere deler av nyre. Derfor kan vi ikke bruke mineralolje for dette formålet, eller sin andre vanlige bruker, kvantifisering av volumet av nanoliter området prøver. I stedet fylle vi systemet med perfluorodecalin som er biologisk inert forstyrrer ikke massespektrometri og har gunstige optiske egenskaper. Vi tror begrensningene pålagt av perfluorodecalin er surmountable og arbeider på flere tekniske nyvinninger som vi forventer vil tillate måling for eksempel volum og blokade av rørformede segmentet.
De fleste micropuncture studier er utført i München-Wistar rotter, som viser økt antall overflate glomeruli, men denne sterkt begrenset fysiologiske studie av rørformede transport og andre nyre fysiologi tapet av grunnleggende verktøy fra molekylærbiologien, transgene mus2,3. Fordi det muliggjør brønnene tilgang til Bowmans plass i mus, begrenser teknikken derfor disse kritiske begrensningene. Vi vedtatt denne teknikken for å få tilgang nyre filtratet for proteomic studier med høy følsomhet massespektrometri, kjent som nanoproteomics9. Men er det trolig flere programmer. For eksempel har nyre fysiologiske studie av filtrerte protein vært sterkt hjulpet av bruk av fluorescerende tracers med 2-fotonet mikroskopi15,16,17. Tillegg av micropuncture til 2-fotonet mikroskopi tilbyr muligheten til å utføre single-nyre fysiologiske studie med fluorescerende molekyler, slik at nabostaten, ikke-injisert nephrons som kontroller. Håpet er at denne klar forklaring av fremgangsmåten vil tillate bred adopsjon i laboratorier allerede utstyrt for 2-fotonet mikroskopi og/eller micropuncture. Selv om det er komplisert, vi har nå utført denne prosedyren mange ganger og avgrensninger presenteres her representerer en stabil plattform for fysiologiske oppdagelse.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
NIDDK K08 DK090754 til MPH. NIGMS P41 GM103493 til RDS. Dette materialet er resultatet av arbeidet (ved MPH) som ble støttet med ressurser og bruk av fasiliteter på Portland Veterans Affairs Medical Center. Innholdet representerer ikke synspunktene til det amerikanske Department of Veterans Affairs eller myndighetene i USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright 2 photon microscope | Zeiss | LSM 7MP | |
| 3 axis microscope stage controller | Sutter | MP-285 | |
| 3 axis headstage controller | Sutter | MP-225 | |
| Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| FITC-dextran 2000 kDa MW | Sigma-Aldrich | 52471-1G | |
| borosilicate glass capillary tubes | Sutter | B150-110-7.5 | |
| Micropipette puller | Sutter | P-97 | |
| Quantum dots, 605 nm | Thermofisher | Q21701MP | |
| Polysiloxane | Sugru | No cat number | www.sugru.com, "original formula". Any color. |
| PE-50 tubing | Instech Labs | BTPE-50 | |
| Microinjector | WPI | UMP-3 | |
| Microinjector controller | WPI | Micro4 | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | 306-94-5 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| Coverslip, 10 mm | Harvard Apparatus | 64-0718 | |
| Headplate | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
| Head fixation device | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
| 30 G needle | Becton-Dickinson | 125393 | For retroorbital injection |
| Tuberculin syringe | Becton-Dickinson | 309626 | For retroorbital injection |
References
- Schnermann, J. Micropuncture analysis of tubuloglomerular feedback regulation in transgenic mice. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (12), 2614-2619 (1999).
- Lorenz, J. N. Micropuncture of the kidney: a primer on techniques. Comprehensive Physiology. 2 (1), 621-637 (2012).
- Vallon, V. Micropuncturing the nephron. Pflugers Archive. European Journal of Physiology. 458 (1), 189-201 (2009).
- Perrien, D. S., et al. Novel methods for microCT-based analyses of vasculature in the renal cortex reveal a loss of perfusable arterioles and glomeruli in eNOS-/- mice. BMC Nephrology. 17, 24 (2016).
- Ehling, J., et al. Quantitative Micro-Computed Tomography Imaging of Vascular Dysfunction in Progressive Kidney Diseases. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (2), 520-532 (2016).
- Gimenez, Y., et al. 3D Imaging of Nanoparticle Distribution in Biological Tissue by Laser-Induced Breakdown Spectroscopy. Scientific Reports. 6, 29936 (2016).
- Miyamoto, S., et al. Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator. EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).
- Piehowski, P. D., Zhao, R., Moore, R. J., Clair, G., Ansong, C. Quantitative proteomic analysis of mass limited tissue samples for spatially resolved tissue profiling. Methods in Molecular Biology. , (2017).
- Yi, L., Piehowski, P. D., Shi, T., Smith, R. D., Qian, W. J. Advances in microscale separations towards nanoproteomics applications. Journal of Chromatography A. 1523, 40-48 (2017).
- Clair, G., et al. Spatially-resolved proteomics: Rapid quantitative analysis of laser capture microdissected alveolar tissue samples. Scientific Reports. 6, 39223 (2016).
- Huang, E. L., et al. SNaPP: Simplified nanoproteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities. Endocrinology. 157 (3), 1307-1314 (2016).
- Andrasfalvy, B. K., et al. Quantum dot-based multiphoton fluorescent pipettes for targeted neuronal electrophysiology. Nature Methods. 11 (12), 1237-1241 (2014).
- Huang, E. L., et al. SNaPP: Simplified nano-proteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities. Endocrinology. 157 (3), (2016).
- Tojo, A., Endou, H. Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique. American Journal of Physiology. 263 (4 Pt 2), F601-F606 (1992).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).
- Sandoval, R. M., Kennedy, M. D., Low, P. S., Molitoris, B. A. Uptake and trafficking of fluorescent conjugates of folic acid in intact kidney determined using intravital two-photon microscopy. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 287 (2), C517-C526 (2004).
- Salmon, A. H., et al. Loss of the endothelial glycocalyx links albuminuria and vascular dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (8), 1339-1350 (2012).
