Vi presenterer bruk av 2-fotonet mikroskopi å plassere brønnene i Bowmans urin plass i mus, kombinere 2 grunnleggende teknikker av nyre fysiologi. Bruk av 2-fotonet mikroskopi overvinner kritiske begrensninger av konvensjonelle mikroskopi for micropuncture nyre fysiologi studier.
Nyre micropuncture og nyre 2-fotonet tenkelig er banebrytende teknikker i nyre fysiologi. Men micropuncture er begrenset av avhengighet av konvensjonelle mikroskopi til overflaten nyre funksjoner, og 2-fotonet studier er begrenset i at intervensjoner kan bare vurderes på orgel, i stedet for nyre nivået. Spesielt har micropuncture studier av glomeruli mus blitt utfordret av mangelen på overflaten glomeruli i mus. For å løse denne begrensningen for studier av leveringstanken fra Bowmans plass i musen fysiologiske modeller, utviklet vi 2-fotonet glomerular micropuncture. Vi presenterer en ny kirurgisk forberedelse som gir lateral tilgang til nyrene samtidig bevare den nødvendige loddrette tenkelig kolonnen for 2-fotonet mikroskopi. Administrasjon av høy molekylvekt fluorescein isothiocyanate (FITC)-dekstran brukes til å gjengi den nyre blodkar og derfor glomeruli synlig for 2-fotonet bildebehandling. En quantum dot-belagt pipette er deretter innført under stereotactic veiledning til en glomerulus valgt fra flere mange som kan visualiseres i vinduet tenkelig. I denne protokollen gir vi detaljene av forberedelse, materialer og metoder som er nødvendig for å utføre prosedyren. Denne teknikken gjør tidligere umulige fysiologiske studie av nyre, inkludert utvinning av filtratet fra Bowmans plass og alle segmenter av nyre innen bildebehandling dybde, ca 100 µm under nyre kapselen. Press, kostnad og flyt kan alle bli målt ved hjelp av introduserte pipette. Her gir vi representant data fra flytende kromatografi/massespektrometri på leveringstanken fra Bowman’s space. Vi forventer denne teknikken å ha bred anvendelse i nyre fysiologiske etterforskning.
Formålet med denne fremgangsmåten er rutinemessig micropuncture tilgang til Bowmans plass og andre glomerular strukturer i mus. Micropuncture studier for nyre fysiologi har vært begrenset til 1-fotonet mikroskopi, som kan bare bildet innenfor noen få mikroner av nyre overflaten, og som tilbyr begrensede presisjon i z-dimensjonen. Fordi mus har noen overflate glomeruli, det er ikke alltid mulig å finne en overflate glomerulus av 1-fotonet mikroskopi, derfor de fleste micropuncture studier er utført i München-Wistar rotter, som har flere overflaten glomeruli. Derfor har fordelene ved å jobbe i musen modeller vært begrenset i micropuncture studier1,2,3. Nylige fremskritt innen bildebehandling teknologier, inkludert mikro-CT4,5, hydrogenion imaging6og imaging massespektrometri7 har kraftig forbedret utvalget av modaliteter for glomerular fysiologi, men Det er ingen erstatning for den unike muligheten til å gripe inn og prøve det micropuncture gir. Derfor utvide bruken av micropuncture ved hjelp av teknikker som presenteres her er forventet å lette romanen nyre fysiologi studier, spesielt evaluering av innholdet i nyre filtratet (dvs., metabolomics) og grunnleggende fysiologi av transgene mus, for eksempel målinger av filtratet press og kostnad, tidligere utført bare i rotter.
I denne teknikken kan bruk av 2-fotonet mikroskopi visualisering og brønnene tilgang til nyre strukturer til ca 100 µm under nyre kapselen. Flere (5-10) glomeruli er derfor tilgjengelig for micropuncture i hver mus nyre hittil fotografert. Selv om denne teknikken deler noen funksjoner med konvensjonelle nyre micropuncture, det var designet de novo og omfattende endringer fra konvensjonelle teknikk er nødvendig. I denne protokollen vi demonstrere aspirasjon av væske fra Bowmans plass og viser eksempel resultatene av påfølgende analyse med massespektrometri (nanoproteomics)8,9,10,11. Nedstrøms krever massespektrometri en spesialisert eksempel forberedelse arbeidsflyt som er også vist her.
Vi presenterer en metode for å få tilgang til Bowmans plass på ikke-overflate glomeruli i mus, tilrettelagt av 2-fotonet mikroskopi. Vi utviklet denne fremgangsmåten for å løse en nøkkel begrensning av glomerular micropuncture, sjeldenhet av overflaten glomeruli adresserbart i 1-fotonet mikroskopi i mus, for å lette en eksperimentell objektiv, aspirasjon av væske fra Bowmans plass for påfølgende analyse. Utvikling og praksis av denne teknikken hviler på seks viktige trinn. Først må romanen kirurgisk utarbeidelse være nøye gjennomført slik at tenkelig vannsøylen kjører ikke av dekkglassvæske og dekkglassvæske strekker seg over området av nyre som er målet for pipette. Glass pipette brukes for micropuncture må andre gjengis synlig for 2-fotonet mikroskopi, som gjøres ved hjelp av kvante prikker. Tredje, stereotactic teknikk er nødvendig å plassere nøyaktig en pipette i Bowmans plass i tre dimensjoner, opptil 100 µm under nyre overflaten. Registrere koordinatsystemene pipette og scenen med presisjon er derfor avgjørende skritt. Fjerde, forsiktig utvalg av mål-glomerulus er nødvendig for å sikre den er tilgjengelig for pipette uten impingement av nyre støttestruktur og tenkelig kolonnen. Til slutt, nøye overveielse må gis til analytiske trinnene å følge oppkjøpet prosedyren, og volum og timing på oppkjøp av prøver må være tilpasset analysen og glomerular fysiologi.
Vi utviklet en oppkjøpet prosedyre som kan utvides til mange analyser, inkludert tradisjonelle micropuncture endepunkt, som flamme fotometri, ion-sensitive elektrode målinger eller målinger av press, volum eller kostnad. I tillegg tror vi denne teknikken vil være mottagelig romanen analytiske endepunktene inkludert polymerasekjedereaksjons (kanskje etter omvendt transkripsjon for miRNA) og metabolomics nedstrøms av massespektrometri. Spesielle endringene ansatt å lette massespektrometri fortjener ytterligere diskusjon, og de innføre noen begrensninger. Først, selv om massespektrometri er svært sensitive, lav proteininnhold og volum av micropuncture prøver gjengir analyse av protein under dynamikkområdet konvensjonelle proteomic leting, og derfor forenklet nanoproteomics var nødvendig. 8 , 13 det andre for å optimalisere protein avkastningen for tidlig analyser, vi har funnet ut at 200-300 nL av leveringstanken var nødvendig, men de novo filtratet oppkjøpet av dette volumet krever kanskje så lenge som 20 minutter av aspirasjon Hvis musen GFR er bare 8-14 nL / minutt3. Som Tojo og Endou vist at langvarig aspirasjon endrer albumin innholdet i tidlig proksimale tubule væske14, valgt vi inneholder over 6 minutter; men dette betyr at vår aspirasjon hastighet overstiger filtratet tilsig veksten. Brukere av denne prosedyren oppfordres til å vurdere fysiologi av glomerular filtrering i deres eksperimentelle system utforme arbeidsflyten. Massespektrometri, en følsom teknikk, ville bli overveldet av signalet fra en introdusert petroleum destillatet som mineralolje, som er vanlig i micropuncture utgjør hydraulikksystemet for aspirasjon og isolere deler av nyre. Derfor kan vi ikke bruke mineralolje for dette formålet, eller sin andre vanlige bruker, kvantifisering av volumet av nanoliter området prøver. I stedet fylle vi systemet med perfluorodecalin som er biologisk inert forstyrrer ikke massespektrometri og har gunstige optiske egenskaper. Vi tror begrensningene pålagt av perfluorodecalin er surmountable og arbeider på flere tekniske nyvinninger som vi forventer vil tillate måling for eksempel volum og blokade av rørformede segmentet.
De fleste micropuncture studier er utført i München-Wistar rotter, som viser økt antall overflate glomeruli, men denne sterkt begrenset fysiologiske studie av rørformede transport og andre nyre fysiologi tapet av grunnleggende verktøy fra molekylærbiologien, transgene mus2,3. Fordi det muliggjør brønnene tilgang til Bowmans plass i mus, begrenser teknikken derfor disse kritiske begrensningene. Vi vedtatt denne teknikken for å få tilgang nyre filtratet for proteomic studier med høy følsomhet massespektrometri, kjent som nanoproteomics9. Men er det trolig flere programmer. For eksempel har nyre fysiologiske studie av filtrerte protein vært sterkt hjulpet av bruk av fluorescerende tracers med 2-fotonet mikroskopi15,16,17. Tillegg av micropuncture til 2-fotonet mikroskopi tilbyr muligheten til å utføre single-nyre fysiologiske studie med fluorescerende molekyler, slik at nabostaten, ikke-injisert nephrons som kontroller. Håpet er at denne klar forklaring av fremgangsmåten vil tillate bred adopsjon i laboratorier allerede utstyrt for 2-fotonet mikroskopi og/eller micropuncture. Selv om det er komplisert, vi har nå utført denne prosedyren mange ganger og avgrensninger presenteres her representerer en stabil plattform for fysiologiske oppdagelse.
The authors have nothing to disclose.
NIDDK K08 DK090754 til MPH. NIGMS P41 GM103493 til RDS. Dette materialet er resultatet av arbeidet (ved MPH) som ble støttet med ressurser og bruk av fasiliteter på Portland Veterans Affairs Medical Center. Innholdet representerer ikke synspunktene til det amerikanske Department of Veterans Affairs eller myndighetene i USA.
Upright 2 photon microscope | Zeiss | LSM 7MP | |
3 axis microscope stage controller | Sutter | MP-285 | |
3 axis headstage controller | Sutter | MP-225 | |
Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | |
Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
FITC-dextran 2000 kDa MW | Sigma-Aldrich | 52471-1G | |
borosilicate glass capillary tubes | Sutter | B150-110-7.5 | |
Micropipette puller | Sutter | P-97 | |
Quantum dots, 605 nm | Thermofisher | Q21701MP | |
Polysiloxane | Sugru | No cat number | www.sugru.com, "original formula". Any color. |
PE-50 tubing | Instech Labs | BTPE-50 | |
Microinjector | WPI | UMP-3 | |
Microinjector controller | WPI | Micro4 | |
Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | 306-94-5 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
Coverslip, 10 mm | Harvard Apparatus | 64-0718 | |
Headplate | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
Head fixation device | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
30 gauge needle | Becton-Dickinson | 125393 | For retroorbital injection |
Tuberculin syringe | Becton-Dickinson | 309626 | For retroorbital injection |