Мы представляем использование 2-Фотон микроскопии поставить микропипеткой боуменова мочевыводящих пространстве в мышей, сочетая 2 основополагающими методами почечной физиологии. Использование 2-Фотон микроскопии преодолевает критические ограничения обычных микроскопии для исследования почек физиологии micropuncture.
Почечная micropuncture и почечной 2-фотонных изображений являются семенных методы в физиологии почек. Однако micropuncture ограничивается зависимость от обычных микроскопии поверхности нефрон функции, и 2-Фотон исследования ограничены в том, что вмешательство может оцениваться только на орган, а не на уровне нефрон. В частности micropuncture исследования клубочков мышей были оспорены, нехватки поверхностных клубочков мышей. Чтобы устранить это ограничение для того, чтобы проводить исследования аспирата из боуменова пространства в физиологической модели мыши, мы разработали 2-Фотон клубочковых micropuncture. Мы представляем Роман хирургической подготовки, что позволяет боковой доступ к функции почек при сохранении вертикальных изображений столбец требуется для 2-Фотон микроскопии. Администрация высокой молекулярной массой флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-декстрана используется для отображения видимой для визуализации 2-Фотон почечной сосудистую и, следовательно, клубочков. Квантовая точка покрытием пипетки затем представил под стереотаксической руководством по glomerulus, выбранные из несколько, чтобы многие из которых могут быть визуализированы в окне визуализации. В этом протоколе мы предоставляем подробную информацию о подготовке, материалы и методы, необходимые для выполнения процедуры. Эта технология облегчает ранее невозможно физиологическое исследование почек, включая восстановление фильтрата из боуменова пространства и все сегменты нефрон внутри изображений предел глубины, около 100 мкм ниже почечной капсулу. Давление, заряд и поток может все измерить введено пипеткой. Здесь мы предоставляем репрезентативных данных из жидкого хроматография/масс-спектрометрии, выполнена на аспирата из боуменова пространства. Мы ожидаем эту технику, чтобы иметь широкое применение в почечной физиологические исследования.
Цель этой процедуры является рутинной micropuncture доступа к боуменова пространства и других клубочковых структур в мышах. Micropuncture исследования для почечной физиологии были ограничены 1-Фотон микроскопии, который может только изображения в несколько микрон поверхности почек, и который предлагает ограниченной точности в измерении z. Потому что мышей несколько поверхности клубочков, это не всегда возможно найти поверхности glomerulus на 1 Фотон микроскопии, поэтому большинство micropuncture исследования были проведены в Мюнхене-крыс, которые имеют более многочисленные поверхности клубочков. Таким образом преимущества работы в моделях мыши были ограничены в micropuncture исследования,12,3. Последние достижения в технологии, включая микро CT4,5, imaging наночастиц изображений6и изображений масс-спектрометрии7 значительно расширили спектр механизмов, применимых к клубочковых физиологии, но по-прежнему существует не заменит для уникальной предоставляет возможность вмешаться и образец что micropuncture. Поэтому расширение использования micropuncture с использованием представленные здесь методики, как ожидается, облегчить Роман почечной физиологии исследования, в частности, оценки содержания почечной фильтрата (то есть, метаболомики) и основные физиологии трансгенных мышей, такие как измерения давления фильтрата и обязанности, ранее выполнявшиеся только у крыс.
В этой технике использование 2-Фотон микроскопии позволяет визуализации и микропипеткой доступ к почечной структур до около 100 мкм ниже почечной капсулу. Несколько (5-10) клубочков таким образом доступны для micropuncture в каждой мыши почек отображаемого в данный момент. Хотя этот метод имеет общие черты с обычными почечной micropuncture, он был разработан de novo и требуются обширные изменения от обычного метода. В этом протоколе мы продемонстрировать стремление жидкости из пространства боуменова и показать пример результаты последующего анализа с масс-спектрометрия (nanoproteomics)8,9,10,11. Вниз по течению масс-спектрометрии для использования специализированных образец рабочего процесса подготовки, который также продемонстрировали здесь.
Мы представляем метод для доступа к боуменова пространства-поверхность клубочков в мышей, облегчается 2-Фотон микроскопии. Мы разработали эту процедуру для решения ключевых ограничение клубочковых micropuncture, редкость поверхности клубочков адресуются по микроскопии 1-Фотон в мышей, для облегчения объективной экспериментальный, аспирации жидкости из боуменова пространства для последующий анализ. Развития и практики этого метода основывается на шести важных шагов. Во-первых Роман хирургической подготовки должны тщательно осуществляться таким образом, что изображений водяного столба не бежать coverslip и coverslip простирается над районом почки, который является целевым объектом пипеткой. Во-вторых стеклянные пипетки для micropuncture должно быть вынесено видимым для микроскопии 2-фотон, которая достигается использованием квантовых точек. В-третьих, стереотаксическая техника требуется точно позиционировать пипетки в пространстве боуменова в трех измерениях, до 100 мкм ниже поверхности почек. Таким образом регистрации систем координат пипетки и стадии с точностью являются важнейшие шаги. В-четвертых, тщательный выбор целевого glomerulus необходимо убедиться, что она доступна для пипетки без покушение структуры поддержки почек и изображений столбец. И наконец внимание должно уделяться аналитически шаги следовать процедуре приобретения, и объем и сроки приобретения жидкости образцов должны соответствовать к анализу и клубочковых физиологии.
Мы разработали процедура приобретения, которая может быть распространена на многие анализов, включая традиционные micropuncture конечных точек, например пламенной фотометрии, Ион чувствительных Электроды измерения или измерения давления, объема или заряда. Кроме того мы считаем, что этот метод будет поддаваться Роман аналитически конечных точек, включая полимеразной цепной реакции (возможно после обратной транскрипции для miRNA) и метаболомики вниз по течению, масс-спектрометрии. Специальные модификации, используемых для облегчения масс-спектрометрии, заслуживают дополнительного обсуждения, и они налагают определенные ограничения. Во-первых хотя масс-спектрометрия очень чувствительна, Низкопротеиновое содержание и объем micropuncture образцов оказывает анализа белка ниже динамический диапазон обычных протеомических исследований, и поэтому были упрощенный nanoproteomics необходимости. 8 , 13 во-вторых, чтобы оптимизировать урожайность белка для раннего анализов, мы определили, что 200-300 nL аспирата было необходимо, но de novo фильтрата приобретение этого тома может быть столько, сколько 20 минут аспирации потребовало бы если мышь Федеративная Республика Германия является только 8-14 nL 3/мин. Как Тодзио и Endou показали, что длительное стремление изменяет содержание альбумина ранних проксимальных канальцах жидкости14, мы избрали аспирационная более 6 минут; Однако это означает, что наши стремления скорость превышает скорость приток фильтрата. Пользователям этой процедуры рекомендуется рассмотреть физиологии клубочковой фильтрации в их экспериментальной системы в разработке их рабочего процесса. Масс-спектрометрия, чувствительной технологией, будут перегружены сигнал от введено нефтяной дистиллят как минеральное масло, которое широко используется в micropuncture составляют гидравлической системы для аспирации и изолировать сегментов нефрон. Таким образом мы не могли использовать минеральное масло для этой цели, или его общего использования, количественная оценка объема nanoliter диапазон образцов. Вместо этого мы заполняем систему Перфтордекалин, который является биологически инертным, не беспокоить масс-спектрометрии и имеет благоприятные оптические характеристики. Мы считаем, что ограничения, налагаемые Перфтордекалин преодолимыми и работают на дополнительных технических инноваций, которые мы ожидаем, что позволит измерение объема выборки и блокады трубчатых сегмента.
Большинство micropuncture исследования были проведены в Мюнхене-крыс, которые демонстрируют увеличение числа поверхности клубочков, но это значительно ограничены физиологическое исследование трубчатых транспорта и других почечных физиологии за потери основных инструмент, молекулярной биологии, трансгенных мышей2,3. Потому что он облегчает доступ микропипеткой боуменова пространства в мышей, Роман технику поэтому снижает эти критические ограничения. Мы приняли этот метод для доступа к почечной фильтрата для протеомических исследований с помощью масс-спектрометрии высок чувствительности, известный как nanoproteomics9. Однако есть вероятно дополнительного приложения. К примеру почечной физиологическое исследование отфильтрованных белка был значительно помог с использованием трасеров флуоресцентной с 2-Фотон микроскопии15,16,17. Дополнение micropuncture к 2-Фотон микроскопии предлагает возможность выполнения сингл нефрон физиологическое исследование с флуоресцентных молекул, позволяя соседних, не вводили нефронов в качестве элементов управления. Остается надеяться, что это четкое объяснение необходимые шаги позволят широкое принятие в лабораториях, уже оборудованы 2-Фотон микроскопии и/или micropuncture. Хотя это сложный, мы выполнили эту процедуру сейчас много раз и уточнения, представленные в настоящем документе представляют собой стабильную платформу для физиологического обнаружения.
The authors have nothing to disclose.
NIDDK K08 DK090754 до GM103493 Миль/ч. NIGMS P41 службы удаленных рабочих столов. Этот материал является результатом работы (по миль/ч), которая была поддержана с ресурсами и использования помещений в медицинском центре дел ветеранов Портленд. Содержимое не представляют взгляды Департамента США по делам ветеранов или правительства Соединенных Штатов.
Upright 2 photon microscope | Zeiss | LSM 7MP | |
3 axis microscope stage controller | Sutter | MP-285 | |
3 axis headstage controller | Sutter | MP-225 | |
Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | |
Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
FITC-dextran 2000 kDa MW | Sigma-Aldrich | 52471-1G | |
borosilicate glass capillary tubes | Sutter | B150-110-7.5 | |
Micropipette puller | Sutter | P-97 | |
Quantum dots, 605 nm | Thermofisher | Q21701MP | |
Polysiloxane | Sugru | No cat number | www.sugru.com, "original formula". Any color. |
PE-50 tubing | Instech Labs | BTPE-50 | |
Microinjector | WPI | UMP-3 | |
Microinjector controller | WPI | Micro4 | |
Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | 306-94-5 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
Coverslip, 10 mm | Harvard Apparatus | 64-0718 | |
Headplate | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
Head fixation device | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
30 gauge needle | Becton-Dickinson | 125393 | For retroorbital injection |
Tuberculin syringe | Becton-Dickinson | 309626 | For retroorbital injection |