Vi presenterar användning av 2-foton mikroskopi att placera en mikropipett inom Bowmans urin utrymme i möss, kombinera 2 Grundläggande tekniker för nedsatt fysiologi. Användning av 2-foton mikroskopi övervinner kritiska begränsningar av konventionella mikroskopi för micropuncture nedsatt fysiologi studier.
Nedsatt micropuncture och nedsatt 2-photon imaging är nyskapande tekniker i nedsatt fysiologi. Men micropuncture begränsas av beroendet av konventionella mikroskopi till ytan nefronet funktioner och 2-photon studier är begränsade i att interventioner kan endast bedömas vid orgeln, snarare än nivån nefronet. I synnerhet har micropuncture studier av glomeruli möss ifrågasatts av bristen på ytan glomeruli i möss. För att lösa denna begränsning för att fortsätta studier av aspirera från Bowmans utrymme i mus fysiologiska modeller, utvecklat vi 2-photon glomerulär micropuncture. Vi presenterar en ny kirurgisk beredning som tillåter laterala till njuren samtidigt krävs imaging vertikalpelaren för 2-foton mikroskopi. Administrering av hög molekylvikt fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC)-dextran används för att återge nedsatt vaskulatur och därför glomeruli synliga för 2-photon avbildning. Quantum dot-belagd pipett sedan införs under stereotaktisk vägledning till en glomeruli utvalda från flera många som kan visualiseras i fönstret imaging. I detta protokoll ger vi Detaljer för förberedelse, material och metoder som är nödvändiga för att genomföra förfarandet. Denna teknik underlättar tidigare-omöjligt fysiologiska studie av njure, inklusive återvinning av filtratet från Bowmans utrymme och alla segment av nefronet inom imaging djup gräns, ca 100 µm nedanför nedsatt kapseln. Tryck-, laddnings- och flöde kan allt mätas som med introducerade pipetten. Här, ger vi representativa uppgifter från liquid chromatography/mass spectrometry utförs på aspirera från Bowmans utrymme. Vi förväntar oss att denna teknik att ha brett tillämplighet i nedsatt fysiologisk undersökning.
Syftet med detta förfarande är att ge rutin micropuncture tillgång till Bowmans utrymme och andra glomerulär strukturer hos möss. Micropuncture studier för nedsatt fysiologi har varit begränsad till 1-foton mikroskopi, som endast kan bilden inom några mikrometer av njure ytan, och som erbjuder begränsad precision i z-dimensionen. Eftersom möss har några surface glomeruli, det är inte alltid möjligt att hitta en yta glomeruli av 1-foton mikroskopi, därför de flesta micropuncture studier har genomförts i München-Wistar råttor, som har mer talrika ytan glomeruli. Fördelarna med att arbeta i musmodeller har därför begränsats i micropuncture studier1,2,3. Senaste framstegen inom imaging teknik, inklusive mikro-CT4,5, nanopartiklar imaging6och imaging masspektrometri7 har kraftigt förbättrat utbudet av regler för glomerulär fysiologi, men Det finns fortfarande inget substitut för den unika möjligheten att ingripa och prova att micropuncture ger. Därför utvidga användningen av micropuncture med hjälp av tekniker som presenteras här förväntas underlätta roman nedsatt fysiologi studier, särskilt utvärdering av innehållet i nedsatt filtratet (dvs, metabolomik) och grundläggande fysiologi transgena möss, till exempel mätningar av filtratet trycket och kostnad, tidigare utförde endast hos råttor.
Den här tekniken tillåter användning av 2-foton mikroskopi visualisering och mikropipett tillgång till nedsatt strukturer upp till ca 100 µm nedanför nedsatt kapseln. Flera (5 – 10) glomeruli är därför tillgänglig för micropuncture i varje mus njure hittills avbildas. Även om denna teknik delar vissa funktioner med konventionella nedsatt micropuncture, det var utformade de novo och omfattande ändringar från konventionell teknik krävs. I detta protokoll vi demonstrera aspiration av vätska från Bowmans utrymme och visar exempel på resultat av efterföljande analys med masspektrometri (nanoproteomics)8,9,10,11. Efterföljande användning av masspektrometri kräver en specialiserad prov förberedelse arbetsflöde, vilket demonstreras också här.
Vi presenterar en metod för att komma åt Bowmans utrymme av icke-surface glomeruli i möss, underlättas av 2-foton mikroskopi. Vi utvecklade denna procedur för att ta itu med en viktig begränsning av glomerulär micropuncture, sällsynthet av surface glomeruli adresserbara av 1-foton mikroskopi hos möss, för att underlätta en experimentell målsättning, aspiration av vätska från Bowmans utrymme för efterföljande analys. Utveckling och praktik av denna teknik vilar på sex viktiga steg. Första måste romanen kirurgisk beredning noggrant utföras så att imaging vattenmassan körs inte utanför täckglaset och täckglaset sträcker sig över området i njure som är målet för pipetten. Andra måste glas pipetten används för micropuncture återges synligt för 2-foton mikroskopi, som åstadkoms med hjälp av kvantprickar. Tredje, stereotaktisk teknik krävs för att placera exakt en pipett i Bowmans utrymme i tre dimensioner, upp till 100 µm under njure ytan. Att registrera koordinatsystemen pipetten och scenen med precision är därför kritiska moment. Fjärde, noggrant urval av de mål glomeruli är nödvändigt att säkerställa tillgång till pipetten utan impingement av njure stödstruktur och imaging kolumn. Slutligen, noggrann hänsyn måste tas till de analytiska steg att följa förfarandet för förvärvet, och volym och tidpunkten för förvärvet av vätskeprover måste matchas till analysen och glomerulär fysiologi.
Vi utformade ett förvärv förfarande som kan förlängas till många analyser, inklusive traditionella micropuncture effektmått, såsom flamfotometri, ion-känslig elektrod mätningar eller mätningar av tryck, volym eller kostnad. Dessutom, tror vi att denna teknik kommer att vara mottagliga för romanen analytic endpoints inklusive polymeras-kedjereaktion (kanske efter omvänd Transkription för miRNA) och metabolomik nedströms av masspektrometri. De särskilda ändringar som används för att underlätta masspektrometri förtjänar ytterligare diskussion och de införa vissa begränsningar. Först även om masspektrometri är mycket känsliga, de låg proteinhalt och volymen av micropuncture prover återger analys av protein under det dynamiska intervallet av konventionella proteomiska utforskning och därför förenklade nanoproteomics var nödvändigt. 8 , 13 andra, för att optimera protein avkastning för tidiga analyser, vi fast beslutna att 200-300 nL av aspirera var nödvändigt, men de novo filtratet förvärv av denna volym skulle kräva kanske så länge som 20 minuter av aspiration om musen GFR är bara 8-14 nL / min3. Som Tojo och Endou visat att långvarig aspiration förändrar albumin innehållet i tidig proximala tubuli flytande14, valda vi att aspirera under 6 minuter; emellertid innebär detta att vår strävan hastighet överstiger inflödessats på filtratet. Användare av proceduren uppmuntras att överväga physiologyen av glomerulär filtration i deras experimentella system designa deras arbetsflöde. Masspektrometri, en känslig teknik, skulle bli överväldigade av signalen från en introducerade petroleum destillat såsom mineralolja, som vanligtvis används i micropuncture för att omfatta det hydrauliska systemet för aspiration och isolera segment av nefronen. Därför, vi kunde inte använda mineralolja för detta ändamål, eller sin andra gemensamma använder, kvantifiering av volym av nliter utbud prover. Istället fyller vi systemet med perfluorodecalin som är biologiskt inert, stör inte masspektrometri, och har goda optiska egenskaper. Vi tror de begränsningar av perfluorodecalin lösas och arbetar på ytterligare tekniska innovationer som vi förväntar oss kommer att tillåta mätning av provvolymen och blockad av tubulär segmentet.
De flesta micropuncture studier har utförts i München-Wistar råttor, som visar ökat antal ytan glomeruli, men denna kraftigt begränsade fysiologiska studie av tubulär transport och andra nedsatt fysiologi på grund av förlusten av grundläggande verktyg för molekylärbiologi, transgena möss2,3. Eftersom det underlättar mikropipett tillgång till Bowmans utrymme i möss, mildrar i ny teknik därför dessa kritiska begränsningar. Vi antog denna teknik för att få tillgång till nedsatt filtratet för proteomiska studier med hög känslighet masspektrometri, känd som nanoproteomics9. Det finns dock sannolikt ytterligare program. Till exempel har nedsatt fysiologiska studie av filtrerat protein varit kraftigt understödda av användning av fluorescerande spårämnen med 2-foton mikroskopi15,16,17. Tillägg av micropuncture till 2-foton mikroskopi erbjuder möjlighet att utföra singel-nefronet fysiologiska studie med fluorescerande molekyler, vilket gör att närliggande, icke-injiceras nephrons som kontroller. Förhoppningen är att denna tydliga förklaring av nödvändiga åtgärder kommer att tillåta brett antagandet i labs redan utrustade för 2-foton mikroskopi och/eller micropuncture. Men det är komplext, vi har nu utfört proceduren många gånger och de förbättringar som presenteras häri utgör en stabil plattform för fysiologiska upptäckt.
The authors have nothing to disclose.
NIDDK K08 DK090754 till MPH. NIGMS P41 GM103493 RDS. Detta material är resultatet av arbete (genom MPH) som stöddes med resurser och användning av faciliteterna på den Portland Veterans Affairs Medical Center. Innehållet representerar inte åsikter US Department of Veterans Affairs eller Förenta staternas regering.
Upright 2 photon microscope | Zeiss | LSM 7MP | |
3 axis microscope stage controller | Sutter | MP-285 | |
3 axis headstage controller | Sutter | MP-225 | |
Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | |
Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
FITC-dextran 2000 kDa MW | Sigma-Aldrich | 52471-1G | |
borosilicate glass capillary tubes | Sutter | B150-110-7.5 | |
Micropipette puller | Sutter | P-97 | |
Quantum dots, 605 nm | Thermofisher | Q21701MP | |
Polysiloxane | Sugru | No cat number | www.sugru.com, "original formula". Any color. |
PE-50 tubing | Instech Labs | BTPE-50 | |
Microinjector | WPI | UMP-3 | |
Microinjector controller | WPI | Micro4 | |
Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | 306-94-5 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
Coverslip, 10 mm | Harvard Apparatus | 64-0718 | |
Headplate | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
Head fixation device | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
30 gauge needle | Becton-Dickinson | 125393 | For retroorbital injection |
Tuberculin syringe | Becton-Dickinson | 309626 | For retroorbital injection |