Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Karaciğer mitokondrial oksijen tüketimi ve Proton sızıntı kinetik Holstein süt sığır mitokondrial solunum tahmin etmek için ölçme

doi: 10.3791/58387 Published: November 30, 2018

Summary

Burada, mitokondrial oksijen tüketimi, beslenme enerji bilimi ve proton sızıntı, verimsizlik birincil nedeni mitokondriyal ATP nesil belirleyici bir kavram ölçme yöntemleri paylaşmak. Bu sonuçlar besin kullanımı mitokondriyal işlev değerlendirmek yardımcı olmak için kayıp enerjinin % 30 için hesap.

Abstract

Oksijen tüketimi, proton sebep kuvvet (PMF) ve proton sızıntı mitokondriyal solunum veya ne kadar iyi mitokondri NADH ve FADH ATP dönüştürmek mümkün ölçülerini vardır. Nasıl verimli oksijen kullanımı ve doğrudan ATP üretmek mitokondri de oksijen ve karbon dioksit ve su besin oksidasyon birincil site olduğundan, besin metabolizma, verimliliği ile ilgilidir hayvanın besin gereksinimleri ve hayvan sağlık. Bu yöntemin amacı farklı ilaçlar, diyetler ve mitokondriyal metabolizma üzerindeki çevresel etkileri etkilerini incelemek için kullanılan mitokondrial solunum incelemektir. Sonuçları proton bağlı solunum (durum 3) ve proton sızıntı bağımlı solunum (devlet 4) ölçülen oksijen tüketimi içerir. Devlet 3 / devlet 4 Solunum oranı solunum denetim oranı (RCR) tanımlanır ve mitokondrial enerjik verimliliği temsil edebilir. Mitokondrial proton sızıntı ADP ATP sentezi verimliliğini azalan dan uncoupling Oksidatif fosforilasyon tarafından mitokondri zar potansiyel (MMP) dağılımı sağlar bir süreç var. Oksijen ve TRMP + Hassas elektrotlar mitokondrial yüzeylerde ve elektron taşıma zinciri inhibitörleri ile durum 3 ve devlet 4 solunum, mitokondri zar PMF (veya ATP üretmek için potansiyel) ölçmek için kullanılır ve proton sızıntısı. Bu yöntem için kısıtlamaları karaciğer dokusu gibi taze olmalı ve tüm biyopsi ve deneyleri az 10 h içinde gerçekleştirilmesi gerekir vardır. Bu toplanan ve bir günde yaklaşık 5 için tek bir kişi tarafından işlenen örneklerin sayısını sınırlar. Ancak, yalnızca 1 g karaciğer doku, bu yüzden örnek gerekli miktarda süt sığır gibi büyük hayvanlarda karaciğer boyutuna göre küçük ve küçük kurtarma zaman gerekli gereklidir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mitokondri stres çok duyarlıdır ve hücresel çevreleri çok çeşitli metabolik hastalıklar katkıda bulunabilir. Oksijen tüketimi ve mitokondri proton sızıntısı mitokondri sağlık göstergeleri vardır. Bu kağıt tahmin mitokondrial enerji verimliliğinde oksijen tüketimi ve proton sızıntısı olmayan temel RCR kullanarak açıklanan yöntemleri. Bu sonuçlar besin kullanımı1' kayıp enerjinin % 30 için hesap. Oksijen tüketimi ve proton sızıntı değişiklikleri için metabolik hastalık katkıda bulunur ve azalan enerji verimliliği sonuçları mitokondrial disfonksiyon tanımlayabilirsiniz. Bu yöntemler aynı zamanda mitokondrial solunum üzerinde farklı tedaviler etkisini incelemek için kullanılabilir. Mitokondrial oksijen tüketimi ve proton sızıntı kinetik ölçme genel mitokondriyal işlev ve enerjik etkinliğini değerlendirmek için hedeftir.

Hepatik mitokondrial disfonksiyon süt sığır çeşitli hastalıklar ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Hücresel metabolizma erken emzirme bir enerji açığı ile karşı karşıya zaman karbonhidrat ve lipid yakıtlar arasında geçiş yapma yeteneği sayısı ve mitokondri2hücre işlevi etkilenir. Mitokondri enerji ve artan β-oksidasyon için artan bir talep uyum yeteneği kusurları insülin direnci ile ilişkili hücre içi lipid birikimi yol açabilir ve erken emzirme süt ineklerin yağlı karaciğer oluşumuna yol açabilir. Mitokondri, keton vücut üretim ve kullanımı, site olarak ketozis süt inekleri3önemli bir rol oynayabilir. Mitokondri veya mitokondrial disfonksiyon eksikliği yakıt durumu çevre etkileyecek ve oksijen tüketimi veya RCR değişiklikleri yansıması.

Mitokondrial oksijen tüketimi değişiklikleri yanıt olarak inflamasyon. Yedi günlük eski yumurtlayanlar rastgele Eimeria maxima ve kontrol grubu4ile enfekte bir gruba ayrıldı. Coccidiosis meydan geçmesi değil yumurtlayanlar proton sızıntı ve daha yüksek RCR karaciğer mitokondri artan proton sızıntısı tarafından bir bağışıklık sınamasına yanıt belirten nedeniyle daha az oksijen tüketimi vardı. Proton sızıntı ve reaktif oksijen türleri üretim bir kez mitokondri zar disfonksiyon belirtisi olarak kabul edildi ve enerjik verimliliği için zararlı, şimdi bu protein ve kalsiyum içe mitokondri5 aktarmak için önemlidir Bilindiği ve ısı1nesil için.

Solunum zinciri elektron sızıntı mitokondri reaktif oksijen türleri üretim ve oksidatif hasar mitokondri zar proteinleri, lipidler ve mitokondriyal DNA getirir; Mitokondri yaşlandıkça, hasar için özellikle daha fazla mitokondriyal metabolizma6 ve daha fazla duyarlılık inek hastalığı disfonksiyon neden mtDNA birikir. Pratikte, çok hayvancılık hayvan takviyeleri Cu, Zn ve Mn antioksidan işlevi artırmak için gibi yüksek düzeyde beslenir. Ancak, Cu yüksek düzeyde besleme, Zn ve Mn süt üretimi azalmıştır ve oksijen tüketimi proton sızıntısı (devlet 4 solunum)7nedeniyle arttı.

Sığır enerji verimliliği mitokondriyal işlevde rolünü önceki araştırma mitokondrial oksijen tüketimi ve proton sızıntı değişiklikler üzerinde odaklanan. Çok az sayıda çalışmalar süt sığır yayınlanmış ve üretim verimliliği sığır mitokondriyal işlev artık yem alımı (RFI) şeklinde en kartları karşılaştırın. Mitokondrial solunum oranları emzikli Holstein inek ve emzikli sığır ciğeri state 3, devlet 4 ve RCR ölçerek incelenmiş değişkenliği (Angus, Brangus ve Hereford)8inekler. Araştırmacılar herhangi bir korelasyon büyüme veya özellikleri sığır için sağım mitokondrial solunum bulamadık ama mitokondrial solunum ve özellikleri Holsteins için sağım arasında bir ilişki rapor vermedi. İki çalışmalarda, RFI sığır mitokondrial solunum oranları (state 3, devlet 4 ve RCR) kas mitokondri9,10' karşılaştırıldı. DMI cevaben mitokondrial solunum oranları değişti ve düşük oranları daha az verimli sığır eti steers ile ilişkili bulunmuştur. Başka bir çalışmada, yüksek veya düşük RFI bulls gelen ederek RFI mitokondrial solunum oranları ve proton sızıntı kinetik Döl11iki grubu ile karşılaştırıldığında. Kazanç kazanç sonuç içinde sığır mitokondrial solunum etkisi yapar teyit nedeniyle farklılıklar vardı.

Bu kağıt, RCR 3 antioksidan mineral laktasyondaki süt sığır besleme yanıt ölçmek için yöntemleri kullanılışını karaciğer inceleyerek bir deney sırasında oksijen tüketimi 4 devlet ve devlet 3 solunum ve PMF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tüm yöntemleri, protokolü ve burada açıklanan çalışmaları Davis kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Kaliforniya Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. alma karaciğer biyopsisi bir Holstein süt ineği

Not: Karaciğer biyopsisi lisanslı bir veteriner tarafından gerçekleştirilmelidir. Karaciğer biyopsi inekler konumlandırıldığı sitenin süt gerçekleştirilebilir. Laktasyondaki süt inekleri normalde Sağılan devam edebilir ve süt gıda tedariki önce veya sonra yordamın geri olması gerekmez. Bu en az 4 kişi karaciğer biyopsisi süt ineği üzerinde gerçekleştirmek için gereken önerilir: biyopsi, ineğin beyinsizler biyopsi alan ve hayvan hastalıklarıyla ilgili, laborant palaşma kaleme dışındaki korumak için durmak için bir hayvan işleyicisi gerçekleştirmek için a hayvan hastalıklarıyla ilgili er, malzemeleri ve biyopsi örnek için ve veteriner ve bir araç (Şekil 1) ve karaciğer örnek almak ve mitokondrial yalıtım başlamak için bir teknisyen arkasında olabilir temiz alan korumak.

  1. Karaciğer biyopsisi önce bir ay vermek clostridia aşı inekler. Isıyla cerrahi havlu, biyopsi enstrümanı, neşter sahipleri ve cerrahî donanımlar tarafından cerrahi paketleri oluşturun.
  2. Bir gün önce karaciğer biyopsisi, inek subkutan boynundan Ceftiofur hidroklorid 0,044 mL/kg vücut ağırlığı ile enjekte. Monitör inek sıcaklık, alımı ve dışkı puanları normal fonksiyonu için taban çizgisi olarak kullanın.
  3. Mitokondri yalıtım medya (MIM) containining 220 mM mannitol, 70 mM sükroz, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA ve %0,1 (w/v) yağ asidi ücretsiz BSA, pH 7.4 4 ° C'de oluşturmak Örnek başına yaklaşık 30 mL-ecek var gerek.
  4. İnek (Şekil 2) bir dersin bir yular ile gerektiği gibi fiziksel olarak kullanan dizginlemek. Yular kullanarak, kafasını ağından sol tarafına bağla. Gerekirse, kimyasal bir kısıtlama (Xylazine hidroklorür 100 mg/mL IV 0.010-0,015 adlı mg/kg vücut ağırlığı) kullanılabilir.
  5. Biyopsi alanının sağ 10 - 11. interkostal alan (Şekil 3) bulunur. Düz bir çizgi doğru yumru bacak sağ omuz noktasına çizmek. Bu hat ile 10-11. interkostal alan kesiştiği biyopsi sitedir. 10 cm kare alan (Şekil 4) traş tarafından biyopsi olmak inek bölgeyi sterilize. Alan dairesel bir hareket kullanarak % 10 providone bodur (Şekil 5) ile yıkayın. Alan sprey % 70 etanol çözüm (Şekil 6). Tekrar providone ve etanol yıkar.
    Not: Holstein süt sığır et sığırı kıyasla biraz daha farklı bir konumda ciğer var.
  6. %2 lidokain HCl (10-15 mL) yerel olarak deri ve temel kas ve bağ dokusu (Şekil 7) anestezi sağlamak için bölgeye enjekte et. Tekrar providone ve % 70 etanol yıkar.
    Not: Sinir uçlarının deride vardır ve kaslı değil iç organlar, yalnızca bir yerel anesthestic ama gereklidir. En az, inek sadece biraz baskı ve acısız biyopsi işlemi sırasında hissetmeniz gerekir.
  7. 1-2 cm bıçak-kesi 10-11. interkostal alan (Şekil 8) deri yoluyla olun. Schackelford-Courtney sığır karaciğer biyopsisi enstrüman deri yoluyla geçmek ve diyafram ve karaciğer (Şekil 9, Şekil 10) içine devam ederken hafif bir kranial yönde biyopsi enstrümanı doğrudan. 1 g örnek karaciğer ve enstrüman (Şekil 11) kaldırın. Deri dikiş yerleşim (Şekil 12) ile kapatın.
  8. Karaciğer örnek örnek, buz hemen mitokondri yalıtım için karşılamak için yeterli MIM bir konik boru yerleştirin
  9. Onay kesi için herhangi bir kızarıklık, şişlik, ısı, veya biyopsi 24 saat içinde ağrı ve inek günde bir sonraki 3 gün (Şekil 13) için subkutan boynundan Ceftiofur hidroklorid 0,044 mL/kg vücut ağırlığı ile enjekte. İneğin sıcaklık, alımı ve dışkı puanları günlük 1 hafta sonra karaciğer biyopsisi için izleyin. Ateşi geliştirirse, antibiyotik veteriner takdirine devam edin.
    Not: bir inek karaciğer biyopsisi sonra 1s içinde dokunmak kesi site, recumbancy, kızarıklık, ısı veya reaksiyon tekme gibi ağrı, belirtileri varsa 1 mg/kg vücut ağırlığı IV enjeksiyonu sonucu flunixin meglumin ağrı ve iltihaplanma hafifletmek için kullanılabilir. İkinci bir enjeksiyon gerekirse yönetilebilir.
  10. Dikişler 7 gün sonra biyopsi kaldırın.

2. süt ineği karaciğer üzerinden mitokondri yalıtma

  1. En kısa zamanda karaciğer örnek inek kaldırıldıktan sonra karaciğer örnek kırmızı kan hücreleri kaldırmak ve ince örnek makasla kıyma MIM (adım 1.3) yıkayın. Karaciğer doku nemli tutmak için yeterli yalıtım ortamı içeren bir soğutulmuş ölçek kıyılmış.
  2. Kıyılmış karaciğer buzun içinde inkübe ve MIM (1:4 w/v) içeren 0,16 mm izni bir teflon havaneli ile 30 mL Cam şişe yerleştirin.
  3. 500 rpm'de teflon havaneli ile 4 vuruş/dk dk için karaciğer örnek lunaparkçı.
    Not: Karaciğer homogenate bir buz dolu ölçek MIM içinde tüm işlemi sırasında tutulur ve tüm aşağıdaki Santrifüjü adımları 4 ° C'de tamamlanır
  4. Homogenate vasıl 500 x g 10 dk santrifüj kapasitesi, Pelet atmak, soğutulmuş santrifüj tüpü süpernatant aktarmak ve ardından elde edilen süpernatant 10.000 x g mitokondrial Pelet elde etmek 10 dk de santrifüj kapasitesi.
  5. Resuspend ve Pelet MIM yağ asidi ücretsiz BSA ile 10 mL yıkayın ve 8100 x g 10 dk. atma süpernatant için de santrifüj kapasitesi.
  6. Resuspend ve Pelet MIM yağ asidi ücretsiz BSA olmadan 10 mL yıkayın ve 8100 x g 10 dk. atma süpernatant için de santrifüj kapasitesi.
  7. Pelet yalıtım medya 200 µL içinde askıya alma ve oksijen tüketimi ve proton sızıntı kinetik deneyleri için kullanılan kadar buz üzerine yerleştirin.
  8. Bicinchoninic asit (BCA) seti üreticisinin Protokolü başına BSA ile standart olarak kullanarak protein konsantrasyonu Pelet süspansiyon (1/100 seyreltme) belirlemek. Tüm protein mitokondrial protein olarak kabul edilir.

3. ölçme mitokondrial oksijen tüketimi (devlet 4 3 ve devlet)

  1. Oksijen tüketimi medya (OCM) 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2oluşturmak, 5 mM Hepes ve 1 mM EGTA, pH %7,4 0,3 ile 30 ° C'de BSA kakaoyu. Yaklaşık 3 mL örnek başına gerekli olacaktır. Ayrıca 8 μg/mL oligomycin etanol çözeltisi hazırlamak.
  2. 30 ° C'de OCM kuluçkaya Solunum odası, pompa ve oksijen elektrot üretici talimatları (oxygraph sistemi) göre ayarlayın. Oxygraph yazılım zaten bilgisayarda yüklü.
  3. 1 mL OCM solunum odanın içine koyun ve karistirin. Bu çözüm hava ile doymuş hale gelir temin yardımcı olur.
  4. 0.35 mg protein mitokondrial proteinin solunum odasına ekleyin ve sıcaklık 30 ° C'de muhafaza
  5. Oksijen tüketimi yaklaşık 5 min için kaydedin. Oxygraph sistem kayıtları oksijen konsantrasyonu çok solunum arttıkça oksijen konsantrasyonu azalır. Ne zaman oksijen tüketimi olur sabiti (azalan düz bir çizgi), kayıt oksijen tüketimi (çizgisinin eğimini yoğunlukta oksijen/saat =). Bu temel oksijen tüketimi var.
  6. Karmaşık etkisizleştirmek için 4 mM Rotenon çözümün 1,25 µL ekleyin ben ve 5 mM süksinat solunum odasında son bir konsantrasyon ulaşmak için 1 M süksinat çözümün 5 µL ekleyin. Bu durum 4 solunum var.
  7. 100 μm kalınlığında solunum odasında son bir konsantrasyon ulaşmak için 100 mM ADP çözeltinin 1 µL ekleyin. Oksijen konsantrasyonu (artan solunum) azalacak ve sonra yaklaşık 5 dk düz bir çizgi haline geldikten sonra. Kayıt oksijen tüketimi (çizgisinin eğimini yoğunlukta oksijen/saat =). Bu durum 3 solunum var.
  8. İsteğe bağlı: Çalıştır sonunda maksimal solunum ikna etmek için FCCP (0,2 mikron toplam hacim) ekleyin. Solunum için yaklaşık 5 dk (yaklaşık) kaydedin. Ne zaman oksijen tüketimi sabit, kayıt oksijen tüketimi olur. Maksimal oksijen tüketimi bu.
  9. Solunum Denetim oranı (RCR) durum 3 oksijen tüketimi denklemi kullanarak hesaplamak / 4 oksijen tüketimi eyalet.
  10. Tüm solunum odası dışında çözümler Aspire edin. Odası Çift Kişilik deiyonize su ile birkaç defa durulayın.

4. ölçme mitokondrial membran potansiyeli (MMP) ve Proton sebep kuvvet (PMF)

  1. 80 ng/mL nigericin etanol çözeltisi hazırlamak.
    Not: Bu kimyasalların etanol içinde çözülür ve etanol etanol elektron taşıma sistemi Böl ve mitchondrial disfonksiyon neden bu yana, 1 μL için eklenir miktarını sınırlamak için her türlü çabayı yapılmalıdır.
  2. İyice odası Çift Kişilik deiyonize su ile durulama sonra OCM 1 mL solunum odanın içine yerleştirin ve bir manyetik heyecan bar ile karistirin. Bu çözüm hava ile doymuş hale gelir temin yardımcı olur. Kurulum odası için metil-triphenyl-phosphonium (TPMP +) hassas elektrot ekleyin. TPMP + elektrot bir pH metre bağlantısının kurulması ve değerleri pH metre ile okunur.
  3. Mitokondrial protein 0.35 mg solunum odasına ekleyin.
  4. Karmaşık ı. kayıt solunum için 2-5 dk (yaklaşık) etkisizleştirmek için 4 mM Rotenon çözümün 1,25 µL ekleyin. Ne zaman oksijen tüketimi sabit, kayıt oksijen tüketimi olur.
  5. 0,56 μL 2.8 µg oligomycin /0.35 mg mitokondrial protein ADP kullanımı engellemek için son bir konsantrasyon için 8 μg/mL oligomycin çözümü ekleyin. Solunum için 2-5 dk (yaklaşık) kaydedin. Ne zaman oksijen tüketimi sabit, kayıt oksijen tüketimi olur.
  6. 0,112 μL 80 ng/mL nigericin çözüm pH degrade mitokondriyal iç membran kaldırılması için ekleyin. Solunum için 2-5 dk (yaklaşık) kaydedin. Ne zaman oksijen tüketimi sabit, kayıt oksijen tüketimi olur.
    Not: Elektron taşıma engellemek için kullanılır Rotenon ve oligomycin zincir kompleksi ben ve ATP sentaz, anılan sıraya göre. Nigericin bir elektrot ile ölçülebilir bir K + degrade transmembran S + degradeyi dönüştürmek için eklenir.
  7. Standart bir eğri hazırlamak için TPMP + 10 mM TPMP + çözüm 5 µL mitokondrial kuluçka ekleyerek. 2,5 μM TPMP + toplam konsantrasyon eklendi bu kadar dört kez daha tekrarlayın.
  8. Solunum 1 M süksinat 5 μL odasına ekleyerek başlatın.
  9. İstikrarlı bir izleme elde ettik kadar solunum kaydı ve sonra sistem malonat ekleyerek titre. Malonat eklemeler 0.5 µL, 1 µL, 1,5 µL, 3.0 µL, 6.0 µL, 9.0 µL, sonra 12.5 µL 0,1 mM malonat konsantrasyonları kuluçka odasında 0,1 0,2 0,3, 0.6, 1.2, 1.8 art arda gelen eklemeler elde etmek için malonat çözüm ve 2.5 mM olmalıdır.
  10. İki elektrot (oksijen ve TPMP+) üzerinden veri toplama. Veri toplama yazılımı oxygraph sisteminden mitokondrial oksijen tüketimi ve mitokondri zar potansiyel simultane ölçümleri toplamak ve değişiklikleri gerçek zamanlı olarak oksijen tüketiminde gözlemlemek için kullanılabilir. Şekil 14 oxygraph sistemi deneme ilerledikçe oksijen tüketimi kayıtları nasıl gösterir.
  11. MMP üzerinde Nernst denklemi dayalı mV Hesapla:
    MMP 61,5 günlük = (dış [TPMP +] [TPMP +] eklendi-) x TPMP+ bağlama düzeltme / (0,001 x mg protein/ml x [TPMP +])
    Bir TPMP + bağlama düzeltme 0.4 µL/mg mitokondrial protein-1 kullanılır.
    Örnek hesaplama protokolü konsantrasyonlarda göre:
    MMP = 0,4 x 61,5 x oturum (5 mikron-2 µM) / (0,001 x 0.35 mg mitokondrial protein/mL x 2 µM)
    MMP 198.9 = mV
  12. Oksijen tüketimi vs MMP (Şekil 15) bir grafik olarak çizme tarafından tahmin PMF. PMF 165 membran potansiyeli, oksijen tüketimi bildirilen mV.
    Not: malonat (0,1-2.5 mM) ile elektron taşıma zinciri Titrating proton sızıntı kinetik yanıt MMP için gösterir. O zaman, MMP oksijen tüketimi karşı komplo proton sızıntı kinetik belirler. PMF ortak membran potansiyeli, oksijen tüketimini hesaplama tarafından belirlenir (165 mV).
  13. Örnek son çalışması sonunda maksimal solunum teşvik ve TPMP + temel düzeltme için serbest bırakmak için FCCP (0,2 mikron toplam hacim) ekleyin.
  14. Tüm solunum odası dışında çözümler Aspire edin. Odası Çift Kişilik deiyonize su ile birkaç defa durulayın. Günün sonunda, odası da birkaç kez etanol ile durulanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

RCR ve proton sızıntı kinetik gösteren olumlu sonuçları Tablo 1 ve Şekil 15, sırasıyla gösterilir. Bu çalışmada7, RCR ve protein sızıntısı kinetik ölçülen Holstein Süt ineklerin süt 70 gün, inekler 28 gün boyunca 1, Cu, Zn ve Mn 5 farklı seviyelerde beslenen sonra. Devlet 4, en fazla proton sızıntı bağlı solunum, Cu, Mn ve Zn (p < 0,1) mineral alımını tarafından etkilenmiş gibi bir eğilim vardı. Devlet 3 solunum (en fazla ATP uyarılmış solunum) ve RCR durum 3 = / devlet 4 (solunum denetim oranı) mineral alımı tarafından etkilenen değil. Devlet 4 solunum LowMn en yüksek ve en düşük Mn proton sızıntı bağımlı solunum en aza indirmek önemli bir rol oynar gösteren denetiminde. Manganez, enzim Mn süperoksit dismutaz aracılığıyla reaktif oksijen türleri mitokondrial matris ve proton sızıntı12azaltabilir olduğu bilinmektedir. Daha yüksek devlet 4 solunum düşük süt ve süt proteini verim ile ilişkili. Proton sızıntı enerji verimliliği önemli bir bileşeni olduğundan, devlet 4 solunum yoluyla Mn takviyesi azaltarak verimliliği artırabilirsiniz.

Tedaviler1
Yüksek Med Düşük LowMn Denetim SEM
Süt, kg 47.4ab 50.9bir 46.0ab 43.6b 49,7bir 2,9
Süt proteini, kg 1,38ab 1.44bir 1.40ab 1.23b 1.43bir 0,09
Devlet 3 75.8 64.4 78.2 73 64.1 13
Devlet 4 26.2ab 22,6ab 25.9ab 27.1bir 22.0b 3
RCR 2,89 2,76 2,98 2,65 2.83 0,27
bir b Önemli ölçüde farklı olduğu anlamına gelir aynı üst simge mektupla takip değil bir satır içinde (P < 0,1).
1 yüksek tedavi en üst düzeyde Cu, Zn ve Mn gereksinimleri13çok üzerinde tüm içeren, Med tedavi gereksinimleri yukarıda, Cu, Zn ve Mn ara düzeyleri içerir, Cu, Zn ve Mn ama hala yukarıda alt düzeyleri düşük tedavisi içerir gereksinimleri, düşük Mn tedavi içeren ve en düşük düzeyde Mn (ve daha düşük düzeyde Cu ve Zn) ama hala gereksinimleri ve kontrol tedavi gereksinimleri yakın Cu ve Zn, en düşük fiyat düzeylerini içerir.

Tablo 1: Cu etkisi, Mn ve Zn takviyesi karaciğer mitokondrial oksijen tüketimi ve süt üretim Süt ineklerin süt 70 gün üzerinde. Bu tablo Acetoze ve ark. 20177' den uyarlanmıştır.

Mitokondrial proton sızıntı mitokondriyal iç zar ATP14üretim olmadan genelinde protonlar hareket MMP kalır bir süreçtir. Proton sızıntı kinetik değerlendirildi 165 ortak bir membran potansiyeli olarak oksijen Tüketim oranları hesaplayarak mV. Alt membran potansiyeli proton 'alt ATP sentezi (Şekil 15) sonuçları mitokondri zar arasında sızıyor ki' anlamına gelir. Holstein inek çalışmada, hepatik proton sızıntı bağımlı solunum LowMn en büyük ve en düşük denetiminde, devlet 4 solunum LowMn en büyük ve en düşük kontrol sonuçları Tablo 1, kabul eder.

Figure 15
Şekil 15. Proton sızıntı kinetik Holstein ineklerin farklı miktarı Cu, Mn, Zn beslenir. Bu grafik veri Acetoze ve ark. 20177temel alır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Olumsuz sonuçları Tablo 2 ve Şekil 16gösterilmiştir. Özet akışı verimliliği (RFI) yüksek RFI boğa daha düşük RFI boğa doğan Angus ederek daha yüksek ama bu mitokondrial RCR (Tablo 2) veya proton sızıntı kinetik (Şekil 16) yansıdı değil. Mitokondrial solunum ve proton sızıntı kinetik steers grupları arasında hiçbir fark vardı ama RFI bir fark vardı. Ayrıca hiçbir fark vardı (p = 0,88) kaçak hepatik mitokondrial proton içinde yüksek ve düşük RFI steers (Şekil 16). Büyük standart mitokondrial solunum ölçümleri ile ilişkili hatalar vardı ve proton sızıntı kinetik eğriler düz. Bu çalışmada karaciğer örnekleri elde ederek katlettikten sonra karaciğer örnek toplama ve işleme tarafından bir saat gecikmeli bir süreç. Varyasyon mitokondrial solunum önlemler mitokondrial solunum bozulması doku ölümü nedeniyle yansıtabilir. Proton sızıntı kinetik çizgiler düz..... .çünkü Plato zaten bir ekipman arızası nedeniyle üst sınırına ne zaman oksijen tüketimi ölçümleri 8 dk kadar başlamadı.

Düşük RFI Yüksek RFI SEM P değeri
(n = 7) (n = 8)
RFI -0.58 -0.01 0,1 0,05
Devlet 3 31.3 30.8 9,42 0,9
Devlet 4 9.76 10,4 3.23 0.8
RCR 3,05 3.03 0,24 0,93

Tablo 2: performans ve yüksek ve düşük rezidüel yem alımı (RFI) Angus mitokondrial solunum boğa döl. Bu tablo Acetoze ve ark. 201511' den uyarlanmıştır.

Figure 16
Şekil 16. Proton sızıntı kinetik Döl yüksek ve düşük RFI Angus boğa için. Bu grafik Acetoze ve ark. 201511' den uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 1
Resim 1: temiz alan için cerrahi ve biyopsi materyalleri bir aracın arkasında ve inek kalem dışında yer alan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: bir yular kullanarak inek kısıtlama bağlı çapraz direğe kafa kilidi için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: sağ omuz noktasına doğru yumru bacak düz bir çizgi çizerek bulundu sağ 10 - 11. interkostal alan biyopsi konumunu ve biyopsi için temizlemek için inek alan. Bu hat ile 10-11. interkostal alan kesiştiği biyopsi sitedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: 10 cm alan biyopsi için sterilize etmek hazırlamak için inek tıraş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: dairesel bir hareket kullanarak % 10 providone maki ile biyopsi alan inek yıkama. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6. Biyopsi alanı % 70 etanol çözüm ile sprey. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: %2 lidokain HCl (10-15 mL) yerel olarak anestezi cilt sağlamak için bölgeye enjekte. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8: 1-2 cm bıçak-kesi biyopsi araç eklemek için 10-11. interkostal alan deri yoluyla. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 9
Şekil 9: deri yoluyla sığır karaciğer biyopsisi enstrümanın ekleme. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 10
Şekil 10: biyopsi enstrümanı diyafram ve karaciğer içine devam ederken hafif bir kranial yönde yönelik olmalıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 11
Şekil 11: 1 g örnek biyopsi araç Falconer tüp mitokondrial yalıtım İstasyonu'na ulaşım için taşınmakta olan karaciğer. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 12
Şekil 12: biyopsi kesi kapatmak için deri dikiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 13
Şekil 13: inek ile Ceftiofur hidroklorid 0,044 mL/kg vücut ağırlığı boynundan subkutan enjeksiyon. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 14
Şekil 14: Oxygraph yazılım sonuçları oksijen tüketimi yanıt mitokondri zar potansiyel (MMP) ve proton gerekçesi ölçmek için her madde eklenmesi için gösterilen kuvvet (PMF). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En kritik nokta protokolündeki temsilcisi karaciğer doku örneği alma ve mitokondri yalıtım en kısa zamanda biyopsi sonra başlangıcı. Solunum ölçüleri içinde çeşididir inek laboratuvar bir kısa ulaşım zaman nedeniyle düşük (Tablo 1). Taşıma süresini azaltmak için küçük bir laboratuvar süt ofiste kurulmuştur ve mitokondri biyopsi 10 dk içinde izole böylece her toplanan gibi karaciğer örnekleri için office laboratuvar sürüldüler. Kurulum ve proton degradeler kayıt farklılıkları için toplama ve işleme örnekleri erken proton sızıntı ölçümlerde eksik gibi arızalar önleyebilirsiniz önceki gün kullanılan pH metre ile solunum odası ve elektrotlar (oksijen, TPMP +) test kinetik (Şekil 16).

Taze karaciğer örnekleri ve mitokondri hızlı yalıtım için ihtiyaç nedeniyle toplanan ve bir günde işlenen örnekleri sayısı sınırlıdır. Her bir örneği tamamlamak için yaklaşık 5-6 h alır; Bu nedenle, günlük sadece 5 örnekleri toplanan ve solunum odası analiz. Bu yüksek aktarım yöntemi değildir; tedaviler için örnek boyutu sınırlıdır ve küçük hataları sonuçları ve önemi algılama yeteneğini ilişkili değişkenlik arttırabilirsiniz.

Yalıtım teknik bazı hücre bileşenleri ile ilişkili olan ve Pelet içinde gömülü kalır bazı mitokondri hariç tutabilirsiniz veya daha küçük mitokondri Pelet yıkar Santrifüjü adımları sırasında kaybolabilir. Bu mitokondri tam nüfusu yansıtmıyor sonuçlara neden olabilir. Mitokondri boyutu ve yoğunluğu fizyolojik Devletler açlık gibi bağlı olarak değiştirmek ve egzersiz (eğitim)15. Mitokondrial numarası sitrat sentaz16 ya da süksinat dehidrogenaz17 bulguları teyit için kullanma enzim aktivite ile tahmin gerekli olabilir.

Hiçbir değişiklik Rodents mitokondrial yalıtım18, solunum19 için kurulan orijinal teknikleri için yapılmış ve proton sızıntı kinetik20. Bu teknik değişiklikler mitokondri ve deneysel tedaviler doku kaynağına bağlı olarak yapılabilir. (Kakaoyu) BSA serbest yağ asitleri dokusunda bağlamak için kullanılır. Doku çok varsa mitokondrial ölçümleri ile serbest yağ asitleri bulunacağından yağ ilişkili asitleri (10 %'den büyük), daha kakaoyu BSA eklenebilir.

Ölçme mitokondrial oksijen tüketimi ve proton sızıntı kinetik bu tekniği kullanarak standart bir uygulamadır. Karaciğer doku tercih çünkü öncelikle mitokondri bir yeri vardır oldukça ayıklamak kolaydır ve karaciğer besin işleme birincil sitedir olmuştur. Bu teknik değişiklikler meme ve kas gibi diğer dokulara oksijen tüketimi ölçmek için kullanılmaktadır. Ancak, mitokondrial yalıtım teknikleri doku sığacak şekilde değiştirilmesi gerekir. Örneğin, kas, mitokondri içinde kas lifleri katıştırılır ve yalıtım yordam eklemeniz gerekir bu yüzden protein sindirimi ve hazım mitokondriyal işlev değil bozulur emin olmak için kontrol edilmelidir.

Solunum ölçmek üzere özel olarak tasarlanmış bir çözümleyici gerektiren mitokondrial solunum ölçmek için başka yöntemleri de vardır. Hücreleri dokudan hasat ve kuluçka plakaları için sabit. Analyzer önlemler tüm cep telefonu oksijen tüketim oranını (OCR; bazal), ATP bağlantılı OCR (mitokondri ile ilişkili), nonmitochondrial OCR ve maksimal OCR. Ancak, mitokondri bazı kuluçka sırasında inhibe beri izole mitokondri ölçümler mümkün değildir. Bu yöntemin insanlarda hastalık ve uyuşturucu müdahaleler21 ile OCR değişiklikleri incelemek için kullanılmıştır.

Mevcut ve gelecekteki uygulamalar

Proton sızıntı enerji gereksinimleri hayvanın katkı büyük ve büyüme, emzirme ve hastalığı da dahil olmak üzere hayvan fizyolojik durumunu göstergesi olabilir. Geçmişte, bu tekniği öncelikle mitokondrial oksijen tüketimi Derneği ve beslemek için proton sızıntı veya enerjik verimliliği incelemek için kullanılmıştır. Anlayışımız mitokondri metabolizması rolü genişledikçe, ancak, bu teknik önemi de elektron taşıma zinciri enzim aktiviteleri, kalsiyum gibi mitokondrial diğer tedbirler ile birlikte özellikle de artacaktır TCA döngüsü apoptozis ve enzim faaliyetlerinde dinamiği.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu araştırma, gıda hayvan sağlığı, UC Davis Veteriner Tıp Fakültesi için merkezi aracılığıyla Alltech ve USDA kapak fon tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Liver Biopsy
Equipment
Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument Sontec Instruments Englewood CO 1103-904
Suture Fisher Scientific 19-037-516
Suture needles NA NA Included with Suture
Scalpels Sigma - Aldrich S2896 / S2646 # for handle and blades
Surgery towels Fisher Scientific 50-129-6667
Falcon tubes 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Tweezers Sigma - Aldrich Z168750
50 mL syringes Fisher Scientific 22-314387
Injection needles (22, 2 1/2) VWR MJ8881-200342
Cow halter Tractor Supply Co. 101966599
Cotton swabbing Fisher Scientific 14-959-102
cotton gauze squares (4x4) Fisher Scientific 22-246069
Medical scissors Sigma - Aldrich Z265969
Chemicals
Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow Provided by Veterinarian
Clostridia Vaccine Provided by Veterinarian
Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days Provided by Veterinarian
Providone Scrub Aspen Veteterinary Resources 21260221
Ethanol 70% Sigma - Aldrich 793213
Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight Provided by Veterinarian
2% lidocaine HCl (10-15 mL) Provided by Veterinarian
1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine Provided by Veterinarian
Isolation of Mitochondria (liver)
Equipment
Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance Fisher Scientific 02-911-527
Homogenizer Motor Cole Parmer EW-04369-10
Homogenizer Probe Cole Parmer EW-04468-22
Auto Pipette (10 mL) Cole Parmer SK-21600-74
Beaker (500 mL) with ice Fisher Scientific FB100600
Refrigerated microfuge Fisher Scientific 75-002-441EW3
Microfuge tubes (1.5 mL) Fisher Scientific AM12400
Chemicals
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) abcam ab102536
Sucrose Sigma - Aldrich S7903-1KG
Tris-HCl Sigma - Aldrich T1503-1KG
EDTA Sigma - Aldrich EDS-1KG
BSA (fatty acid free) Sigma - Aldrich A7030-50G
Mannitol Sigma - Aldrich M4125-1KG
Deionized water Sigma - Aldrich 38796
Hepes Sigma - Aldrich H3375-500G
Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,  pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator
Mitochondrial Oxygen Comsuption
Equipment
Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode Hansatech (PP Systems) OXY1
Thermoregulated Water Pump ADInstruments MLE2001
Clark type Oxygen electrode NA NA
Autopipette (1 mL) Cole Parmer SK-21600-70 Included with Oxy1
Small magnetic stir bar Fisher Scientific 14-513-95
Micropipette (10 μL) Cole Parmer SK-21600-60
pH meter VWR
Chemicals
KCl Sigma - Aldrich P9333-1KG
Hepes Sigma - Aldrich H3375-500G
KH2PO4 Sigma - Aldrich P5655-1KG
MgCl2 Sigma - Aldrich M1028-100ML
EGTA Sigma - Aldrich E3889-100G
Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA
Rotenone (4 mM solution) Sigma - Aldrich R8875-5G
Succinate (1 M solution) Sigma - Aldrich S3674-250G
ADP (100 mM solution) Sigma - Aldrich A5285-1G
Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) Sigma - Aldrich 75351
FCCP Sigma - Aldrich C2920
Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force
Equipment
TPMP electrode World Precision Instruments. DRIREF-2
Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs
Malonate (0.1 mM solution) Sigma - Aldrich M1296
Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer Sigma - Aldrich 75351
Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer Sigma - Aldrich N7143
FCCP Sigma - Aldrich C3920
TPMP Sigma - Aldrich T200
TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
  2. Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).
  3. Bartlett, K., Eaton, S. Mitochondrial B oxidation. European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).
  4. Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).
  5. Wallace, D. C., Fan, W. Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics. Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).
  6. Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging. Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).
  7. Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc. Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).
  8. Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle. Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).
  9. Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers. Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).
  10. Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle. Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).
  11. Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls. ISRN Vet Sci. 2015, (194014), (2015).
  12. Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity. Free Radicals in Biology and Medicine. Oxford University Press. Oxford. 186-187 (1989).
  13. National Research Council. Nutrient Requirements of Dairy Cattle. 7th revised edition, National Academy Press. Washington, DC. (2001).
  14. Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging. Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).
  15. Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity: beyond ATP. Nature. 17, 608-620 (2017).
  16. Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. Biochemical assays of respiratory chain complex activity. Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).
  17. Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression. Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).
  18. Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats. British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).
  19. Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice. PloS One. 3, (3), e1759 (2008).
  20. Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction. Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).
  21. Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research. Clinical Science. 127, 367-373 (2014).
Karaciğer mitokondrial oksijen tüketimi ve Proton sızıntı kinetik Holstein süt sığır mitokondrial solunum tahmin etmek için ölçme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rossow, H. A., Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J. Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle. J. Vis. Exp. (141), e58387, doi:10.3791/58387 (2018).More

Rossow, H. A., Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J. Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle. J. Vis. Exp. (141), e58387, doi:10.3791/58387 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter