Hier teilen wir Methoden zur Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch, eine definierende Konzept der ernährungsphysiologischen Energetik und Proton Leck, die primäre Ursache der Ineffizienz im mitochondrialen Erzeugung von ATP. Diese Ergebnisse können entfallen 30 % der Energie verloren Nährstoff Auslastung zu helfen, mitochondriale Funktion ausgewertet werden soll.
Sauerstoffverbrauch, Proton Motive force (PMF) und Proton Leck sind Messungen der mitochondrialen Atmung, oder wie gut Mitochondrien ATP NADH und FADH umsetzen können. Da Mitochondrien auch der primäre Standort für Sauerstoff und Nährstoff Oxidation zu Kohlendioxid und Wasser, wie effizient sie Sauerstoff und produzieren ATP direkt bezieht sich auf die Effizienz der Nährstoff Stoffwechsel Nährstoffbedarf des Tieres, und Gesundheit des Tieres. Der Zweck dieser Methode ist es, mitochondriale Atmung zu untersuchen, die verwendet werden, um die Auswirkungen der verschiedenen Medikamente, Ernährung und Umwelteinflüsse auf mitochondrialen Stoffwechsel untersuchen. Die Ergebnisse enthalten Sauerstoffverbrauch gemessen als Proton abhängigen Atmung (Zustand 3) und Proton Leck abhängigen Atmung (Zustand 4). Das Verhältnis von Staat 3 / staatliche 4 Atmung ist definiert als Atmungskontrolle Verhältnis (RCR) und mitochondriale energetischen Effizienz darstellen kann. Mitochondriale Proton Leck ist ein Prozess, der Ableitung der mitochondrialen Membranpotentials (MMP) ermöglicht durch abkoppeln Oxidative Phosphorylierung von ADP verringern die Effizienz der ATP-Synthese. Sauerstoff und TRMP + empfindliche Elektroden mit mitochondrialen Substrate und Elektronentransport-Kette-Inhibitoren sind zur Messung der Status 3 und Staat 4 Atmung, Mitochondrien-Membran PMF (oder das Potenzial um ATP zu produzieren) und Proton Leck. Einschränkungen dieser Methode sind, dass Lebergewebe so frisch wie möglich sein muss und alle Biopsien und Assays in weniger als 10 h durchgeführt werden müssen. Dies schränkt die Anzahl der Samples, die gesammelt und von einer einzigen Person an einem Tag etwa 5 verarbeitet werden kann. Nur 1 g des Lebergewebes ist jedoch erforderlich, damit in große Tiere wie Milchkühe, die Menge der Probe erforderlich klein im Verhältnis Leber ist und es wenig Erholungszeit benötigt gibt.
Mitochondrien sind sehr empfindlich auf stress und ihre zelluläre Umgebung kann dazu beitragen, eine Vielzahl von Stoffwechselerkrankungen. Sauerstoff-Verbrauch und Proton Leck in den Mitochondrien sind Indikatoren für die Gesundheit der Mitochondrien. In diesem Papier Schätzung mitochondriale Energieeffizienz mit RCR beschriebenen Methoden basierend auf Sauerstoffverbrauch mit und ohne Proton Leck. Diese Ergebnisse können entfallen 30 % der Energie in Nährstoff Auslastung1verloren. Änderungen im Sauerstoff-Verbrauch und Proton Leck erkennen mitochondriale Dysfunktion zur Stoffwechselerkrankung und führt zu verminderter Energie-Effizienz. Diese Methoden können auch verwendet werden, die Wirkung der verschiedenen Behandlungen auf die mitochondriale Atmung prüfen. Das übergeordnete Ziel der Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und Proton Leck Kinetik ist Funktion der Mitochondrien und energetische Effizienz zu bewerten.
Hepatischen mitochondrialen Dysfunktion wurde mit mehreren Krankheiten bei Milchkühen. Die Fähigkeit des Zellstoffwechsels, wechseln zwischen Kohlenhydrat- und Lipid Kraftstoffe konfrontiert mit einem Energiedefizit in frühen Laktation ist durch die Anzahl und Funktion von Mitochondrien in der Zelle2beeinflusst. Mängel in der Fähigkeit der Mitochondrien zur Anpassung an eine erhöhte Nachfrage nach Energie und erhöhter β-Oxidation führt zu einer Akkumulation von intrazellulären Lipid mit Insulinresistenz verbunden und führen zur Bildung von Fettleber in frühen Laktation Milchkühe. Mitochondrien, können als Ort der Keton-Körper Produktion und Gebrauch, eine Schlüsselrolle in Ketose Milchkühe3spielen. Ein Mangel an Mitochondrien oder mitochondriale Dysfunktion wirken sich Kraftstoff Verfügbarkeit an die Peripherie und in Änderungen der Sauerstoffverbrauch oder RCR niederschlagen.
Mitochondriale Sauerstoff Verbrauch Veränderungen in Reaktion auf eine Entzündung. Sieben Tage alte Masthähnchen wurden randomisiert in eine Gruppe mit Eimeria Maxima und eine Kontrolle Gruppe4infiziert. Masthähnchen, die nicht Kokzidiose Herausforderung unterziehen hatte geringeren Sauerstoffverbrauch durch Proton Leck und höhere RCR darauf hinweist, dass Leber Mitochondrien durch zunehmende Proton Leck auf eine immun Herausforderung zu reagieren. Während Proton Leck und reaktive Spezies Sauerstoffproduktion galt einst als ein Zeichen der Mitochondrien-Membran Dysfunktion und schädlich für Energieeffizienz, jetzt ist es bekannt, dass es wichtig für den Import von Proteinen und Kalzium in Mitochondrien5 , und für die Erzeugung von Wärme1.
Elektron Leck aus der Atmungskette macht Mitochondrien anfällig reaktiven Sauerstoff-Spezies-Produktion und oxidative Schäden an Mitochondrien-Membranproteine, Lipide und mitochondriale DNA. Zunehmendem Alter der Mitochondrien Schäden vor allem an MtDNA verursacht weitere Dysfunktion in den mitochondrialen Stoffwechsel6 und höhere Krankheitsanfälligkeit der Kuh ansammeln kann. In der Praxis fließen viele Nutztiere hohe Zuschläge wie Cu, Zn und Mn antioxidative Funktion zu steigern. Allerdings Fütterung hohe Cu, Zn und Mn verringerte Milchproduktion und erhöhten Sauerstoffverbrauch durch Proton Leck (Zustand 4 Atmung)7.
Frühere Untersuchungen über die Rolle der mitochondrialen Funktion im Bereich der Energieeffizienz bei Rindern konzentriert sich auf Veränderungen in der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und Proton Leck. Nur wenige Studien bei Milchkühen veröffentlicht wurden und die meisten Zeitungen vergleichen Produktionseffizienz in Form von Rest-Futteraufnahme (RFI), mitochondriale Funktion in Rinder. Variabilität in der mitochondrialen Atmung, die Preise untersucht wurden, durch Messung von Zustand 3, Stand 4 und RCR in Lebern von stillenden Holstein-Kühen und laktierenden Rind Rinder (Brangus, Angus und Hereford)8. Die Forscher fanden keinen Zusammenhang in der mitochondrialen Atmung mit Wachstum oder Melken Merkmale für Rinder aber eine Korrelation zwischen mitochondriale Atmung und Melken Merkmale für Holsteins gemeldet. In zwei Studien wurde RFI in Rinder, mitochondriale Atmung Preise (Zustand 3, Stand 4 und RCR) im Muskel Mitochondrien9,10verglichen. Mitochondriale Atmung Preise geändert in Reaktion auf DMI und niedrige Preise wurden weniger effizient Rindfleisch Ochsen zugeordnet. In einer weiteren Studie wurden RFI Ochsen von hohen oder niedrigen RFI Bulls mit mitochondrialen Atmung und Proton Leck Kinetik zwischen den beiden Gruppen von Nachkommen11verglichen. Unterschiede wurden durch Gewinn bestätigt wird, dass die Schlussfolgerung, die gewinnen nicht Auswirkungen mitochondriale Atmung in Rinder hat.
In diesem Papier ein Experiment untersucht Leber RCR als Reaktion auf die Verfütterung von 3 Antioxidans Mineralien an laktierenden Milchkühen die Verwendung von Methoden zur Messung veranschaulicht Sauerstoffverbrauch während Zustand 4 und 3 Atmung und PMF.
Die kritischsten Punkt im Protokoll ist eine repräsentative Lebergewebe Probe zu erhalten und beginnt die Isolation der Mitochondrien so bald wie möglich nach der Biopsie. Variation in Atmung Messungen ist niedrig (Tabelle 1) durch eine kurze Transportzeit von Kuh ins Labor. Um Verkehr zu reduzieren, wurde ein kleines Labor eingerichtet im Büro der Molkerei und Leber Proben wurden auf der Büro-Labor getrieben, wie jeder gesammelt wurde, so dass Mitochondrien innerhalb 10 min der Biopsie isoliert wurd…
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wurde von Alltech und USDA Luke Mittel durch das Zentrum für Tiergesundheit Essen bei UC Davis School of Veterinary Medicine unterstützt.
Liver Biopsy | |||
Equipment | |||
Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
Suture | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
Suture needles | NA | NA | Included with Suture |
Scalpels | Sigma – Aldrich | S2896 / S2646 | # for handle and blades |
Surgery towels | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
Falcon tubes 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Tweezers | Sigma – Aldrich | Z168750 | |
50 mL syringes | Fisher Scientific | 22-314387 | |
Injection needles (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
Cow halter | Tractor Supply Co. | 101966599 | |
Cotton swabbing | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
cotton gauze squares (4×4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
Medical scissors | Sigma – Aldrich | Z265969 | |
Chemicals | |||
Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow | Provided by Veterinarian | ||
Clostridia Vaccine | Provided by Veterinarian | ||
Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days | Provided by Veterinarian | ||
Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
Ethanol 70% | Sigma – Aldrich | 793213 | |
Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight | Provided by Veterinarian | ||
2% lidocaine HCl (10-15 mL) | Provided by Veterinarian | ||
1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine | Provided by Veterinarian | ||
Isolation of Mitochondria (liver) | |||
Equipment | |||
Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
Homogenizer Motor | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
Homogenizer Probe | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
Auto Pipette (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
Beaker (500 mL) with ice | Fisher Scientific | FB100600 | |
Refrigerated microfuge | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
Microfuge tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
Chemicals | |||
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) | abcam | ab102536 | |
Sucrose | Sigma – Aldrich | S7903-1KG | |
Tris-HCl | Sigma – Aldrich | T1503-1KG | |
EDTA | Sigma – Aldrich | EDS-1KG | |
BSA (fatty acid free) | Sigma – Aldrich | A7030-50G | |
Mannitol | Sigma – Aldrich | M4125-1KG | |
Deionized water | Sigma – Aldrich | 38796 | |
Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA, pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator | |||
Mitochondrial Oxygen Comsuption | |||
Equipment | |||
Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
Thermoregulated Water Pump | ADInstruments | MLE2001 | |
Clark type Oxygen electrode | NA | NA | |
Autopipette (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Included with Oxy1 |
Small magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
Micropipette (10 μL) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
pH meter | VWR | ||
Chemicals | |||
KCl | Sigma – Aldrich | P9333-1KG | |
Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
KH2PO4 | Sigma – Aldrich | P5655-1KG | |
MgCl2 | Sigma – Aldrich | M1028-100ML | |
EGTA | Sigma – Aldrich | E3889-100G | |
Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
Rotenone (4 mM solution) | Sigma – Aldrich | R8875-5G | |
Succinate (1 M solution) | Sigma – Aldrich | S3674-250G | |
ADP (100 mM solution) | Sigma – Aldrich | A5285-1G | |
Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) | Sigma – Aldrich | 75351 | |
FCCP | Sigma – Aldrich | C2920 | |
Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force | |||
Equipment | |||
TPMP electrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs | |||
Malonate (0.1 mM solution) | Sigma – Aldrich | M1296 | |
Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | 75351 | |
Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | N7143 | |
FCCP | Sigma – Aldrich | C3920 | |
TPMP | Sigma – Aldrich | T200 | |
TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA |