Her deler vi metoder til måling af mitokondrie iltforbrug, et definerende begrebet ernæringsmæssige energetik og proton lækage, den primære årsag til ineffektivitet i mitokondrie generation af ATP. Disse resultater kan udgøre 30% af den energi tabt i næringsstofudnyttelse til at hjælpe med at evaluere mitokondrie funktion.
Forbrug af ilt, proton motiv tvinge (PMF) og proton lækage er målinger af mitokondrie respiration, eller hvor godt mitokondrier er købedygtig omforme NADH og FADH i ATP. Da mitokondrier er også den primære lokalitet for oxygen brug og næringsstof oxidation til CO2 og vand, hvor effektivt de bruger ilt og producerer ATP direkte vedrører effektiviteten af næringsstof metabolisme, næringsstofbehov af dyret, og sundhed af dyret. Formålet med denne metode er at undersøge mitokondrie respiration, som kan bruges til at undersøge virkningerne af forskellige stoffer, kostvaner og miljømæssige effekter på mitokondrie stofskifte. Resultaterne omfatter iltforbrug målt som proton afhængige respiration (tilstand 3) og proton lækage afhængige respiration (status 4). Forholdet mellem staten 3 / stat 4 respiration er defineret som luftvejskontrol ratio (RCR) og kan repræsentere mitokondrie energiske effektivitet. Mitokondrie proton lækage er en proces, der giver mulighed for spredning af mitokondrielle membran potentiale (MMP) ved frakobling oxidativ fosforylering af ADP faldende effektiviteten i ATPsyntesen. Ilt og TRMP + følsomme elektroder med mitokondrie substrater og elektron transport kæde hæmmere anvendes til at måle tilstand 3 og staten 4 respiration, mitokondrielle membran PMF (eller potentiale til at producere ATP) og proton lækage. Begrænsninger til denne metode er at leveren væv skal være så frisk som muligt og alle biopsier og assays skal udføres i mindre end 10 h. Dette begrænser antallet af prøver, der kan indsamles og behandles af en enkelt person i en dag til ca 5. Dog er kun 1 g af levervævet nødvendige, så i store dyr, som malkekvæg, mængden af prøven nødvendige er lille i forhold til leveren størrelse og der er lidt restitutionstid behov.
Mitokondrier er meget følsomme over for stress og deres cellulære miljø kan bidrage til en bred vifte af metaboliske sygdomme. Forbrug af ilt og proton lækage i mitokondrier er indikatorer for mitokondrier sundhed. De beskrevne i dette papir skøn mitokondriets energieffektivitet ved hjælp af RCR metoder baseret på iltforbrug med og uden proton lækage. Disse resultater kan udgøre 30% af den energi tabt i næringsstofudnyttelse1. Ændringer i ilt forbrug og proton lækage kan identificere mitokondriel dysfunktion, som bidrager til metabolisk sygdom og resulterer i nedsat energieffektivitet. Disse metoder kan også bruges til at undersøge effekten af forskellige behandlinger på mitokondrie respiration. Det overordnede mål for måling af mitokondrie iltforbrug og proton lækage kinetik er at evaluere mitokondrie-funktion og energiske effektivitet.
Nedsat mitokondriel dysfunktion har været forbundet med flere sygdomme i malkekvæg. Cellulære metabolisme evne til at skifte mellem kulhydrat og lipid brændstoffer når de står med et energi underskud i tidlig laktation er påvirket af den nummer og funktion af mitochondrier i cellen2. Defekter i mitokondrierne evne til at tilpasse sig til en øget efterspørgsel efter energi og øget β-oxidation kan føre til ophobning af intracellulære lipid associeret med insulinresistens og kan føre til dannelse af fedtlever i tidlig laktation malkekøer. Mitokondrierne, kan som stedet for keton organ produktion og anvendelse, spille en nøglerolle i ketosis i malkekøer3. Manglende mitokondrier eller mitokondriel dysfunktion vil påvirke brændstof tilgængelighed til periferien og afspejles i ændringer i forbrug af ilt eller RCR.
Mitokondrie ilt forbrug ændringer som reaktion på betændelse. Syv dage gamle slagtekyllinger blev tilfældigt tildelt en gruppe, der er inficeret med Eimeria maxima og en kontrol gruppe4. Slagtekyllinger, der ikke undergår coccidiose udfordring havde lavere forbrug af ilt på grund af proton lækage og højere RCR med angivelse af at leveren mitokondrier reagere på en immun udfordring ved stigende proton lækage. Mens proton lækage og reaktive ilt arter produktion blev engang betragtet som et tegn på mitokondrielle membran dysfunktion og skadelig for energiske effektivitet, nu det er kendt at det er vigtigt for import af proteiner og calcium til mitokondrier5 , og for generation af varme1.
Elektron lækage fra respiratorisk kæden gør mitokondrier modtagelige for reaktive ilt arter produktion og oxidative skader til mitokondrielle Membranproteiner, lipider og mitokondrie-DNA. Som mitokondrier alder, skaden kan ophobes især til mtDNA forårsager yderligere dysfunktion i mitokondrie stofskifte6 og større modtagelighed af koen til sygdom. I praksis, er mange dyr dyr fodret høje niveauer af kosttilskud såsom Cu, Zn og Mn at øge antioxidant funktion. Men fodring høje niveauer af Cu, Zn og Mn faldt mælkeproduktion og øget iltforbrug på grund af proton lækage (State 4 respiration)7.
Tidligere forskning på rollen mitokondriel funktion i energieffektivitet i kvæg har fokuseret på ændringer i mitokondrie iltforbrug og proton lækage. Meget få undersøgelser er blevet offentliggjort i malkekvæg og de fleste papirer sammenligne produktionseffektivitet i form af resterende foderoptagelse (RFI) til mitokondrie-funktion kødkvæg. Variation i mitokondrie respiration satser blev undersøgt ved måling tilstand 3, stat 4 og RCR i lever fra både ammende Holstein køer og ammende oksekød køer (Angus og Hereford, Brangus)8. Forskerne fandt ikke nogen korrelation i mitokondrie respiration med vækst eller malkning træk for kødkvæg men rapport en korrelation mellem mitokondriel respiration og malkning træk for Holstein. I to undersøgelser, blev RFI sammenlignet i kødkvæg til mitokondrie respiration satser (tilstand 3, stat 4 og RCR) i muskel mitokondrier9,10. Mitokondrie respiration satser ændret svar på DMI og lave priser var forbundet med mindre effektive oksekød stude. I en anden undersøgelse, RFI af stude fra højt eller lavt RFI tyre blev sammenlignet med mitokondrie respiration satser og proton lækage kinetik mellem de to grupper af afkom11. Forskellene skyldtes gevinst bekræfter den konklusion, at få gør ikke virkning mitokondrie respiration i kødkvæg.
I dette papir, et eksperiment undersøger leveren RCR svar på fodring 3 antioxidant mineraler til ammende malkekvæg illustrerer brugen af metoder til at måle iltforbruget under State 4 og 3 respiration og PMF.
Det mest kritiske punkt i protokollen at opnå en repræsentativ lever vævsprøve og begynder isolering af mitokondrier hurtigst muligt efter biopsi. Variation i respiration målinger er lavt (tabel 1) på grund af en kort transporttid fra ko til laboratorium. For at reducere transporttiden, en lille laboratorium blev oprettet i office af mejeriet, og leveren prøver blev kørt til office laboratorium, som hver blev indsamlet, således at mitokondrier var isoleret inden for 10 min af biopsi. Opsætning …
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af Alltech og USDA Hatch midler gennem Center for Food Animal Health ved UC Davis School of Veterinary Medicine.
Liver Biopsy | |||
Equipment | |||
Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
Suture | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
Suture needles | NA | NA | Included with Suture |
Scalpels | Sigma – Aldrich | S2896 / S2646 | # for handle and blades |
Surgery towels | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
Falcon tubes 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Tweezers | Sigma – Aldrich | Z168750 | |
50 mL syringes | Fisher Scientific | 22-314387 | |
Injection needles (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
Cow halter | Tractor Supply Co. | 101966599 | |
Cotton swabbing | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
cotton gauze squares (4×4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
Medical scissors | Sigma – Aldrich | Z265969 | |
Chemicals | |||
Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow | Provided by Veterinarian | ||
Clostridia Vaccine | Provided by Veterinarian | ||
Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days | Provided by Veterinarian | ||
Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
Ethanol 70% | Sigma – Aldrich | 793213 | |
Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight | Provided by Veterinarian | ||
2% lidocaine HCl (10-15 mL) | Provided by Veterinarian | ||
1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine | Provided by Veterinarian | ||
Isolation of Mitochondria (liver) | |||
Equipment | |||
Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
Homogenizer Motor | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
Homogenizer Probe | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
Auto Pipette (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
Beaker (500 mL) with ice | Fisher Scientific | FB100600 | |
Refrigerated microfuge | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
Microfuge tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
Chemicals | |||
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) | abcam | ab102536 | |
Sucrose | Sigma – Aldrich | S7903-1KG | |
Tris-HCl | Sigma – Aldrich | T1503-1KG | |
EDTA | Sigma – Aldrich | EDS-1KG | |
BSA (fatty acid free) | Sigma – Aldrich | A7030-50G | |
Mannitol | Sigma – Aldrich | M4125-1KG | |
Deionized water | Sigma – Aldrich | 38796 | |
Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA, pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator | |||
Mitochondrial Oxygen Comsuption | |||
Equipment | |||
Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
Thermoregulated Water Pump | ADInstruments | MLE2001 | |
Clark type Oxygen electrode | NA | NA | |
Autopipette (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Included with Oxy1 |
Small magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
Micropipette (10 μL) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
pH meter | VWR | ||
Chemicals | |||
KCl | Sigma – Aldrich | P9333-1KG | |
Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
KH2PO4 | Sigma – Aldrich | P5655-1KG | |
MgCl2 | Sigma – Aldrich | M1028-100ML | |
EGTA | Sigma – Aldrich | E3889-100G | |
Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
Rotenone (4 mM solution) | Sigma – Aldrich | R8875-5G | |
Succinate (1 M solution) | Sigma – Aldrich | S3674-250G | |
ADP (100 mM solution) | Sigma – Aldrich | A5285-1G | |
Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) | Sigma – Aldrich | 75351 | |
FCCP | Sigma – Aldrich | C2920 | |
Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force | |||
Equipment | |||
TPMP electrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs | |||
Malonate (0.1 mM solution) | Sigma – Aldrich | M1296 | |
Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | 75351 | |
Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | N7143 | |
FCCP | Sigma – Aldrich | C3920 | |
TPMP | Sigma – Aldrich | T200 | |
TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA |