Her deler vi metoder for måling mitokondrie oksygenforbruk, en definere begrepet kosttilskudd energi, og proton lekkasje, den primære årsaken til ineffektivitet i mitokondrie generasjon av ATP. Disse resultatene kan utgjør 30% av energien går tapt i næringsstoffer utnyttelse til å vurdere mitokondrie funksjon.
Oksygenforbruk, proton motiv kraft (PMF) og proton lekkasjen er målinger av mitokondrie åndedrett, eller hvor godt mitokondrier er kjøpedyktig konvertere NADH og FADH i ATP. Siden mitochondria er også det primære området for bruk av oksygen og næringsstoffer oksidasjon karbondioksid og vann, hvor effektivt de bruker oksygen og produsere ATP direkte gjelder effektiviteten av metabolisme til næringsstoff, næringsinnhold krav for dyret, og helse av dyret. Formålet med denne metoden er å undersøke mitokondrie åndedrett, som kan brukes til å undersøke virkningene av ulike, dietter og miljømessige effekter på mitokondrie metabolismen. Resultatene omfatter oksygenforbruk målt som proton avhengige åndedrett (staten 3) og proton lekkasje avhengige respirasjon (staten 4). Forholdet mellom staten 3 / stat 4 åndedrett defineres som åndedretts kontroll forhold (RCR) og kan representere mitokondrie energisk effektivitet. Mitokondrielt proton lekkasjen er en prosess der spredning av mitokondrie membran potensial (MMP) ved uncoupling oxidative fosforylering fra ADP redusere effektiviteten av ATP syntese. Oksygen og TRMP + følsom elektroder med mitokondrie underlag og elektronet transport kjeden hemmere brukes til å måle staten 3 og staten 4 åndedrett, mitokondrie membran PMF (eller potensial til å produsere ATP) og proton lekkasje. Begrensningene til denne metoden er at leveren vev må være så frisk som mulig og alle biopsier og analyser må utføres i mindre enn 10 h. Dette begrenser antall eksempler som kan samles inn og behandles av en enkelt person i dag å ca 5. Imidlertid er bare 1 g av leveren vev nødvendig, så store dyr, for eksempel melkeku, mengden sample nødvendig er liten i forhold til leveren størrelse og det er lite utvinning tid nødvendig.
Mitokondrier er svært følsom for stress og mobilnettet miljøet kan bidra til en rekke metabolske sykdommer. Oksygenforbruk og proton lekkasje i mitokondrier er indikatorer mitokondrier helse. Metodene som er beskrevet i dette papir estimat mitokondrie energieffektiviteten med RCR basert på oksygenforbruk med og uten proton lekkasje. Disse resultatene kan utgjør 30% av energien går tapt i næringsstoffer utnyttelse1. Endringer i oksygen forbruk og proton lekkasjen kan identifisere mitokondrie dysfunksjon som bidrar til metabolsk sykdom og resulterer i redusert energieffektivitet. Disse metodene kan også brukes til å undersøke effekten av ulike behandlinger på mitokondrie åndedrett. Det overordnede målet med måle mitokondrie oksygenforbruk og proton lekkasje kinetics er å vurdere mitokondrie funksjon og energisk effektivitet.
Hepatic mitokondrie dysfunksjon er tilknyttet flere sykdommer i melkeku. Muligheten av cellenes stoffskifte å bytte mellom karbohydrater og lipid brensel Når møtt med en energi underskudd i tidlig amming er påvirket av antall og funksjon av mitokondrier i celle2. Feil i mitokondrier evnen til å tilpasse seg en økt etterspørsel etter energi og økt β-oksidasjon kan føre til opphopning av intracellulær lipid assosiert med insulinresistens og kan føre til dannelse av fettlever i tidlig amming mjølkekyr. Mitochondria, kan som stedet for keton kroppen produksjon og bruk, spille en nøkkelrolle i ketosis i mjølkekyr3. Manglende mitokondrier eller mitokondrie dysfunksjon vil påvirke drivstoff tilgjengelighet til periferien og gjenspeiles endringer i oksygenforbruk eller RCR.
Mitokondrielt oksygen forbruk endringer i respons til betennelse. Syv dager gamle slaktekylling ble randomisert til en gruppe infisert med Eimeria maxima og en kontroll gruppe4. Slaktekylling som ikke gjennomførte coccidiosis utfordring hadde lavere oksygenforbruk proton lekkasje og høyere RCR indikerer at leveren mitokondrier svare på en immun utfordring ved økende proton lekkasje. Mens proton lekkasje og reaktive oksygen arter produksjon ble en gang betraktet som et tegn på mitokondrie membran dysfunksjon og skadelig for energisk effektivitet, nå det er kjent at det er viktig for import av proteiner og kalsium i mitokondrier5 , og for generering av varme1.
Elektron lekkasje fra åndedretts kjeden gjør mitochondria reaktive oksygen arter produksjon og oksidative skader mitokondrie membran proteiner, lipider og Mitokondrielt DNA. Som mitokondrier alder, skade kan akkumulere spesielt til mtDNA forårsaker ytterligere dysfunksjon i mitokondrie metabolisme6 og større mottakelighet av kua sykdommen. I praksis fôres mange husdyr dyr høye nivåer av kosttilskudd som Cu, Zn og Mn å øke antioksidant-funksjonen. Men fôring høye nivåer av Cu, Zn og Mn redusert melk produksjon og økte oksygenopptak på grunn av proton lekkasje (staten 4 åndedrett)7.
Tidligere forskning rollen mitokondrie funksjon i energieffektiviteten i storfe har fokusert på endringer i mitokondrie oksygenforbruk og proton lekkasje. Svært få studier har blitt publisert i melkeku og de fleste avisene sammenligne effektivitet i form av gjenværende fôrinntak (RFI) mitokondrie funksjonen i storfe. Variasjon i mitokondrie åndedrett priser ble undersøkt av måle staten 3, staten 4 og RCR i lever fra både ammende Holstein kyr og ammende storfekjøtt kyr (Angus, Brangus og Hereford)8. Forskerne fant ikke noen sammenheng i mitokondrie åndedrett med vekst eller melking trekk for storfe, men rapporterte en sammenheng mellom mitokondrie åndedrett og melking trekk for Holsteins. I to studier, ble RFI sammenlignet i storfe til mitokondrie åndedrett priser (staten 3, staten 4 og RCR) i muskel mitokondrier9,10. Mitokondrielt åndedrett tallene endret svar DMI og lave priser var assosiert med mindre effektiv biff styrer. I en annen studie, RFI av styrer fra høyt eller lavt RFI okser ble sammenlignet med mitokondrie åndedrett priser og proton lekkasje kinetics mellom de to gruppene av avkom11. Det skyldtes forskjeller under vinning bekrefter konklusjonen at få gjør ikke effekten mitokondrie åndedrett i storfe.
I dette papiret, et eksperiment for å undersøke leveren RCR svar på fôring 3 antioksidant mineraler til ammende melkeku illustrerer bruken av metoder for å måle oksygenopptak ved 4 og 3 åndedrett og PMF.
Det mest kritiske punktet i protokollen er å få en representant leveren Vevsprøve og begynner isolering av mitokondrier så snart som mulig etter biopsi. Variasjon i åndedrett målinger er lav (tabell 1) på grunn av en kort tid fra kua til laboratoriet. For å redusere transporttid, lite laboratorium ble satt opp på kontoret til meieriet, og lever prøver ble kjørt til office laboratoriet som hver ble samlet inn slik at mitokondrier ble isolert i 10 min av biopsi. Oppsett og testing av åndedrett …
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av Alltech og USDA Luke midler gjennom Center for mat dyr sunnhet på UC Davis skolen av Veterinary-medisin.
Liver Biopsy | |||
Equipment | |||
Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
Suture | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
Suture needles | NA | NA | Included with Suture |
Scalpels | Sigma – Aldrich | S2896 / S2646 | # for handle and blades |
Surgery towels | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
Falcon tubes 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Tweezers | Sigma – Aldrich | Z168750 | |
50 mL syringes | Fisher Scientific | 22-314387 | |
Injection needles (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
Cow halter | Tractor Supply Co. | 101966599 | |
Cotton swabbing | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
cotton gauze squares (4×4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
Medical scissors | Sigma – Aldrich | Z265969 | |
Chemicals | |||
Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow | Provided by Veterinarian | ||
Clostridia Vaccine | Provided by Veterinarian | ||
Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days | Provided by Veterinarian | ||
Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
Ethanol 70% | Sigma – Aldrich | 793213 | |
Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight | Provided by Veterinarian | ||
2% lidocaine HCl (10-15 mL) | Provided by Veterinarian | ||
1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine | Provided by Veterinarian | ||
Isolation of Mitochondria (liver) | |||
Equipment | |||
Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
Homogenizer Motor | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
Homogenizer Probe | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
Auto Pipette (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
Beaker (500 mL) with ice | Fisher Scientific | FB100600 | |
Refrigerated microfuge | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
Microfuge tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
Chemicals | |||
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) | abcam | ab102536 | |
Sucrose | Sigma – Aldrich | S7903-1KG | |
Tris-HCl | Sigma – Aldrich | T1503-1KG | |
EDTA | Sigma – Aldrich | EDS-1KG | |
BSA (fatty acid free) | Sigma – Aldrich | A7030-50G | |
Mannitol | Sigma – Aldrich | M4125-1KG | |
Deionized water | Sigma – Aldrich | 38796 | |
Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA, pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator | |||
Mitochondrial Oxygen Comsuption | |||
Equipment | |||
Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
Thermoregulated Water Pump | ADInstruments | MLE2001 | |
Clark type Oxygen electrode | NA | NA | |
Autopipette (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Included with Oxy1 |
Small magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
Micropipette (10 μL) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
pH meter | VWR | ||
Chemicals | |||
KCl | Sigma – Aldrich | P9333-1KG | |
Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
KH2PO4 | Sigma – Aldrich | P5655-1KG | |
MgCl2 | Sigma – Aldrich | M1028-100ML | |
EGTA | Sigma – Aldrich | E3889-100G | |
Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
Rotenone (4 mM solution) | Sigma – Aldrich | R8875-5G | |
Succinate (1 M solution) | Sigma – Aldrich | S3674-250G | |
ADP (100 mM solution) | Sigma – Aldrich | A5285-1G | |
Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) | Sigma – Aldrich | 75351 | |
FCCP | Sigma – Aldrich | C2920 | |
Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force | |||
Equipment | |||
TPMP electrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs | |||
Malonate (0.1 mM solution) | Sigma – Aldrich | M1296 | |
Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | 75351 | |
Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | N7143 | |
FCCP | Sigma – Aldrich | C3920 | |
TPMP | Sigma – Aldrich | T200 | |
TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA |