Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Mätning av levern mitokondriell syreförbrukning och Proton läcka kinetik för att uppskatta mitokondriell Respiration i Holstein mjölkkor

doi: 10.3791/58387 Published: November 30, 2018

Summary

Här delar vi metoder för att mäta mitokondriell syreförbrukning, en definiera begreppet näringsmässiga Energetik och proton läcka, den primära orsaken till ineffektivitet i mitokondriell generation av ATP. Dessa resultat kan står för 30% av den energi som förlorade näringsämnen utnyttjande för att utvärdera mitokondriefunktion.

Abstract

Syreförbrukning, proton motiv kraft (PMF) och proton läcka är mätningar av mitokondriell andning, eller hur väl mitokondrierna är konvertera NADH och Forslund till ATP. Eftersom mitokondrierna är också den primära platsen för syre och näringsämnen oxidation till koldioxid och vatten, hur effektivt de använder syre och producera ATP direkt avser effektiviteten av näringsämnen metabolism, näringsbehov av djur, och hälsa av djuret. Syftet med denna metod är att undersöka mitokondriell respiration, som kan användas för att undersöka effekterna av olika droger, kost och miljöeffekter på mitokondriell metabolism. Resultaten omfattar syreförbrukning mätt som proton beroende respiration (staten 3) och proton läcka beroende respiration (State 4). Förhållandet mellan staten 3 / statliga 4 respiration definieras som respiratorisk kontroll baserat (RCR) och kan representera mitokondriell driftig effektivitet. Mitokondriell proton läcka är en process som gör försvinnande av mitokondriella membranpotential (MMP) av uncoupling oxidativ fosforylering från ADP minskar effektiviteten i ATP-syntes. Syre och TRMP + känsliga elektroder med mitokondriell substrat och elektrontransport kedja-hämmare används för att mäta staten 3 och State 4 respiration, mitokondriella membranet PMF (eller potential att producera ATP) och proton läcka. Begränsningar av denna metod är att levern vävnad måste vara så färsk som möjligt och alla biopsier och analyser måste utföras i mindre än 10 h. Detta begränsar antalet prover som kan samlas in och bearbetas av en enda person i en dag till ca 5. Dock behövs bara 1 g av levervävnad, så stora djur, såsom mjölkboskap av provet behövs är liten i förhållande till leverns storlek och det finns lite tid för återhämtning behövs.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mitokondrierna är mycket känsliga för stress och deras cellulära miljön kan bidra till en mängd olika metabola sjukdomar. Syreförbrukning och proton läcka i mitokondrierna är indikatorer på mitokondrierna hälsa. De metoder som beskrivs i detta papper uppskattning mitokondriell energieffektivitet med RCR baserat på syreförbrukningen med och utan proton läcka. Dessa resultat kan står för 30% av den energi som förlorade i näringsämnen utnyttjande1. Förändringar i syre förbrukning och proton läcka kan identifiera mitokondriell dysfunktion vilket bidrar till metabola sjukdomar och resulterar i minskad energieffektivitet. Dessa metoder kan också användas för att undersöka effekten av olika behandlingar på mitokondriell respiration. Det övergripande målet för mätning av mitokondriell syreförbrukning och proton läcka kinetik är att bedöma mitokondriefunktion och driftig effektivitet.

Nedsatt mitokondriell dysfunktion har förknippats med flera sjukdomar hos mjölkkor. Cellulär metabolism förmåga att växla mellan kolhydrater och lipider bränslen inför ett energi underskott i tidig laktation påverkas av antal och funktion av mitokondrier i cell2. Defekter i mitokondrierna förmåga att anpassa sig till en ökad efterfrågan på energi och ökad β-oxidation kan leda till ansamling av intracellulära lipid associerade med insulinresistens och kan leda till bildandet av fettlever i tidig laktation mjölkkor. Mitokondrierna, kan som platsen för keton kroppen produktion och användning, spela en nyckelroll i ketos i mjölkkor3. Brist på mitokondrier eller mitokondriell dysfunktion påverkar bränsle tillgänglighet till periferin och återspeglas i förändringar i syreförbrukning eller RCR.

Mitokondriell syre förbrukning förändringar i svar på inflammation. Sju-dagsgamla slaktkycklingar lottades till en grupp som angripits av Eimeria maxima och en kontroll grupp4. Slaktkycklingar som inte genomgick koccidios utmaning hade lägre syreförbrukning på grund av proton läcka och högre RCR som anger att levern mitokondrier bemöta en immun utmaning av ökande proton läcka. Samtidigt proton läcka och reaktiva syre arter produktion ansågs en gång vara ett tecken på mitokondriella membranet dysfunktion och skadligt för energieffektivisering, nu det är känt att det är viktigt för import av proteiner och kalcium till mitokondrierna5 , och för generering av värme1.

Electron läcka från luftvägarna kedjan gör mitokondrier mottagliga för reaktivt syre arter produktion och oxidativ skada mitokondriella membranet proteiner, lipider och mitokondrie-DNA. Eftersom mitokondrierna ålder, skador kan ackumuleras särskilt till mtDNA orsakar ytterligare dysfunktion i mitokondriell metabolism6 och större känslighet av ko för sjukdom. I praktiken utfodras många djur djur höga nivåer av kosttillskott såsom Cu, Zn och Mn att öka antioxidant funktion. Dock utfodring höga nivåer av Cu, Zn och Mn minskade mjölkproduktion och ökad syreförbrukning på grund av proton läcka (State 4 respiration)7.

Tidigare forskning om rollen av mitokondriefunktion energieffektiviteten hos nötkreatur har fokuserat på förändringar i mitokondriell syreförbrukning och proton läcka. Mycket få studier har publicerats i mjölkkor och de flesta papper jämföra produktionseffektivitet i form av kvarstående foderintag (RFI) till mitokondriell funktion i köttdjur. Variabilitet i mitokondriell respiration priser undersöktes genom att mäta tillstånd 3, staten 4 och RCR i lever från både lakterande Holstein kor och digivande nötkött kor (Angus, Brangus och Hereford)8. Forskarna fann inte någon korrelation i mitokondriell andning med tillväxt eller mjölkning drag för köttdjur men gjorde rapportera en korrelation mellan mitokondriell respiration och mjölkning drag för holsteinska. I två studier jämfördes RFI i köttdjur till mitokondriell respiration klassar (staten 3, staten 4 och RCR) i muskler mitokondrier9,10. Mitokondriell respiration priser ändras som svar på DMI och låga priser var förknippade med mindre effektiva nötkött stutar. En annan studie jämfördes RFI stutar från hög eller låg RFI tjurar med mitokondriell respiration priser och proton läcka kinetik mellan de två grupperna av avkomman11. Skillnaderna var på grund av vinst bekräftar slutsatsen att vinna gör inte inverkan mitokondriell andning i köttdjur.

I detta papper, ett experiment att undersöka levern RCR svar till utfodring 3 antioxidanter mineraler till lakterande mjölkkor illustrerar användningen av metoder för att mäta syreförbrukning vid 4 och 3 respiration och PMF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla metoder, protokoll och studier beskrivs här godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av University of California, Davis.

1. att erhålla en leverbiopsi från en Holstein mjölkko

Obs: En leverbiopsi bör utföras av en legitimerad veterinär. Leverbiopsier kan utföras på webbplatsen mejeri där korna är belägna. Lakterande mjölkkor kan fortsätta att mjölkas normalt och mjölk behöver inte dras från livsmedelsförsörjningen före eller efter ingreppet. Det rekommenderas att minst 4 personer krävs för att utföra den levern biopsin på en mjölkko: en veterinär att utföra biopsi, en djurhanterare stå på kons hip att skydda biopsi område och veterinär, en laboratorietekniker på utsidan av pennan till uppringningsnätverk er verktyg, material och biopsi prov till och från veterinären och upprätthålla rena området, som kan vara på baksidan av ett fordon (figur 1), och en tekniker för att hämta lever provet och påbörja mitokondriell isolering.

  1. En månad före leverbiopsier, korna ge en clostridia vaccination. Skapa kirurgiska förpackningar genom autoklavering kirurgiska handdukar, biopsi instrument, skalpell innehavare och kirurgisk utrustning.
  2. En dag innan leverbiopsi, injicera kon Ceftiofur hydroklorid 0,044 mL/kg kroppsvikt subkutant i nacken. Övervaka Ko temperatur, intag och fekal noter att använda som en baslinje för normal funktion.
  3. Skapa mitokondrier isolering media (MIM) containining 220 mM mannitol, 70 mM sackaros, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA och 0,1% (w/v) fettsyra gratis BSA, pH 7,4 vid 4 ° C. Ungefär 30 mL per prov kommer att behövas.
  4. Hindra Ko fysiskt utnyttja en headlock med en grimma som behövs (figur 2). Med hjälp av grimman, knyt hennes huvud till vänster sida av stolpen. Om det behövs en kemisk återhållsamhet (xylazin hydrochloride 100 mg/mL IV på 0,010-0,015 mg/kg kroppsvikt) kan användas.
  5. Området av biopsin finns på den högra 10 - 11: e interkostalrummet (figur 3). Rita en rak linje från de högra tuber coxae till peka av höger axel. Den biopsi webbplatsen är där denna linje skär med den 10-11: e interkostalrummet. Sterilisera området av Ko vara biopsier av rakning en 10 cm kvadrat område (figur 4). Tvätta området med 10% providone scrub (figur 5) med en cirkelrörelse. Spray område med 70% etanol lösningen (figur 6). Upprepa providone och etanol tvättar.
    Obs: Levern är ett något annorlunda läge i Holstein mjölkkor jämfört med köttdjur.
  6. Injicera 2% lidokain HCl (10-15 mL) lokalt till området för att ge anestesi av huden och underliggande muskler och bindväv (figur 7). Upprepa providone och 70% etanol tvättar.
    Obs: Nervändarna i huden och muskler, men inte inre organ, så att endast en lokal anesthestic behövs. Kon ska mest bara känna viss press och ingen smärta under förfarandet för biopsi.
  7. Gör en 1-2 cm knivhugg-snitt genom huden på den 10-11 interkostalrummet (figur 8). Passerar en Schackelford-Courtney nötkreatur leverbiopsi instrument genom huden och direkt biopsi instrumentet i en liten kranial riktning samtidigt som man fortsätter genom membranet och in i levern (figur 9, Bild 10). Få en 1 g prov i levern och ta bort instrumentet (figur 11). Nära huden med sutur placering (figur 12).
  8. Placera lever prov i en konisk slang med tillräckligt MIM att täcka prov, på is för omedelbar mitokondrier isolering
  9. Kontrollera snitt för någon rodnad, svullnad, värme, eller smärta inom 24 timmar efter biopsi och injicera kon med Ceftiofur hydroklorid 0,044 mL/kg kroppsvikt subkutant i nacken en gång per dag för de kommande 3 dagarna (figur 13). Övervaka kons temperatur, intag och fekal poäng dagligen under 1 vecka efter leverbiopsi. Om feber utvecklar, fortsätta antibiotika av veterinären.
    Obs: Om en ko uppvisar tecken på smärta, till exempel sparka på det snitt webbplats, recumbancy, rodnad, värme eller reaktion till touch inom 1 h efter levern biopsi, kan en 1 mg/kg kroppsvikt IV injektion av flunixin meglumin användas för att lindra smärta och inflammation. En andra injektion kan administreras vid behov.
  10. Ta bort suturer 7 dagar efter biopsi.

2. isolera mitokondrier från mjölkko lever

  1. Så snart som möjligt efter lever provet tas bort från kon, tvätta levern provet i MIM (steg 1.3) att ta bort röda blodkroppar och fint finhacka provet med sax. Levern bör vara malet i en kyld bägare som innehåller tillräckligt isolering media för att hålla vävnaden fuktig.
  2. Placera den malda levern i en 30 mL injektionsflaska av glas med en teflon mortelstöt av 0,16 mm clearance inkuberas i is och som innehåller MIM (1:4 w/v).
  3. Homogenisera lever prov i teflon mortel på 500 rpm för en min med 4 slag/min.
    Obs: Levern Homogenatet hålls i en is-packade bägare i MIM under hela processen, och alla följande centrifugering steg har slutförts vid 4 ° C
  4. Centrifugera Homogenatet vid 500 x g i 10 min, kassera pellet, överför supernatanten till ett kylt centrifugrör och sedan Centrifugera resulterande supernatanten vid 10 000 x g i 10 min att få mitokondriell pelleten.
  5. Återsuspendera och tvätta pelleten i 10 mL av MIM med fettsyra gratis BSA och centrifugera vid 8100 x g i 10 min. Kassera supernatanten.
  6. Återsuspendera och tvätta pelleten i 10 mL av MIM utan fettsyra gratis BSA och centrifugera vid 8100 x g i 10 min. Kassera supernatanten.
  7. Centrifugerade i 200 µL isolering media och placera på is tills används för syreförbrukning och proton läcka kinetiska analyser.
  8. Bestämma proteinkoncentration av pellet upphängning (1/100 utspädning) med Bicinchoninic syra (BCA) kit per tillverkarens protokollet med BSA som standard. Allt protein anses vara mitokondriell protein.

3. mätning av mitokondriell syreförbrukning (staten 3 och statliga 4)

  1. Skapa syre förbrukning media (OCM) från 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes och 1 mM EGTA, pH 7,4 vid 30 ° C med 0,3% avfettade BSA. Ca 3 mL per prov kommer att behövas. Även bereda en lösning av 8 μg/mL oligomycin i etanol.
  2. Inkubera OCM vid 30 ° C. Ställa in andning kammare, pump och syre elektroden enligt tillverkarens anvisningar (oxygraph system). Oxygraph programvaran bör redan vara installerat på datorn.
  3. Placera 1 mL OCM in i andning kammaren och rör kraftigt. Detta kommer att hjälpa till att försäkra att lösningen blir mättad med luft.
  4. Lägga till 0,35 mg protein av mitokondriell protein till respiration kammaren och bibehålla temperaturen vid 30 ° C.
  5. Spela in syreförbrukning under cirka 5 minuter. Oxygraph system records syrekoncentrationen så som andning ökar, syrehalten minskar. När syreförbrukning blir konstant (en minskande rak linje), rekord syreförbrukning (lutning = koncentration av syre/tid). Detta är baslinjen syreförbrukning.
  6. Lägg till 1,25 µL 4 mM Rotenon lösning att hämma komplex jag och sedan Tillsätt 5 µL 1 M succinat lösning att nå en slutlig koncentration i luftvägarna kammaren 5 mM succinat. Detta är staten 4 respiration.
  7. Tillsätt 1 µL av 100 mM ADP lösning till en slutlig koncentration i andning kammaren 100 μm. Syrehalten minskar (ökad respiration) och sedan efter cirka 5 min blir en rak linje. Spela in syreförbrukning (lutning = koncentration av syre/tid). Detta är staten 3 andning.
  8. Valfritt: I slutet av körningen, lägga till FCCP (0,2 μM totala volym) för att inducera maximal andning. Registrera andning i ca 5 min (ca). När syreförbrukning blir konstant, rekord syreförbrukning. Detta är maximal syreförbrukning.
  9. Beräkna respiratorisk kontroll baserat (RCR) med hjälp av ekvation staten 3 syreförbrukning / stat 4 syreförbrukning.
  10. Sug upp alla lösningarna av respiration kammaren. Skölj kammaren flera gånger med dubbel avjoniserat vatten.

4. att mäta mitokondriella membranet Potential (MMP) och Proton drivkraft (PMF)

  1. Bered av 80 ng/mL nigericin i etanol.
    Obs: Dessa kemikalier är löst i etanol, och alla ansträngningar bör göras för att begränsa mängden etanol som läggs till mindre än 1 μL, eftersom etanol kan uncouple elektronen transportsystemet och orsaka mitchondrial dysfunktion.
  2. Efter noggrant sköljer kammaren med dubbel avjoniserat vatten, placera 1 mL av OCM in i andning kammaren och rör kraftigt med en magnetisk uppståndelse bar. Detta kommer att hjälpa till att försäkra att lösningen blir mättad med luft. Lägg till metyl-trifenyl-phosphonium (TPMP +) känslig elektrod för att avdelningen setup. TPMP + elektrod ska anslutas till en pH-mätare och värden läses från pH-mätaren.
  3. Lägga till 0,35 mg av mitokondriell protein respiration kammaren.
  4. Tillsätt 1,25 µL av 4 mM Rotenon lösning att hämma komplexa I. posten respiration för 2-5 min (ca). När syreförbrukning blir konstant, rekord syreförbrukning.
  5. Tillsätt 0.56 μL 8 μg/mL oligomycin lösning för en slutlig koncentration på 2,8 µg oligomycin /0.35 mg av mitokondriell protein som hämmar ADP utnyttjande. Registrera andning för 2-5 min (ca). När syreförbrukning blir konstant, rekord syreförbrukning.
  6. Lägg till 0,112 μL 80 ng/mL nigericin lösning för att avskaffa pH gradient över det mitokondriella inre membranet. Registrera andning för 2-5 min (ca). När syreförbrukning blir konstant, rekord syreförbrukning.
    Obs: Rotenon och oligomycin används för att blockera elektrontransport kedja på komplex jag och ATP-syntas, respektive. Nigericin läggs till konvertera transmembrana H + gradient till en K +-toning som kan mätas med en elektrod.
  7. Förbereda en standardkurva för TPMP + genom att lägga till 5 µL 10 mM TPMP + lösningen mitokondriell ruvning. Upprepa detta steg fyra gånger tills en total koncentration av 2,5 μM TPMP + har lagts till.
  8. Initiera respiration genom att lägga till 5 μL av 1M succinat till kammaren.
  9. Spela in andning tills du har uppnått en stabil spårning och sedan titrera systemet genom att lägga till malonate. Tillägg av malonate bör vara 0,5 µL 1 µL, 1,5 µL, 3.0 µL, 6,0 µL, 9,0 µL, sedan 12,5 µL av 0,1 mM Malonate lösning för att åstadkomma successiva tillägg av malonate koncentrationer i inkubation kammaren av 0,1, 0,2, 0,3, 0,6, 1.2, 1,8 och 2,5 mM.
  10. Samla in data från de två elektroderna (syre och TPMP+). Data förvärv programvara från oxygraph systemet kan användas för att samla samtidiga mätningar av mitokondriell syreförbrukning och mitokondriella membranpotential och iaktta förändringar syreförbrukning i realtid. Figur 14 visar hur oxygraph systemet registrerar syreförbrukning vartefter experimentet fortskrider.
  11. Beräkna MMP millivolt baserat på Nernst ekvation:
    MMP = 61,5 log ([TPMP +] läggs – externa [TPMP +]) x TPMP+ bindande korrigering / (0.001 x mg protein/ml x [TPMP +])
    En TPMP + bindande korrigering av 0,4 µL/mg för mitokondrie protein-1 används.
    Räkneexempel baserat på koncentrationer i protokollet:
    MMP = 61,5 x log (5 µM – 2 µM) x 0,4 / (0.001 x 0,35 mg mitokondriell protein/mL x 2 µM)
    MMP = 198,9 mV
  12. Uppskattning PMF genom att rita en graf över MMP vs. syreförbrukning (figur 15). PMF redovisas som syreförbrukning på en membranet potential av 165 mV.
    Obs: Titreringen elektron transportkedjan med malonate (0,1 till 2,5 mM) visar kinetiska svaret av proton läcka till MMP. Plottning MMP mot syreförbrukning avgör sedan, proton läcka kinetik. PMF bestäms genom att beräkna syreförbrukningen vid en gemensam membranpotential (165 mV).
  13. I slutet av den senaste körningen av provet, tillsätt FCCP (0,2 μM totala volym) för att inducera maximal andning och släppa TPMP + för Baslinjejustering.
  14. Sug upp alla lösningarna av respiration kammaren. Skölj kammaren flera gånger med dubbel avjoniserat vatten. I slutet av dagen sköljas kammaren också några gånger med etanol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Positiva resultat visar RCR och proton läcka kinetik visas i tabell 1 och figur 15, respektive. I denna studie7, RCR och protein läcka mättes kinetics i Holstein mjölkkor på 70 dagar i mjölk efter kor hade matats 1 av 5 olika nivåer av Cu, Zn och Mn för 28 dagar. Tillstånd 4, maximal proton läcka-beroende respiration, hade en tendens att påverkas av mineral intag av Cu, Mn och Zn (p < 0,1). Tillstånd 3 respiration (maximalt ATP stimuleras andningen) och RCR = staten 3 / State 4 (respiratorisk kontroll ratio) påverkades inte av mineral intag. Tillstånd 4 andning var högst i LowMn och lägst i kontroll, som anger att Mn spelar en viktig roll i att minimera proton läcka beroende respiration. Mangan, genom enzymet superoxiddismutas Mn är känt för att minska reaktiva syreradikaler i matrisen mitokondrie och proton läcka12. Högre State 4 andning var associerat med lägre mjölk och mjölk protein avkastning. Eftersom proton läckan är en viktig del av energieffektiviteten, kunde minska State 4 andning genom Mn tillskott förbättra effektivitet.

Behandlingar1
Hög Med Låg LowMn Kontroll SEM
Mjölk, kg 47,4ab 50,9en 46,0ab 43,6b 49,7en 2,9
Mjölkprotein, kg 1,38ab 1,44en 1.40ab 1,23b 1,43en 0,09
Tillstånd 3 75,8 64,4 78,2 73 64,1 13
Tillstånd 4 26,2ab 22.6ab 25,9ab 27,1en 22,0b 3
RCR 2,89 2,76 2.98 2,65 2,83 0,27
a b Sätt inom en rad som inte följt av samma upphöjd bokstav skiljer sig avsevärt (P < 0,1).
1 hög behandling innehåller högsta nivåer av Cu, Zn och Mn väl över krav13, Med behandling innehåller mellanliggande nivåer av Cu, Zn och Mn ovan krav, låg behandling innehåller lägre halter av Cu, Zn och Mn men fortfarande över krav, låg Mn behandling innehåller de lägsta nivåerna av Mn (och lägre nivåer av Cu, Zn) men fortfarande ovan krav och kontroll behandling innehåller de lägsta nivåerna av Cu, Zn, som ligger nära krav.

Tabell 1: effekten av Cu, Mn och Zn tillskott på levern mitokondriell syre förbrukning och mjölk produktion från mjölkkor på 70 dagar i mjölk. Denna tabell har anpassats från Acetoze et al. 20177.

Mitokondriell proton läcka är en process som avleder MMP genom förflyttning av protoner över det mitokondriella inre membranet utan produktionen av ATP14. Proton läcka kinetik bedöms genom att beräkna andelen syreförbrukning på en gemensam membranet potential av 165 mV. En lägre membranpotential innebär att protoner 'läcker' över mitokondriella membranet, vilket resulterar i lägre ATP-syntes (figur 15). I Holstein Ko studien var nedsatt proton läcka beroende andning störst i LowMn och lägst i kontroll, vilket överensstämmer med resultaten i tabell 1, att staten 4 andning var störst i LowMn och lägst i kontroll.

Figure 15
Figur 15. Proton läcka kinetics i Holstein kor utfodras olika mängder av Cu, Mn och Zn. Detta diagram baseras på data från Acetoze et al. 20177. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Negativa resultat illustreras i tabell 2 och figur 16. Fodereffektivitet (RFI) var högre i Angus stutar född från låg RFI tjurar än hög RFI tjurar, men detta var inte återspeglas i mitokondriell RCR (tabell 2) eller proton läcka kinetik (figur 16). Det fanns inga skillnader i mitokondriell respiration och proton läcka kinetik mellan grupper av stutar men det fanns en skillnad i RFI. Det var också ingen skillnad (p = 0,88) i nedsatt mitokondriell proton läcka i hög och låg RFI stutar (figur 16). Det fanns stora standard fel i samband med mitokondriell respiration mätningar och proton läcka kinetiska kurvor var oförändrad. Lever prover från denna studie erhölls efter stutar slaktades, en process som försenade lever provinsamling och behandling av en timme. Variation i mitokondriell respiration åtgärder kan avspegla mitokondriell respiration nedbrytning på grund av vävnadsdöd. Proton läcka kinetiska linjerna var oförändrad eftersom syre förbrukning mätningar inte började förrän 8 min då platån hade redan uppnåtts på grund av en utrustning fel.

Låg RFI Hög RFI SEM P -värde
(n = 7) (n = 8)
RFI -0,58 -0,01 0,1 0,05
Tillstånd 3 31,3 30,8 9,42 0,9
Tillstånd 4 9,76 10.4 3.23 0,8
RCR 3,05 3.03 0,24 0,93

Tabell 2: prestanda och mitokondrie respiration av höga och låga kvarvarande foder intag (RFI) Angus tjur avkomma. Denna tabell har anpassats från Acetoze et al. 201511.

Figure 16
Figur 16. Proton läcka kinetik för avkomman av hög och låg RFI Angus tjurar. Denna graf har anpassats från Acetoze et al. 201511. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 1
Figur 1: rengöra området för kirurgiska och biopsi material ligger på baksidan av ett fordon och utanför Ko pennan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: återhållsamhet av ko med en grimma bunden till en cross stolpe av huvudet låsa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: området för kon att rengöra för biopsi och läge av biopsi på den höger 10 - 11: e interkostalrummet hittade genom att rita en rak linje från de högra tuber coxae till peka av höger axel. Den biopsi webbplatsen är där denna linje skär med den 10-11: e interkostalrummet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: rakning ett 10 cm område i Ko för att förbereda att sterilisera för biopsi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: tvätta biopsi området av ko med 10% providone scrub med en cirkelrörelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6. Spray biopsi-området med 70% etanol lösningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: injicera 2% lidokain HCl (10-15 mL) lokalt till området för att ge anestesi av huden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: en 1-2 cm knivhugg-snitt genom huden på den 10-11 interkostalrummet infoga biopsi verktyg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: införande av nötkreatur leverbiopsi instrument genom huden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 10
Figur 10: instrumentet biopsi bör riktas i en liten kranial riktning samtidigt som man fortsätter genom membranet och in i levern. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 11
Figur 11: en 1 g prov i levern flyttas från biopsi-instrument till Falconer tube för transport till mitokondriell isolering station. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 12
Figur 12: suturering huden Stäng biopsi snitt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 13
Figur 13: injektion av ko med Ceftiofur hydroklorid 0,044 mL/kg kroppsvikt subkutant i nacken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 14
Figur 14: Oxygraph programvara resultat visar syre förbrukning Svaren till tillägg av varje ämne att mäta mitokondriella membranpotential (MMP) och proton motiv tvinga (PMF). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den mest kritiska punkten i protokollet att få ett representativt levervävnad prov och börjar isoleringen av mitokondrierna så snart som möjligt efter biopsi. Variationen i andning mätningar är låg (tabell 1) på grund av en kort Transporttid från Ko till laboratorium. För att minska transporttiden, ett litet laboratorium inrättades kontoret för mejeriet och lever prover drevs till office laboratoriet som varje samlades så att mitokondrierna isolerades inom 10 min av biopsi. Installation och testning av respiration kammare och elektroder (syre, TPMP +) med pH-mätare används för att registrera skillnader i proton övertoningar dagen innan insamling och bearbetning av prover kan undvika störningar såsom saknas tidiga mätningar i proton läcka kinetik (figur 16).

På grund av behovet av färsk lever prover och snabba isolering av mitokondrier begränsas antalet prover som kan samlas in och bearbetas i en dag. Varje prov tar cirka 5-6 timmar att slutföra; endast cirka 5 prover per dag kan därför samlas in och analyseras per respiration kammare. Detta är inte en hög genomströmning metod; Urvalsstorleken för behandlingar är begränsade och små fel kan öka variationen är associerad med resultat och förmågan att upptäcka betydelse.

Isolering tekniken får utesluta vissa mitokondrier som är associerade med vissa cell komponenter och förbli inbäddade i pelleten eller mindre mitokondrier kan gå förlorad i de pellet tvättarna under centrifugering stegen. Detta kan leda till resultat som inte avspeglar den hela befolkningen av mitokondrier. Mitokondrier kan ändra i storlek och densitet beroende på fysiologiska stater som svält och träning (utbildning)15. Uppskatta mitokondriell nummer med enzymaktivitet som använder citrat syntas16 eller succinat dehydrogenas17 för att bekräfta resultaten kan behövas.

Inga ändringar har gjorts till de ursprungliga teknikerna etablerade i gnagare för mitokondriell isolering18, respiration19 och proton läcka kinetik20. Ändringar av denna teknik kan göras beroende på vilken vävnad källa av mitokondrier och experimentella behandlingar. BSA (avfettats) används för att binda fria fettsyror i vävnad. Om vävnaden har alot av fettsyror (större än 10%) är associerad med den, mer avfettade BSA kan läggas eftersom fria fettsyror kommer att störa de mitokondriella mätningarna.

Mäta mitokondriell syreförbrukning och proton läcka kinetik med denna teknik är det normala förfarandet. Levern har varit vävnaden i val främst eftersom det har en hel del mitokondrier, de är ganska lätta att extrahera och levern är den primära platsen av näringsämnen bearbetning. Ändringar av denna teknik har använts för att mäta syreförbrukning i andra vävnader såsom muskel och mjölkkörtlar. Mitokondriell isolering tekniker måste dock ändras för att passa vävnaden. Exempelvis i muskel, mitokondrierna är inbäddade i muskelfibrerna och så isolering förfarandet måste innefatta en protein matsmältningen och matsmältningen måste kontrolleras för att säkerställa att mitokondriell funktion inte störs.

Det finns andra metoder för att mäta mitokondriell andning som kräver en analysator särskilt utformade för att mäta andning. Cellerna måste skördas från vävnad och fast till inkubation plattor. Analyzer åtgärder hela cellen syre materialåtgången (OCR; basal), ATP länkade OCR (associerad med mitokondrier), nonmitochondrial OCR och maximal OCR. Isolerade mitokondrier mätningar är dock inte möjligt eftersom mitokondrierna hämmas under några av ruvning. Denna metod har använts för att undersöka OCR ändringar med sjukdom och drog interventioner21 hos människor.

Nuvarande och framtida tillämpningar

Bidraget av proton läcka energi krav djuret kan vara stora och vägledande för det fysiologiska tillståndet av djuret inklusive tillväxt, amning och sjukdom. Tidigare har denna teknik använts primärt att undersöka associering av mitokondriell syreförbrukning och bidraget från proton läcka att mata eller driftig effektivitet. Men som vår förståelse för rollen av mitokondrier i metabolism expanderar, vikten av denna teknik kommer också att öka särskilt i kombination med andra mitokondriella åtgärder såsom elektron transportkedjan Enzymaktiviteter, kalcium Dynamics i apoptos och enzym aktiviteter av TCA cykeln.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av Alltech och USDA lucka medel genom centrum för mat djurhälsa vid UC Davis School of Veterinary Medicine.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Liver Biopsy
Equipment
Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument Sontec Instruments Englewood CO 1103-904
Suture Fisher Scientific 19-037-516
Suture needles NA NA Included with Suture
Scalpels Sigma - Aldrich S2896 / S2646 # for handle and blades
Surgery towels Fisher Scientific 50-129-6667
Falcon tubes 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Tweezers Sigma - Aldrich Z168750
50 mL syringes Fisher Scientific 22-314387
Injection needles (22, 2 1/2) VWR MJ8881-200342
Cow halter Tractor Supply Co. 101966599
Cotton swabbing Fisher Scientific 14-959-102
cotton gauze squares (4x4) Fisher Scientific 22-246069
Medical scissors Sigma - Aldrich Z265969
Chemicals
Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow Provided by Veterinarian
Clostridia Vaccine Provided by Veterinarian
Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days Provided by Veterinarian
Providone Scrub Aspen Veteterinary Resources 21260221
Ethanol 70% Sigma - Aldrich 793213
Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight Provided by Veterinarian
2% lidocaine HCl (10-15 mL) Provided by Veterinarian
1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine Provided by Veterinarian
Isolation of Mitochondria (liver)
Equipment
Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance Fisher Scientific 02-911-527
Homogenizer Motor Cole Parmer EW-04369-10
Homogenizer Probe Cole Parmer EW-04468-22
Auto Pipette (10 mL) Cole Parmer SK-21600-74
Beaker (500 mL) with ice Fisher Scientific FB100600
Refrigerated microfuge Fisher Scientific 75-002-441EW3
Microfuge tubes (1.5 mL) Fisher Scientific AM12400
Chemicals
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) abcam ab102536
Sucrose Sigma - Aldrich S7903-1KG
Tris-HCl Sigma - Aldrich T1503-1KG
EDTA Sigma - Aldrich EDS-1KG
BSA (fatty acid free) Sigma - Aldrich A7030-50G
Mannitol Sigma - Aldrich M4125-1KG
Deionized water Sigma - Aldrich 38796
Hepes Sigma - Aldrich H3375-500G
Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,  pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator
Mitochondrial Oxygen Comsuption
Equipment
Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode Hansatech (PP Systems) OXY1
Thermoregulated Water Pump ADInstruments MLE2001
Clark type Oxygen electrode NA NA
Autopipette (1 mL) Cole Parmer SK-21600-70 Included with Oxy1
Small magnetic stir bar Fisher Scientific 14-513-95
Micropipette (10 μL) Cole Parmer SK-21600-60
pH meter VWR
Chemicals
KCl Sigma - Aldrich P9333-1KG
Hepes Sigma - Aldrich H3375-500G
KH2PO4 Sigma - Aldrich P5655-1KG
MgCl2 Sigma - Aldrich M1028-100ML
EGTA Sigma - Aldrich E3889-100G
Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA
Rotenone (4 mM solution) Sigma - Aldrich R8875-5G
Succinate (1 M solution) Sigma - Aldrich S3674-250G
ADP (100 mM solution) Sigma - Aldrich A5285-1G
Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) Sigma - Aldrich 75351
FCCP Sigma - Aldrich C2920
Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force
Equipment
TPMP electrode World Precision Instruments. DRIREF-2
Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs
Malonate (0.1 mM solution) Sigma - Aldrich M1296
Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer Sigma - Aldrich 75351
Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer Sigma - Aldrich N7143
FCCP Sigma - Aldrich C3920
TPMP Sigma - Aldrich T200
TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
  2. Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).
  3. Bartlett, K., Eaton, S. Mitochondrial B oxidation. European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).
  4. Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).
  5. Wallace, D. C., Fan, W. Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics. Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).
  6. Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging. Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).
  7. Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc. Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).
  8. Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle. Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).
  9. Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers. Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).
  10. Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle. Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).
  11. Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls. ISRN Vet Sci. 2015, (194014), (2015).
  12. Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity. Free Radicals in Biology and Medicine. Oxford University Press. Oxford. 186-187 (1989).
  13. National Research Council. Nutrient Requirements of Dairy Cattle. 7th revised edition, National Academy Press. Washington, DC. (2001).
  14. Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging. Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).
  15. Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity: beyond ATP. Nature. 17, 608-620 (2017).
  16. Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. Biochemical assays of respiratory chain complex activity. Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).
  17. Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression. Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).
  18. Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats. British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).
  19. Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice. PloS One. 3, (3), e1759 (2008).
  20. Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction. Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).
  21. Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research. Clinical Science. 127, 367-373 (2014).
Mätning av levern mitokondriell syreförbrukning och Proton läcka kinetik för att uppskatta mitokondriell Respiration i Holstein mjölkkor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rossow, H. A., Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J. Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle. J. Vis. Exp. (141), e58387, doi:10.3791/58387 (2018).More

Rossow, H. A., Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J. Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle. J. Vis. Exp. (141), e58387, doi:10.3791/58387 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter