Vi præsenterer her, en protokol for at undersøge ændringer i angst niveau af gnaver dyremodeller. Den forhøjede plus labyrint (EPM) test, bruges sammen med en video, tracking software, giver en pålidelig metode til at dokumentere effekten af forskellige potentielle angstdæmpende behandlinger i prækliniske laboratorium scenarier.
Det overordnede mål med denne undersøgelse er at beskrive metoden i forhøjet plus labyrint (EPM) test i kombination med en video tracking software. Formålet med metoden er at dokumentere effekten af forskellige potentielle angstdæmpende behandlinger på laboratoriet gnavere modeller. EPM test er baseret på gnavere hang mod beskyttede, lukkede mørke rum og ubetingede frygt for åbne rum og højder og deres medfødte intens motivation til at udforske nye miljøer. EPM-test er en udbredt adfærdsmæssige test for at undersøge de angstdæmpende eller anxiogenic svar af gnavere får lægemidler, der er kendt for at påvirke adfærd. Observation demonstrerer en faldt andelen af tidsforbrug på lukkede arme, en øget andel af tid brugt på åbne arme, en reduceret antallet af poster til lukkede arme og et forhøjet antal poster til åbne arme målt af EPM test kan afspejle nedsat angst niveauer. Brug denne metode, er effekten af eksogene keton kosttilskud på angst-relaterede adfærd testet i Sprague Dawley (SPD) rotter. Eksogene keton kosttilskud er kronisk fodret til rotter for 83 dage eller subchronically og akut mundtligt gavaged, dagligt i 7 dage, før du gennemfører EPM test. Indsamlingen af adfærdsmæssige data udføres ved hjælp af SMART video tracking system af en blindet observatør ved udgangen af behandlingerne. De vigtigste resultater viser, at EPM test er en effektiv metode til at registrere keton supplement-induceret angstdæmpende virkning og kan betragtes som et fintmærkende måleinstrument til at vurdere ændringer i angst adfærd forbundet med stof – eller metaboliske-baserede behandlinger.
Målet med denne artikel er at beskrive metoden af EPM test i kombination med en video tracking software for at overvåge ændringer i angst-relaterede adfærd og roman behandlinger i laboratoriet gnavere modeller. EPM-testen er en forholdsvis enkel adfærdsmæssige vurderingsmetode, som blev udviklet til undersøgelsen af kvantificere angst adfærd niveauer og angst svar af rotter efter anvendelse af medicin behandlinger1. Ja, det er blevet påvist, at EPM test er en meget brugt og effektiv adfærdsmæssige assay for undersøgelse af ændringer i angst niveauer af gnavere1,2. Anvendeligheden af EPM test i gnavere (hovedsagelig rotter og mus) er baseret på deres hang mod lukkede, mørke rum (tilgang), en ubetingede frygt for åbne rum/højder (unddragelse) og deres høje niveau af medfødte motivation til at udforske roman miljøer. Derfor, EPM test er en veletableret metode baseret på en tilgang-undgåelse konflikt2,3.
EPM er et plus-formet apparat bestående af fire forhøjede arme, som er blevet beskrevet af Handley og Mithani4 (figur 1), og består af to modsatte våben, der er åbent til omgivelserne (åbne arme), mens de to lukkede modsatte arme (lukket våben) er udstyret med vægge. Efter behandling, hvis øget tidsforbrug på de åbne arme og/eller et øget antal åbne arm poster i forhold til kontrol (ubehandlet) dyr registreres på EPM, indikerer dette en angstdæmpende virkning2,3. Den mest robuste undgåelse svar er blevet påvist i de første 5 min efter start (placering af rotter i skæringspunktet mellem de fire arme af EPM’EN) af EPM assay5; Derfor, enhver adfærd efter en behandling er almindeligvis registreret i 5 min på EPM’EN. Som supplerende foranstaltninger af en angst niveau, antallet af hoved dips, stejler (lodret stående af gnaver på to bagben), fækal boli, såvel som samlede arm kan poster (spontan motorisk aktivitet) og forskellige arbejdsstillinger (strækker eller frysning), også registreres på EPM2. Således kan flere adfærdsmæssige parametre kompileres for at give en samlet vurdering af angst-relaterede adfærd.
For at øge validiteten af resultaterne, to til tre adfærdsmæssige assays er almindeligt anvendt sammen, såsom lys-mørke valg test, test social interaktion og EPM-test til at måle angst niveauerne af forskellige dyr modeller6. EPM analysen udføres alene på gnavere er også en passende metode til at undersøge den angstdæmpende eller anxiogenic effekt af forskellige lægemidler7. EPM test er følsomme over ikke kun for benzodiazepin-type angstdæmpende midler (fx, diazepam)8, men også blandt andre amino syre, monoamin, peptidergic og nucleosidergic forbindelser (f.eks., N-methyl-D-aspartat (NMDA) antagonist AP7, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA) antagonist CNQX, µ-opioid-receptoren agonist morfin, NPY1 antagonist BIBP3226, substans P, ghrelin, oxytocin, serotonin receptor agonister og antagonister såsom 8-OH-DPAT og Way-100635 og B1-adrenerg antagonist betaxolol)9,10,11,12. EPM analysen på gnavere er derfor en velegnet og følsom metode til at undersøge indflydelsen af forskellige behandlinger, der påvirker hjernen områder involveret i angstdæmpende effekt (fx, amygdala, hippocampus og limbiske områder) og virkningsmekanismer (f.eks., at serotonerge, GABAergic og adenosinergic system) impliceret i angst2. Agenterne testet i disse EPM undersøgelser omfatter eksogene keton kosttilskud, der ændrer hjernen signalering i subtile måder, som kan kræve en følsom metode til at registrere adfærdsændringer.
I denne artikel vil beskrive vi EPM testen anvendes i kombination med en video, tracking software, som hjælper med at fjerne eksperimentelle bias og letter indsamling og analyse af adfærdsmæssige ændringer som reaktion på roman angstdæmpende behandlinger.
Generelt er anvendte flere almindeligt tests, såsom lys-mørke valg test, den sociale interaktion test og EPM-test, der bruges til at måle angst niveau i forskellige dyremodeller. Men EPM analyse alene er en velegnet metode til at undersøge, for eksempel effekten af eksogene keton kosttilskud på gnavere angst niveauer18,20.
Den største fordel ved metoden EPM er, at det er afhængig af gnavere instinktiv hang mod mørke, indelukkede rum, ud over den ubetingede frygt for højder og undgåelse af åbne rum. På den anden side er andre metoder, der anvendes til at studere angst-lignende adfærd baseret på de adfærdsmæssige reaktioner på visse skadelige stimuli, såsom elektrisk stød, mad/vand afsavn, høje lyde, og eksponering for predator lugt3. Disse prøver resultere normalt i en betinget respons, mens EPM også repræsenterer et mere humant alternativ. Derudover EPM’EN kan være et nyttigt redskab til at undersøge inddragelsen af forskellige hjerneregioner (f.eks., limbiske regioner, hippocampus) og de underliggende mekanismer (f.eks., GABA, glutamat, serotonin, adenosin) af angst opførsel2.
Når du anvender behandlinger, der er ganske stressende for dyr (f.eks.den mundtlige sonde), det er vigtigt, at alle dyr håndteres på samme måde og af den samme person, især når vurderingen af potentielle, subtile angstdæmpende virkninger. Hvis det er muligt, kan indførelsen af stof/stof i drikkevand eller via en spiselig ‘behandle’ være en foretrukne metode. For at sikre, at samme beløb gives til hvert dyr, kan en mundtlig sonde anvendes. Baseret på de farmakokinetiske egenskaber af sammensat, er det normalt tilrådeligt at teste dyr på EPM’EN inden for 1 time efter gavaging. Når du vælger eksperimenterende fag, er det vigtigt at overveje deres stamme, sex, estrus cyklus, og alder, samt kropsvægt, overensstemmelse med målene og teste stoffer2. I henseende til alder, når designe EPM undersøgelser og fortolke data, er det vigtigt at overveje, at procentdelen af poster i åbne arm stiger lineært med alder21 og de aldersrelaterede ændringer i EPM adfærd er stamme-specifikke22.
Når der udføres en EPM-test, er der potentielle problemer, der skal løses. Undertiden dyr skal udelades fra analyse på grund af afvigende tendenser (f.eks.dyret aldrig forlader området hvor det var placeret, næsten falder ud i apparatet, er distraheret af en støj eller begivenhed uden for apparatet). Yderligere komplikationer med EPM test kan omfatte behandlinger som forårsager sedation eller hyperaktivitet, fordi disse typer af effekter skal være vurderet via EPM parametre.
Det er vigtigt at udsætte dyr på EPM prøve kun en gang fordi nedsat aktivitet på de åbne arme og en nedsat total tidsforbrug på den centrale platform blev demonstreret på den anden (gentagne) eksponering af gnavere i forhold til den første eksponering på EPM 14,15. En enkelt eksponering af gnavere til EPM test anbefales derfor kraftigt. Men hvis der er mindst tre uger mellem den første og anden eksponering til EPM og EPM set-up er flyttet til et andet rum (forskellige miljø), at dyrene kan blive undersøgt af EPM’EN test flere gange2.
EPM er tilgængelige i forskellige materialer, størrelser (fxmus eller rotte), og farver, der skal overvejes, når du vælger studere fag. Det er vigtigt at huske at lugte efterladt af den tidligere animalsk på apparatet kan ændre funktionsmåden for den efterfølgende dyr. Vi anbefaler derfor, ved hjælp af en EPM lavet af et materiale, der er let at rengøre, såsom akryl glas (ikke gennemsigtige), som ikke bevarer lugte efter vask. Undgå EPM apparater lavet af træ. Helst bruge en mat farve, der afviger fra farven på de dyr, der er testet på EPM (fx, sort, hvis hvide dyr er testet). Jo bedre kontrast mellem dyret og kabinettet, jo bedre påvisning af dyret og jo højere pålidelighed og præcision af resultaterne opnået (tilbagelagte, hastighed, opfølgning). EPM apparater lavet af mat grå materiale er nyttige med hvid, sort, og hvide og sorte dyr.
En yderligere fordel ved video tracking system er, at ud over EPM, det giver en fleksibel og nem måde at sætte det op med en bred vifte af adfærdsmæssige test, såsom vand labyrint, open-felt, plus/radial arm/T-Y labyrinter, sted præference, tvunget svømning , og hale suspension tests.
I Resumé er målet med denne artikel at beskrive EPM testen anvendes i kombination med en video tracking software til at indsamle og analysere adfærdsmæssige ændringer som reaktion på roman angstdæmpende behandlinger. De mulige anvendelser af EPM’EN omfatter prescreening af nyudviklede farmakologiske midler til behandling af angst-relaterede lidelser. Ud over de angstdæmpende og anxiogenic agenter, kan adfærdsmæssige effekten af forskellige hormoner og medicin misbrug også undersøges. Indflydelse af aldring, udsættelse for forskellige stressfaktorer kan også vurderes. Denne undersøgelse har konkluderet, at når der tages passende skridt, brug af EPM har vist sig for at være en følsom metode til vurdering af adfærdsmæssige ændringer forbundet med keton kosttilskud18,20.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en ONR Grant N000141310062 og en GLUT1D Foundation Grant #6143113500 (til Dominic P. D’Agostino), nationale udvikling agenturet af Ungarns (under Grant nr. TIOP-1.3.1.-07/2-2F-2009-2008; til Zsolt Kovács) og af Department of Veterans anliggender (at markere Kindy). Forfatterne vil gerne takke Quest ernæring LLC for at støtte igangværende forskning om dette emne (til Csilla Ari).
Elevated Plus Maze for mice and rats | Coulbourn Instruments | H10-35-EPM | |
SMART Video Tracking Software | Harvard Apparatus | SMART 3.0 |