Här presenterar vi ett protokoll för att undersöka förändringar i ångest av gnagare djurmodeller. Den förhöjda plus labyrint (EPM) test, som används tillsammans med en video som spårning programvara, ger en tillförlitlig metod för att dokumentera effekten av olika potentiella ångestdämpande behandlingar i prekliniska laboratorium scenarier.
Det övergripande målet med denna studie är att beskriva metodiken för högstämt plus labyrint (EPM) test i kombination med en video som spårning programvara. Syftet med metoden är att dokumentera effekten av olika potentiella ångestdämpande behandlingar på laboratoriet gnagare modeller. EPM testet baseras på gnagare benägenhet mot skyddade, slutna mörka utrymmen och ovillkorlig rädsla för öppna platser och höjder och deras medfödda intensiv motivation att utforska nya miljöer. EPM testet är en allmänt använd beteendemässiga test för att undersöka de ångestdämpande eller anxiogenic svar av gnagare får läkemedel som är kända att påverka beteende. Observation som visar en minskad andel av tid som tillbringas på slutna armar, en ökad andel tid som tillbringas på öppna armar, ett minskat antal poster till slutna armar och ett förhöjt antal poster öppna armar mätt med EPM testet kan avspegla minskade ångest nivåer. Med den här metoden, är effekten av exogena keton kosttillskott på ångest-relaterade beteenden testad hos Sprague Dawley (SPD) råttor. Exogena keton kosttillskott matas kroniskt till råttorna för 83 dagar eller subchronically och akut oralt gavaged, dagligen i 7 dagar, innan du utför EPM testa. Beteendemässiga data collection utförs med hjälp av SMART video spårande system av en blindad observatör i slutet av behandlingar. De viktigaste resultaten indikerar att testet EPM är en effektiv metod att upptäcka keton supplement-inducerad ångestdämpande effekten och kan anses vara en känslig åtgärd för att bedöma förändringar i ångest beteende som förknippas med drog – eller metabolisk-baserade terapier.
Målet med denna artikel är att beskriva metodiken för EPM testet i kombination med en video som spårning programvara för att övervaka förändringar i ångest-relaterade beteenden och nya behandlingar i laboratoriet gnagare modeller. EPM testet är en relativt enkel beteendemässiga bedömningsmetod, som utvecklats för utredning av kvantifiera ångest beteende nivåer och ångest Svaren hos råttor efter tillämpningen av drogen behandlingar1. Det har faktiskt visat att testet EPM är en allmänt använd och effektiv beteendevetenskaplig analys för utredning av förändringar i ångest nivåer av gnagare1,2. Tillämpligheten av EPM testet hos gnagare (främst råttor och möss) är baserad på deras benägenhet mot slutna, mörka utrymmen (strategi), en ovillkorlig rädsla för öppna platser/höjder (undvikande) och deras hög inneboende motivation att utforska roman miljöer. Följaktligen, EPM testet är en väletablerad metod baserad på en strategi-undvikande konflikt2,3.
EPM är en plus-formad apparat bestående av fyra upphöjda armar, som har beskrivits av Handley och Mithani4 (figur 1), och består av två motsatta armar som är öppna till omgivningen (öppna armar), medan de två stängda motsatt armar (stängt vapen) är utrustade med väggar. Efter behandling, om ökad tid som spenderas på de öppna armarna och/eller ett ökat antal öppen arm poster jämfört med kontroll (obehandlat) djur upptäcks på EPM indikerar en ångestdämpande effekt2,3. Den mest robusta undvikande Svaren har visats i de första 5 min efter start (placering av råttorna i skärningspunkten mellan fyra armarna på EPM) av EPM assay5; därför registreras vanligen någon beteende efter en behandling för 5 min till EPM. Som ytterligare åtgärder av en ångest nivå, antalet huvud dips, föder upp (vertikalt stående av gnagare på två bakben), fekal boli, samt totala arm kan poster (spontan motorisk aktivitet) och olika ställningar (stretching eller frysning), också registreras på den EPM-2. Således kan flera behavioral parametrar sammanställas för att ge en övergripande bedömning av ångest-relaterade beteenden.
För att öka giltigheten av resultaten, två till tre beteendemässiga analyser används vanligen tillsammans, till exempel ljus-mörker val prov, social interaktion, och EPM testet, för att mäta ångest nivåerna av olika djur modeller6. EPM analysen utförs ensam på gnagare är också en lämplig metod att undersöka ångestdämpande eller anxiogenic effekten av olika droger7. EPM testet är känsliga inte bara till bensodiazepin-typ anxiolytika (t.ex., diazepam)8, men också, bland annat till amino syra, Mao, peptiderga och nucleosidergic föreningar (t.ex., det N-metyl-D-aspartat (NMDA)-antagonist AP7, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syra (AMPA) antagonist CNQX, µ-opioida receptoragonist morfin, NPY1-antagonist BIBP3226, substans P, ghrelin, oxytocin, serotonin receptoragonister och antagonister såsom 8-OH-DPAT och Way-100635 och β1-adrenerg betaxolol)9,10,11,12. Följaktligen, EPM analysen på gnagare är en lämplig och känslig metod att undersöka påverkan av olika behandlingar som påverkar hjärnområden som ingår i den ångestdämpande effekten (t.ex., amygdala, hippocampus och limbiska områden) och verkningsmekanismer (t.ex., serotonerga GABAergic och adenosinergic systemet) inblandade i ångest2. Agenterna testas i dessa EPM studier inkluderar exogena keton kosttillskott som förändrar hjärnan signalerar på ett subtilt sätt som kan kräva en känslig metod för att upptäcka beteendeförändringar.
I den här artikeln beskriver vi den EPM-test som används i kombination med en video som spårning programvara, som hjälper till att eliminera experimentella bias och underlättar insamling och analys av beteendemässiga förändringar som svar på romanen ångestdämpande behandlingar.
I allmänhet vanliga flera tester, såsom ljus-mörker val testet, testet social interaktion och EPM testet, används för att mäta ångest nivån i olika djurmodeller. Dock EPM analysen enbart är en lämplig metod att undersöka, till exempel effekten av exogena keton kosttillskott på gnagare ångest nivåer18,20.
Den största fördelen med metoden EPM är att det bygger på gnagare instinktiva benägenhet mot mörka, slutna utrymmen, förutom den obetingade rädslan för höjder och undvikande av öppna ytor. Däremot, baseras andra metoder som används för att studera ångest-liknande beteende på vissa skadliga stimuli, såsom elektriska stötar, mat/vatten deprivation, höga ljud och exponering för predator lukt3beteendemässiga svaren. Dessa tester resultera brukar i en betingad respons, medan EPM representerar också ett mer humant alternativ. Dessutom EPM kan vara ett användbart verktyg att studera olika hjärnregioner (t.ex., limbiska regioner, hippocampus) och bakomliggande mekanismer (t.ex., GABA, Glutamat, serotonin, adenosin) ångest beteende2.
Vid tillämpningen av behandlingar som är ganska stressande för djuren (e.g., den oral sondmatning), är det viktigt att alla djur hanteras på samma sätt och av samma person, särskilt vid bedömningen av potentiella, subtila ångestdämpande effekter. Om möjligt, kan införandet av drogen/föreningen i dricksvatten eller via en välsmakande ‘behandla’ vara en rekommenderad metod. För att säkerställa att samma belopp ges till varje djur, kan en oral sondmatning användas. Baserat på de farmakokinetiska egenskaperna för föreningen, är det oftast klokt att testa djuren på EPM inom 1 timme efter gavaging. När du väljer experimentella ämnen, är det viktigt att överväga sin stam, kön, estrus cykel, och ålder, samt kroppsvikt, enligt målen och testa ämnen2. I hänsyn till ålder, när utforma EPM studier och tolka data, är det viktigt att anse att andelen öppen arm poster ökar linjärt med ålder21 och de åldersrelaterade förändringarna i EPM beteende är stamspecifika22.
När de utför en EPM-test, finns det potentiella problem som behöver åtgärdas. Djur behöver ibland undantas från analysen på grund av avvikande tendenser (t.ex., djuret aldrig lämnar området där den placerades, nästan faller utanför apparaten, är distraherad av en buller eller händelse utanför apparaten). Ytterligare komplikationer med EPM tester kan omfatta behandlingar som orsaka sedering eller hyperaktivitet eftersom dessa typer av effekter måste bedömas via EPM parametrar.
Det är viktigt att exponera djur på EPM-prov en gång eftersom minskad aktivitet på de öppna armarna och en minskad total tid som spenderas på den centrala plattformen visades på den andra (upprepat) exponeringen av gnagare jämfört med den första exponeringen på EPM 14,15. En enda exponering av gnagare på EPM prov rekommenderas därför starkt. Dock om det finns minst tre veckor mellan den första och andra exponeringen för EPM och EPM set-up flyttas till ett annat rum (olika miljö), djuren kan utredas av EPM testa mer än en gång2.
EPM finns i olika material, storlekar (t.ex., för mus eller råtta) och färger, som måste beaktas när man väljer studera ämnen. Det är viktigt att komma ihåg att lukter kvar av tidigare djuret på apparaten kan ändra beteendet för efterföljande djuret. Därför rekommenderar vi använder en EPM gjord av ett material som är lätt att rena, såsom akrylglas (inte transparent), som inte bevarar lukt efter tvätt. Undvika EPM apparater av trä. Helst använda en matt färg som skiljer sig från färgen på de djur som testats på EPM (t.ex., svart om vita djur testas). Ju bättre kontrasten mellan djuret och inneslutningen, desto bättre detektion av djuret och ju högre den tillförlitlighet och precision av resultaten erhållits (sträcka, hastighet, spårning). EPM apparater tillverkad i Matt grå material är användbara med vit, svart, och vitt och svart djur.
En ytterligare fördel med video uppföljningssystemet är att det förutom EPM erbjuder ett flexibelt och lätt sätt att ställa upp med ett brett utbud av beteendemässiga tester, såsom vatten labyrinten, öppna fält, plus/radiella arm/T-Y labyrinter, plats preferens, tvingade simning , och svans suspension tester.
Sammanfattningsvis är syftet med denna artikel att beskriva EPM testet används i kombination med en video spårningsprogram att samla in och analysera beteendemässiga förändringar som svar på romanen ångestdämpande behandlingar. De möjliga tillämpningarna av EPM omfattar i prescreening av nyutvecklade farmakologiska medel för behandling av ångest-relaterade sjukdomar. Utöver de ångestdämpande och anxiogenic ombud, kan också beteendemässiga effekten av olika hormoner och av missbruksdroger undersökas. Påverkan av åldrande och exponering för olika stressorer kan också bedömas. Denna studie har dragit slutsatsen att när rätt åtgärder, användning av EPM har visat sig vara en känslig metod för att bedöma beteendemässiga förändringar i samband med keton komplettering18,20.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av en ONR Grant N000141310062 och en GLUT1D Foundation Grant #6143113500 (till Dominic P. D’Agostino), av den nationella utvecklingen byrån av Ungern (under Grant nr TIOP-1.3.1.-07/2-2F-2009-2008; till Zsolt László Kovács) och av de institutionen av Veterans Affairs (att markera Kindy). Författarna vill tacka Quest Nutrition LLC för att stödja pågående forskning om detta ämne (till Csilla Ari).
Elevated Plus Maze for mice and rats | Coulbourn Instruments | H10-35-EPM | |
SMART Video Tracking Software | Harvard Apparatus | SMART 3.0 |