Real-time kvantitativ polymerase kædereaktion analyse kombineret med reverse transkription (RT-qPCR) har været meget anvendt til at måle niveauet af RNA-virusinfektioner. Her præsenterer vi en direkte RT-qPCR assay, som ikke kræver en RNA oprensning skridt, udviklet til kvantificering af flere RNA-vira, herunder dengue virus.
I øjeblikket, real-time polymerase kædereaktion (PCR) teknologi er et uundværligt redskab for påvisningen og kvantificeringen af viral genomer i forskningslaboratorier og for Molekylær diagnostik, på grund af dens følsomhed, specificitet, og bekvemmelighed. Men i de fleste tilfælde, kvantitativ PCR (qPCR) analysen generelt anvendes til påvisning af virusinfektion har påberåbt sig rensning af viral nukleinsyre før trinnet PCR. I denne undersøgelse, er fluorescens-baserede reverse transkription qPCR (RT-qPCR) analysen udviklet gennem en kombination af en behandling buffer og en et-trins RT-PCR reagens, således at hele processen, fra høsten af cellekultur supernatant for virus-inficeret celler indtil real-time opdagelse, kan udføres uden viral RNA oprensning. Den etablerede protokollen giver mulighed for kvantificering af en bred vifte af RNA koncentrationer af dengue virus (DENV) inden for 90 min. Derudover er tilpasningsevne af direkte RT-qPCR analysen til evaluering af et antiviralt middel påvist ved en in vitro- eksperiment ved hjælp af en tidligere rapporteret DENV hæmmer, mycophenolic syre (MPA). Desuden kan andre RNA-vira, herunder gul feber virus (YFV), Chikungunya virus (CHIKV) og mæslingevirus (MeV), kvantificeres ved direkte RT-qPCR med samme protokol. Derfor er direkte RT-qPCR analysen er beskrevet i denne rapport nyttig for overvågning RNA-virus replikering på en enkel og hurtig måde, som vil blive videreudviklet i en lovende platform for en høj overførselshastighed screening undersøgelse og klinisk diagnose.
Slægten Flavivirus af Flaviviridae -familien omfatter mere end 70 indhyllet, positive-strenget RNA-vira, der overføres af myg og tæger. Vigtigere, fører flavivirus infektion hos mennesker ofte til alvorlig klinisk sygdom, såsom hæmoragisk feber og hjernebetændelse1. Faktisk, en seneste udbrud af Zika virus (ZIKV), en flavivirus, har spredt sig eksplosivt i hele Amerika og har vist sig at være forbundet med neurologiske komplikationer, herunder mikrocefali2,3. Flavivira, har derfor betydelig klinisk og økonomisk indvirkning på det moderne samfund.
En vigtig flavivirus er dengue virus (DENV), en myg-bårne virus vidt udbredt i de tropiske og subtropiske områder af verden. DENV overføres af Aedes myg, herunder Aedes albopictus og Aedes aegypti, hvilket resulterer i den globale spredning af dengue udbrud4. I øjeblikket, World Health Organization (WHO) klassificerer dengue sygdom som tre kategorier: dengue uden advarselstegn, dengue med advarselsskilte og svær dengue4. Selv om primær infektion med en af de fire serotyper af DENV (DENV-1-4) er ofte asymptomatisk eller selvbegrænsende, har epidemiologiske undersøgelser vist, at den sekundære infektion af forskellige serotyper øger risikoen for mere alvorlige former af dengue. Det er værd at bemærke, at antistof-afhængige forbedring af DENV infektion forårsaget af ikke – eller subneutralizing antistoffer produceres under den primære infektion er blevet foreslået som en potentiel mekanisme af svær dengue, som opstod som en sekundær infektion. Men ingen specifikke antivirale lægemiddel er tilgængelig for DENV infektion5.
For udviklingen af antivirale midler mod DENV er rutine og robust assays, som er indstillet til en høj overførselshastighed indstilling, afgørende for opdage virus replikering kvantitativt. Konventionelt, har biologiske assays (fx, plaque assay) til kvantificering af smitsomme virus og immunologiske assays (fxenzym-forbundet immunosorbent assay [ELISA]) til påvisning af virusantigen været brugt til at overvåge DENV replikering i in vitro og i vivo6,7. Men disse assays ofte besværlige og kræver flere dage at udføre, som hindrer håndtering af store mængder prøver. I denne henseende RT-qPCR er en pålidelig analyse til påvisning af DENV infektion: det er specifikke, følsomme og relativt hurtig7. Derudover har RT-qPCR teknik flere fordele i en høj overførselshastighed format. Ikke desto mindre, den typiske procedure af RT-PCR til RNA-vira kræver genvinding af viral nukleinsyrer fra indsamlede prøver. Selv om forskellige udvindingsmetoder kan være ansat for RT-qPCR, er flere trin stadig behov for at få renset viral RNA. Også, RT-qPCR assays normalt kræver dyre spin kolonner eller farlige organiske opløsningsmidler, hvorved præparationsprocessen mere besværligt. For at undgå forkert håndtering og/eller krydskontaminering mellem prøver er en kritisk faktor for succesfuld kvantificering af viral genomer, er en mindre besværlig og tidskrævende metode den foretrukne, især hvis RT-qPCR skal anvendes til høj overførselshastighed format.
Her rapporterer vi en simpel RT-qPCR procedure til måling af DENV RNA i en cellekultur supernatant af inficerede celler, der ikke involverer viral RNA oprensning. Denne optimerede RT-qPCR protokol er sammensat af to trin: i) Inkubationen af en supernatanten af DENV-inficerede cellekultur med en forarbejdning buffer, og ii) one-step RT-qPCR på en real-time PCR instrument. Derfor kan DENV RNA i en kultur supernatanten påvises inden for 90 min (figur 1). Vi beskriver også anvendelsen af den direkte RT-qPCR til andre RNA-virusinfektioner.
I dag, viral nukleinsyre påvisning af fluorescerende-baseret real-time PCR er ved at blive en guld standard for den molekylære diagnose af patogene menneskelige vira, på grund af dens følsomhed og hurtighed,7. Dette er især vigtigt for bekræfter virusinfektion i den tidlige fase af akut smitsomme sygdomme som denguefeber17. Også, i feltet i DNEV grundforskning, RT-qPCR assay er et uundværligt redskab til overvågning virus replikering i in vitro- kultur, som vil føre til en forståelse af replikering af DENV biologi og opdagelsen af antivirale hæmmere. I denne undersøgelse, blev den fluorescerende-baseret real-time PCR assay yderligere udviklet af en kombination af en behandling buffer og en et-trins RT-PCR reagens så at DENV RNA i cellekultur supernatant af inficerede celler kunne kvantificeres ved RT-qPCR uden rensning viral RNA genom. Sammenlignet med rutinemæssig assays til at opdage virus replikation, som plaque assay, ELISA eller konventionelle RT-qPCR ansætte RNA oprensning6,7, en forenklet protokol af RT-qPCR analysen resulterede i en stor reduktion af tid og nødvendige skridt til at kvantificere DENV RNA. Dette er også et vigtigt element, som har fordele i at minimere kontaminering og tab af genetisk materiale. Dog skal det bemærkes, at brugen af en ren hætte er afgørende i opsætning af IVT (trin 2.1) og RT-qPCR (trin 4.1-4.4) reaktioner til at undgå krydskontaminering af amplikon-relaterede produkter eller RNase. Det er også afgørende at håndtere kultur supernatanten, herunder smitsomme virus inde en biosikkerhed kabinet (trin 3.3) at reducere laboratorium smittefare.
En anden betydning af direkte RT-qPCR analysen er, at en bred vifte af viral RNA kopier kan analyseres på samme tid uden fortynding eller koncentration af prøven. Når en seriefremstillede fortyndet DENV-3′ UTR RNA standard blev brugt, direkte RT-qPCR protokollen produceret en lineær standardkurven over syv størrelsesordener, og den lavere kvantificeringsgrænse var 500 RNA eksemplarer (figur 2). Til påvisning af DENV i cellekultur supernatant af inficerede celler, 8 x 10,3 til 8 x 10-2 PFU vira i en 10 μL RT-qPCR var inden for rækkevidde af DENV 3′ UTR RNA standard og lavere detektionsgrænse (8 x 10-2 PFU) blev beregnet til at indeholde 11 , 400 ± 7,077 RNA kopier (figur 3B). Af note, som rapporteret i flere flavivirus undersøgelser18,19,20, blev større forholdet mellem viral RNA kopier til virus smitsom titer (dvs., PFU) i DENV prøver også observeret i denne undersøgelse. Denne overvurdering antages for at være i vid udstrækning på grund af tilstedeværelsen af defekte (dvs.ikke-infektiøse) virus eller gratis viral RNA frigives fra inficerede og døde celler. Selv om forholdet mellem RNA kopier: PFU fås i denne undersøgelse (1,1 x 105 til 1,3 x 105 RNA kopier/PFU) var i strid med de data, der vises tidligere (nøgletal spænder fra 1 til 3 log)21,20, kan dette være tilskrives forskellen i virusstammer, celler eller kultur betingelser ansat. En anden sandsynlig forklaring på forskellen er, at da ingen RNA oprensning proces var involveret i den direkte RT-qPCR assay beskrevet heri, mere DENV RNA i cellekultur supernatant kunne påvises af real-time PCR analyse uden tab af viral genetiske materiale.
Enkelheden i den direkte RT-qPCR øger evnen til at håndtere et stort antal prøver i multi godt formater, såsom en 96-brønd plade. Derfor, denne ejendom vil bistå den fremtidige anvendelse af direkte RT-qPCR analysen til en høj overførselshastighed screening undersøgelse for opdagelsen af anti-DENV medicin. Faktisk i denne betænkning, anvendelse af direkte RT-qPCR analysen for validering af en anti-DENV hæmmer, MPA, blev undersøgt, og resultatet viste, at en50 værdien af MPA fremstillet ved direkte RT-qPCR analysen (figur 4) sammenlignes rapporteret i tidligere undersøgelser ved hjælp af plaque assay12,13. Dette viser at direkte RT-qPCR er en nyttig analyse for korrekt evaluering af de hæmmende effekt af antiviral agenter og kan vedtages i et stof screening undersøgelse i fremtiden.
I denne undersøgelse, blev der gjort forsøg på at anvende den direkte RT-qPCR til påvisning af andre RNA-vira. Som vist i figur 5, når 10-fold fortyndinger af tre andre RNA-vira (YFV, CHIKV og MeV) inddeles i forskellige slægter (Flaviviridae, Togaviridaeog Paramyxoviridae, henholdsvis) blev undersøgt ved hjælp af tidligere sonder rapporteret primere og fluorogenic specifikke for de respektive viral RNA sekvenser. God korrelationer mellem smitsomme titers og Ct værdier blev fremstillet ved direkte RT-qPCR assays, og sammenhænge var 4-6 lineære størrelsesordener. Dette tyder på, at den direkte RT-qPCR protokol er kan tilpasses til forskellige typer af RNA-vira ved blot at ændre virus-specifikke primere og fluorogenic sonder.
Ikke desto mindre følsomheden af påvisning varieret blandt virus testet i denne undersøgelse (figur 5). En ændring af den protokol, der kan forbedre påvisningen af target virus RNA bør være at bruge et nyt sæt af primer/sonden sekvenser. Desuden, menes et vigtigt skridt for den vellykkede direkte RT-qPCR assay at være effektiv udgivelsen af det virale genom under prøven behandling trin (trin 3.1 – 3.4). Det ville være af særlig betydning for kvantitativ påvisning af stabil vira som en ikke-kappebærende virus. Selvom som en indledende eksperiment, Coxsackievirus B3 (CVB3), en ikke-kappebærende RNA-virus, der hører til Picornaviridae, blev udsat for direkte RT-qPCR analysen bruge tidligere beskrevet CVB3-specifikke primere og fluorescerende sonde22, en positive amplikon signal kunne ikke blive opdaget selv med en høj titer (1 x 105 PFU/mL) virus bestand. Dette betragtes i vid udstrækning kan tilskrives ikke-kappebærende virus høje fysiske integritet. Hidtil har nogle RT-PCR assays, der ikke kræver rensning af nukleinsyre er blevet udviklet for at opdage flere RNA-vira, som bruger forskellige protokoller i RNA frigivelse trin23,24,25, 26. således, brugen af de alternative (eller yderligere) behandlinger, såsom en inkubation af en virus prøve ved en høj temperatur, potentielt øger følsomheden af påvisning.
I sammendrag var den direkte RT-qPCR protokol udviklet i denne undersøgelse en enkel og hurtig, men pålidelige metode til kvantificering af viral RNA i cellekultur supernatant af inficerede celler. På grund af denne enkelhed, kunne direkte RT-qPCR analysen behandle en række prøver på kort tid, som besidder løfte til høj overførselshastighed analyse af virus replikering. Desuden blev direkte RT-qPCR protokollens anvendelse til andre RNA-vira også demonstreret. Denne tilgang bør derfor være et nyttigt værktøj til effektiv overvågning af RNA-virusinfektioner i forskning laboratorium omgivelser og eventuelt i kliniske diagnoser.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke Subhash G. hans (hertug-NUS Graduate Medical School, Singapore) til DENV-2 isolere EDEN2 3295 og Shunro Imura (Kobe karantæne Station, Japan) i YFV 17D vaccinestammer. Forfatterne er også taknemmelig for, at medlemmerne af Institut for Mikrobiologi og bekæmpelse af infektioner for deres bistand. Dette arbejde støttes af MEXT KAKENHI Grant nummer JP16737900.
PrimeSTAR Max DNA Polymerase | Takara Bio. Inc | R045A | Comparable PCR reagent kit can be used. |
SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | Comparable thermal cycler instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
6x Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7024S | Comparable gel loading dye can be used. |
2-Log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200 | 0.1-10.0 kilobase pairs. Comparable DNA molecular ladder can be used. |
Gel Scene Tablet | Astec | GST-33 | Comparable gel imaging system can be used. |
illustra GFX PCR Purification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9034-70 | Comparable gel extraction kit can be used. |
BioSpectrometer | Eppendorf | 6135000905 | Comparable spectrophotometer can be used. |
MEGAscrip T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | |
TURBO DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | Included in MEGAscrip T7 Transcription Kit. |
Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio. Inc | 2313A | 40 units/μL |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Comparable RNA purification kit can be used. |
CellAmp Direct RNA Prep Kit | Takara Bio. Inc | 3733Q | |
Proteinase K | Nacalai Tesque | 15679-06 | > 600 units/mL. Comparable reagent can be used. |
iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad | 1725141 | |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | Comparable plate or tube can be used dependent on the real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Comparable film or optical cap can be used dependent on the real-time PCR plate or tube. |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | StepOnePlus-01 | Comparable real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |