Summary
Реальном времени количественные полимеразной цепной реакции анализ в сочетании с обратной транскрипцией (RT-ПЦР) широко используется для измерения уровня РНК-вирусов. Здесь мы представляем прямой RT-ПЦР анализа, которая не требует очистки шаг РНК, разработанные для количественного определения нескольких РНК-вирусов, включая вирус денге.
Abstract
В настоящее время, в реальном времени полимеразной цепной реакции (ПЦР) технология является незаменимым инструментом для обнаружения и количественного определения вирусных геномов в исследовательских лабораториях, а также для молекулярной диагностики, из-за его чувствительность, специфичность, и удобство. Однако, в большинстве случаев, количественного анализа ПЦР (ПЦР) обычно используется для выявления инфицирования вирусом опирался на очищения нуклеиновой кислоты вируса до этапа ПЦР. В этом исследовании анализа ПЦР (RT-ПЦР) на основе флуоресценции обратной транскрипции разрабатывается через сочетание обработки буфера и реагента RT-PCR одношаговый так, что весь процесс, от урожая культуры супернатант инфицированных вирусом клетки до реального времени обнаружения, может выполняться без вирусной РНК очистки. Протокол позволяет количественная оценка концентрации широкий диапазон РНК вируса денге (DENV) в пределах 90 мин. Кроме того адаптируемость прямой RT-ПЦР анализа оценки противовирусное средство подтверждается в vitro эксперимент с использованием ингибитор DENV сообщалось ранее, микофеноловая кислоты (МПа). Кроме того другие РНК-вирусов, включая вирус желтой лихорадки (YFV), вирус чикунгуньи (CHIKV) и вирус кори (МэВ), может быть определена количественно путем прямого RT-ПЦР с тот же протокол. Таким образом прямой пробирного RT-ПЦР, описанные в настоящем докладе полезно для мониторинга репликации РНК вируса в простой и быстрой манере, которая будет и далее развиваться в перспективной платформой для высокопроизводительного скрининга исследования и клинической диагностики.
Introduction
Рода Flavivirus семейства Flaviviridae состоит из более чем 70 охватило, положительный мель РНК-вирусов, которые передаются от комаров и клещей. Важно отметить, что flavivirus инфекции в организме человека часто приводит к тяжелой болезни клинических, как геморрагическая лихорадка и энцефалит1. Действительно недавние вспышки вируса Зика (ZIKV), flavivirus взрывообразно распространилась по всей Америке и было показано, быть связаны с неврологических осложнений, в том числе микроцефалия2,3. Flaviviruses, следовательно, имеют значительные клинические и экономические последствия на современное общество.
Вирус денге (DENV), комарами вирус широко распространены в тропических и субтропических районах мира является важным flavivirus. DENV передается комарами Aedes , включая Aedes albopictus и Aedes aegypti, что приводит к глобальным распространением эпидемий денге4. В настоящее время Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) классифицирует болезни денге как три категории: денге без предупреждающие знаки, денге, предупреждающие знаки, и4тяжелых денге. Хотя первичной инфекции с одним из четырех серотипы DENV (DENV-1-4) часто протекает бессимптомно или самоограничения, эпидемиологические исследования показали, что вторичной инфекции различных серотипов увеличивает риск возникновения более серьезных форм денге. Стоит отметить что антитело зависимых повышение DENV инфекции, вызванные non - или subneutralizing антитела, вырабатываемые в ходе первичной инфекции была предложена в качестве потенциального механизма тяжелой денге, которое произошло в качестве вторичной инфекции. Однако без конкретных противовирусный препарат доступен для DENV инфекции5.
Для разработки противовирусных агентов против DENV рутины и надежные анализы, которые поддаются параметром высокой пропускной способности, важны для обнаружения репликации вируса количественно. Условно биологических анализов (например, assay металлической пластинкы) для количественного определения инфекционных вирусов и иммунологические анализы (например, энзим соединенный assay иммуносорбента [ELISA]) для обнаружения вирусных антигенов были использованы для мониторинга DENV репликацию in vitro и in vivo6,7. Однако эти анализы часто кропотливая и требуют несколько дней, чтобы достичь, что препятствует обработке большого числа проб. В этой связи RT-ПЦР является надежным методом для обнаружения DENV инфекции: это конкретные, чувствительной и относительно скорейшего7. Кроме того техника RT-ПЦР имеет больше преимуществ в формате высокой пропускной способности. Тем не менее Типичная процедура-ПЦР на РНК-вирусов требует восстановления вирусных нуклеиновых кислот из собранных образцов. Хотя для RT-ПЦР могут использоваться различные методы добычи, несколько шагов по-прежнему необходимы для получения очищенного вирусной РНК. Кроме того RT-ПЦР-анализов обычно требуют дорогих спин столбцы или опасных органических растворителей, тем самым делая процесс подготовки более громоздкий. Поскольку во избежание неправильного использования и/или кросс загрязнение между выборками является решающим фактором для успешного определения вирусных геномов, менее трудоемким и длительным метод является предпочтительным, особенно если применить к RT-ПЦР формат высокой пропускной способности.
Здесь мы приводим простой процедуры RT-ПЦР для измерения DENV РНК в надосадке культуры инфицированных клеток, которые не связаны с вирусной РНК очистки. Эта оптимизированная RT-ПЦР протокола состоит из двух этапов: i) инкубации супернатант культуры DENV-инфицированных клеток с обработки буфера и ii) Одношаговая RT-ПЦР в реальном масштабе времени PCR инструмента. Соответственно DENV РНК в культуре супернатанта могут быть обнаружены в течение 90 минут (рис. 1). Мы также описывают применение прямого RT-ПЦР для других РНК-вирусов.
Protocol
1. Подготовка шаблоне ДНК, РНК стандарта
- Подготовить ПЦР микс (общий объем 50 мкл, Таблица 1) с помощью плазмида ДНК вектор, содержащие Новой Гвинеи C DENV-2 (NGC, присоединения число: AF038403.1) 3' untranslated региона (3' УТР)8 и грунтовки (T7-DENV 3 'УТР Fwd и DENV 3' УТР Rvs) в 0,2 мл трубку, как описаны в таблице 2.
Примечание: Этот шаг должен проводиться под чистой Худ (или в чистой комнате) чтобы избежать загрязнения любых продуктов, связанных с ампликонами. - ПЦР усилить cDNA T7 последовательности плавленый DENV 3' УТР в Термоциклер, с использованием следующих условий: 30 циклов (98 ° c 10 s, 55 ° C за 5 s и 72 ° C для 5 s).
- Смешайте реакции PCR с 10 мкл 6 x краситель гель загрузки и загрузки его на агарозы 1% гель с ДНК молекулярной лестница, начиная от 0,1 до 10 kilobase пар (kbp).
- Визуализация продукта PCR (479 низкопробных пар [ВР]) под длинноволновых ультрафиолетового света с помощью метода визуализации ДНК и гель системы. Вырежьте из группы ДНК, используя чистую скальпель.
- Извлечь ДНК, используя набор для очистки ДНК (Таблица материалов).
Примечание: Этот шаг очистки может выполняться за пределами чистой Гуд, но важно, чтобы держать чистой окружающей среды во время процесса, чтобы избежать загрязнения РНКазы, который представляет собой серьезную проблему в следующих шагах стандартных синтез РНК DENV.- Весят среза геля и добавьте 100 мкл буфера захвата на 100 мг геля кусочек пробки microcentrifuge 1,5 мл.
- Растворяют гель по инкубации при 60 ° C за 5-15 мин.
- Собрать столбец очистки ДНК с коллекции трубки и передачи 600 мкл растворенного образца в столбце очистки.
- Центрифуга на 16000 x g 30 s и отмены потока через. Если объем образца больше чем 600 мкл, для остальной части образца ДНК очистки столбца после первого отжима и повторите этот шаг.
- Примените 500 мкл отмывающего буфера в столбце очистки ДНК.
- Центрифуга на 16000 x g для 30 s.
- Поместите этот столбец в новые пробки microcentrifuge 1,5 мл.
- Добавьте 50 мкл буфера и инкубировать столбце при комнатной температуре в течение 1 мин.
- Центрифуга для максимальной скоростью за 1 мин до элюировать ДНК.
- Измерение оптической плотности ДНК на 260 Нм на 3 мкл пример eluted используя спектрофотометр. Используйте такой же объем Элюирующий буфер как пустой.
Примечание: Шаблон ДНК может храниться при температуре-20 ° C до использования.
2. синтез РНК стандарта DENV 3' УТР
Примечание: Сохранить рибонуклеазы (РНКазы)-свободной среды как можно выполнять следующие действия. Set-up Реагент следует выполнять внутри чистый вытяжку свободной от нуклеиназы пипец, советы и трубы.
- Смешайте в vitro транскрипция (IVT) реакции (суммарный объем 20 мкл) с 100 нг T7 RNA промоутер последовательности плавленый DENV 3' УТР ДНК шаблона (от шага 1.6) в 0.2 мл ПЦР-пробирку как описано в таблице 3.
- Инкубируйте смесь при 37 ° C в Термоциклер за 2 ч.
- Добавьте 1 мкл DNase IVT реакции и продолжают инкубацию при 37 ° C 15 мин.
- Очищение в vitro транскрипции РНК с помощью комплекта Очистка РНК (Таблица материалов).
- Добавьте 80 мкл РНКазы свободный H2O и 350 мкл буфера записи, в том числе 1% β-меркаптоэтанол.
- Добавить 250 мкл, 100% этанола в реакции ИВТ и смешайте это хорошо закупорить.
- Собрать столбец Очистка РНК с коллекции трубки и передачи образцов РНК в столбце очистки.
- Центрифуга с 8000 x g 15 s и отмены потока через.
- Применить 500 мкл Отмывающий буфер в столбце Очистка РНК и центрифуги на 8000 x g на 2 мин.
- Вставьте столбец в пробки microcentrifuge 1,5 мл.
- Добавьте 50 мкл РНКазы свободный H2O и инкубировать столбце при комнатной температуре в течение 1 мин.
- Центрифуга для его максимальной скоростью за 1 мин до элюировать РНК.
- Измерение оптической плотности РНК в 260 Нм на спектрофотометр, используя 3 мкл eluted образца. Используйте такой же объем H2O как пустой.
- Определите количество синтезированных РНК на DENV 3' УТР копирования. 1 нг DENV 3' УТР РНК (462 базы, рис. 2) сопоставима с 4.05 x 109 копий.
- Стандарт в магазине РНК-80 ° c до использования.
3. обработка образцов вирусов для RT-ПЦР
Примечание: Шаги 3.1 – 3.3 должны быть обработаны внутри биологической безопасности кабинета. В частности обработки супернатант культуры, содержащих инфекционные вирус должен проводиться под среды биобезопасности уровня 2 (или выше).
- Mix 199 мкл буфера обработки и 1 мкл свободной от нуклеиназы протеиназы K.
- Серийно разбавить синтезированных DENV 3' УТР РНК (от шага 2.6) 1:10 для получения9 5 x 10-5 х 103 копий/мкл РНК стандартного использования мобильных питательной среды (например, DMEM, дополненная плода бычьим сывороточным 10% и антибиотики [DMEM/10% FBS]) содержащие 40 АБС битор РНКазы единиц/мл.
- Смешайте 5 мкл супернатант культуры DENV-инфицированных клеток и DENV 3' УТР РНК стандарт с 5 мкл обработки буфера/протеиназы K решения (от шага 3.1) с помощью 8-Тюбе ПЦР полоски или 96-луночных ПЦР-планшете. Как элемент управления-шаблон (ПНС), смешать 5 мкл клеток питательной среды (т.е., вирус не входит в стоимость) с 5 мкл раствора обработки буфера/протеиназы K.
- После краткого центрифугирования, Проинкубируйте образцы в Термоциклер с использованием следующих условий: 1 цикл (из 25 ° C для 10 мин и 75 ° C за 5 мин).
Примечание: Обработанные образцы могут храниться при температуре 4 ° C, если анализ ПЦР в реальном времени проводится в тот же день. Для длительного хранения образцы должны храниться при температуре-80 ° C.
4. в реальном масштабе времени PCR анализа
Примечание: Настоятельно рекомендуется выполнять шаги 4.1-4.4 внутри чистой капот для сведения к минимуму загрязнения любых продуктов, связанных с ампликон или РНКазы.
- Подготовка мастер смесь RT-ПЦР с одношаговый RT-PCR реагента (Таблица материалов) в 1,5 мл microcentrifuge (РНКазы бесплатно) с использованием DENV 3' УТР специфические праймеры и fluorogenic зонда (таблицы 1). Наращивать объем каждого компонента (Таблица 4) согласно 11% больше общего числа образцов, включая стандартный РНК и NTC реакций.
- Аликвота 8 мкл мастер смеси в колодец для использования в 96-луночных в реальном времени PCR пластины (Таблица материалов).
- Кратко Центрифугуйте образцы переработанных, включая DENV 3' УТР РНК стандарт и NTC (от шага 3.4) и добавить 2 мкл образцов в каждой скважине пластину 96-луночных реальном масштабе времени PCR.
- Уплотнение пластину ПЦР с оптически ясно липкой пленкой.
- Кратко центрифуга пластину на 200 x g для удаления пузырьков воздуха.
- Установите пластину в реальном масштабе времени PCR инструмент и цикла пластину с помощью следующих условий: 1 цикл РТ этап (25 ° C для 10 мин), 1 цикл полимеразной активации этапа (95 ° C на 2 мин), 40 циклов на этапе амплификации (95 ° C 10 s и 60 ° C за 30 s [приобретение данных на этом этапе]).
- Определите количество DENV РНК в образцах с помощью программного обеспечения реального времени ПЦР связанные копии.
- В окне Настройка назначьте также реакции, который должен быть проанализирован как неизвестный образец.
- Назначить также серийно разбавленных DENV 3' УТР РНК как стандартные и введите число ожидаемых копию РНК стандарта в каждой скважине (например, если используются 5 x 103 копий/мкл РНК стандартного раствора, введите 5000). Назначают также как Отрицательный контроль за NTC.
- В окне анализа нажмите на анализ и убедитесь, что коэффициент корреляции (R2) стандартной кривой генерируется равен или больше, чем 0,98.
- Как правило, используют параметры по умолчанию Ct (порог: авто, Базовое начало цикла: авто, базовые конец цикла: Авто) для анализа.
Примечание: Копия количество неизвестных образцов автоматически рассчитываются на основе пороговых значений цикла (Ct) индивидуальных реакций. Количество вычисляемых копии каждого образца рассматривается как копий РНК / 10 мкл RT-ПЦР-реакции (например, если 12,345 указан в неизвестный образец, это означает, что 12,345 копий РНК DENV присутствуют в реакция).
Representative Results
Для количественного определения РНК DENV RT-ПЦР анализа стандарт известных копии номер, который может быть обнаружен же грунт задать, является необходимым условием. В этом протоколе, 462 РНК нуклеотидов Лонг, содержащий 3 'УТР последовательность штамма NGC DENV-2 был в vitro расшифрованный от T7 RNA промоутер плавленый DENV-2-3' УТР ДНК шаблон, который был дополнен ПЦР и очищенный (рисунок 2A и 2B). Когда серийный десятикратного разрежения стандарта DENV РНК (от9 5 x 10-5 х 102 копий в реакции RT-ПЦР 10 мкл) был подвергнут прямым RT-ПЦР-анализа с использованием 3' УТР специфические праймеры и fluorogenic зонда9, линейный кривая с хороший коэффициент корреляции (R2 = 0.98726) был получен (рис. 2 c).
Далее этот прямой assay RT-ПЦР был применен для количественного определения DENV в надосадке культуры клеток, инфицированных вирусом. DENV-2 (Сингапур изолировать EDEN2 329510), который был распространен в клетках комаров C6/36 и титруют assay металлической пластинкы, используя BHK-21 клетки11, серийно разводили (от6 8 x 10 до 80 налета формирования подразделений [PFU] / мл). DENV образцы были затем относились с равным объемом обработки буфера, содержащего протеиназы K для deproteinize вирионов и подвергнуты прямой RT-ПЦР анализа ориентации DENV 3' УТР РНК последовательности. Опять же, хорошая корреляция (R2 = 0.99981) между титра инфекционного DENV и КТ, номер цикла, которая считается точкой, где флуоресцентного сигнала поднимается с экспоненциальным ростом выше фона, был получен (рис. 3A). При КТ значения, полученные из последовательного разрежения DENV акций с известными инфекционными титры были нанесены на стандартной кривой с в vitro расшифрованный 3' УТР РНК, все участки, полученные от 8 x 10-6 до 80 ОРП/мл (равным 8 x 103 8 x 10-2 PFU в реакции RT-ПЦР 10 мкл) находились в пределах тех, кто подвергается стандартных РНК (9 5 x 10-5 х 103 копирует в реакции RT-ПЦР 10 мкл, рисунок 3B), указав, что DENV образцы с широкий спектр инфекционных титры могут быть проанализированы в то же время, с помощью этой прямой RT-ПЦР. В параллельных экспериментов было изучено влияние обработки буфера или лечения протеиназы K на обнаружении вирусной РНК RT-ПЦР анализа. Хотя лечение журнала разбавления образца DENV (8 x 106 -8 x 102 PFU/мл) с фосфат амортизированное saline (PBS) только до RT-ПЦР (1:1 разбавления образца вируса с PBS) и инкубации 25 ° C для 10 мин и 75 ° C за 5 мин вызвало регрессии кривая (рис. 3 c, чёрная линия) и средние значения Ct, полученные путем обращения с PBS было задержано 2.6-3.2 циклов по сравнению с КТ, полученные путем обработки буфера/протеиназы K лечения (рис. 3 c, пунктирная линия). Кроме того высокий разрежения вируса (8 x 102 PFU/мл [8 x 10-1 ОРП за реакции RT-ПЦР 10 мкл]) не могут быть обнаружены с PBS лечения (рис. 3 c). В отсутствие протеиназы K во время обработки буфера лечения (рис. 3 c, серая линия) был создан аналогичный регрессии; Однако задержка в амплификации (0,1-0,8 циклов) по-прежнему наблюдался относительно реакции обработки, содержащие протеиназы K (рис. 3 c, пунктирная линия). Эти данные показывают, что среди условий испытания, лечение DENV образца с буфера обработки вместе с протеиназы K улучшает чувствительность RT-ПЦР анализа.
Прямые RT-ПЦР анализа Далее оценивали для его применимость к проверке противовирусные препараты против DENV. Сообщается, что микофеноловая кислота (МПа), ненуклеозидных ингибиторов инозин монофосфат дегидрогеназы, который используется как иммунодепрессанты в трансплантации, подавляют DENV в пробирке12,13. Хотя предыдущие исследования занятых обычных налета пробирного или цитометрии анализа потока для обнаружения вирусных антигенов, чтобы продемонстрировать эффект МПа на DENV инфекцию12,13, в настоящем исследовании, прямой RT-ПЦР применяется для оценки МПа противовирусной активностью. НеЬа клетки, которые были осеменены на плотности тарелок 5 x 104 клетки/хорошо в пластине 24-Ну за 1 день до инфекции, были подвержены DENV-2 в MOI 1 для 1 h и после стирки, культивируемых с DMEM/10% FBS присутствии 50-0,016 мкг/мл (МПа или 0,1% диметилсульфоксида [ДМСО]). Супернатант культуры собирались 3 дней после инфицирования и подвергнуты прямой assay RT-ПЦР с помощью DENV 3' конкретных UTR грунты и флуоресцентный зонд. Рисунок 4 показывает DENV РНК копий (на реакции) в supernatants культуры в инфицированных клетках, обработанных с увеличением концентрации МПа, которые были определены в vitro расшифрованный 3' УТР РНК стандарт. При лечении 50 мкг/мл (156 мкм) МПа, было отмечено сокращение 99.87 ± 0,02% ДМСО лечение управления культуры (рис. 4). Важно отметить, что значение50 (50% ингибирующее концентрация) для МПа, определяются данные, показанные на рисунке 4 был 0,79 мкм, которая похожа на значения сообщалось ранее12,13. Этот результат, таким образом, указывает, что этот прямой assay RT-ПЦР является полезным и надежным методом для оценки тормозящий эффект противовирусных агентов на DENV инфекции.
Наконец были протестированы приложениям прямой RT-ПЦР анализа других РНК-вирусов. Когда запас желтой лихорадки (YFV) 17D вакцины штамма вируса (Flaviviridae), который был усилен в клетках Vero и титруют на клетки BHK-21, был подвергнут прямым RT-ПЦР с помощью YFV-17 D-специфические праймеры и fluorogenic зонда14, как описаны в таблице 1, калибровочной кривой с хорошим прямая корреляция между вирусом титры и Ct значения могут быть получены с десятикратного серийный разрежения запасов вируса (3,2 x 105 3.2 ОРП/мл, рис 5A). Кроме того, прямые RT-ПЦР анализ вирус чикунгуньи (CHIKV, Togaviridae) Росс штамм акций, который был усилен в клетках Vero и титруют на ППА-21 клетки, используя CHIKV-специфические праймеры и fluorogenic зонда15 (Таблица 1), дал хороший регрессии между инфекционных титры (4.4 x 108 до 4.4 x 103 PFU/мл) и Ct значения (Рисунок 5B). Это было также в случае обнаружения серийный разрежения (8 x 102 -8 x 10-2 PFU/мл, рис. 5 c) вируса кори (МэВ, Paramyxoviridae), которые были распространены и титруют с клеток Веро, используя ранее сообщил грунты и fluorogenic зонда16 (Таблица 1). Эти данные демонстрируют адаптируемость прямой RT-ПЦР анализа количественного обнаружения различных РНК-вирусов.
Рисунок 1: процесс прямого RT-ПЦР анализа. Супернатант культуры DENV-инфицированных клеток лечится обработки буфера, содержащего протеиназы K освободить вирусной РНК (пример обработки шаг). Обработанный образец затем смешивается с реагента одношаговый RT-PCR и подвергается в реальном времени PCR пробу с помощью DENV 3' УТР специфические праймеры и fluorogenic зонда. Уровень вирусной РНК, обнаруженных в соответствующих образцов может определяться серийно разреженных стандарт с использованием в vitro транскрипции РНК DENV. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: калибровочной кривой, порожденных DENV 3' УТР РНК. (A) стандартные РНК, содержащие 3' УТР DENV-2 NGC был транскрибируется в пробирке из фрагмента последовательности кварцевое ПЦР РНК T7 промоутер. (B) очищенные DENV 3' УТР РНК (250 нг) был визуализирован на геле агарозы 1% (правой полосе). Полосу слева показывает маркер молекулярного веса для электрофореза RNA. (C) A Журнал разрежения DENV 3 'УТР РНК стандарт был относиться с обработки буфера, содержащего протеиназы K и подвергнут ПЦР анализ в реальном времени с помощью одношагового RT-ПЦР реагента и DENV 3' УТР специфические праймеры и fluorogenic зонда набор. Средние значения Ct (n = 3) получил в соответствующих разведений были заговоре против предполагаемое количество 3' УТР РНК (5 х 109 до 5 x 102 РНК копирует в реакции RT-ПЦР 10 мкл). R2 -коэффициент корреляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: количественная оценка DENV РНК в наличии вируса путем прямого RT-ПЦР. (A) DENV-2 высокий титр запасов производится в ячейки C6/36 серийно разводили в 10 раз (8 x 106 до 8 x 101 ОРП/мл) с DMEM/10% FBS содержащий битор РНКазы и подвергнуты прямой RT-ПЦР анализа с использованием DENV 3' УТР специфические праймеры /Probe. (B) Ct значения, полученные от RT-ПЦР журнала разбавленный DENV акций (круги) были построены на стандартной кривой 3' УТР РНК (треугольники) транскрипции в пробирке. Использование 8 х 106 ОРП/мл бульона в прямой assay RT-ПЦР соответствует 8 x 103 PFU вируса в 10 мкл RT-ПЦР-реакции. (C) Эта группа показывает эффект обработки буфера и лечения протеиназы K на обнаружении вирусной РНК. DENV разбавленный фондовой (8 x 106 -8 x 102 PFU/мл) был инкубировали с равным объемом обработки буфера, содержащий протеиназы K (белые кружки), обработка буфера только (серые круги), или PBS (черные круги) и затем подвергаются прямой RT-ПЦР анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Оценка ингибирующего эффекта МПа прямого RT-ПЦР. НеЬа клетки были заражены DENV-2 на мои 1 и культивировали в присутствии увеличения концентрации МПа, ингибитор сообщалось ранее DENV (или 0,1% ДМСО). Через три дня после инфекции, supernatants культуры инфицированных клеток были собраны и подвергнуты прямой RT-ПЦР анализа с помощью DENV 3' УТР специфические праймеры/зонд. Копировать количество вирусной РНК определяется DENV 3' УТР РНК стандартной транскрипции в пробирке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: применение прямого RT-ПЦР для выявления других РНК-вирусов. Серийно разреженных вирус запасы YFV (A), (B) CHIKV и (C) МэВ были подвергнуты прямой RT-ПЦР анализа, используя праймеры PCR и fluorogenic зонды для их соответствующих вирусной РНК последовательности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Цель | Имя | Последовательность (5' - 3') | Примечание |
| T7 промоутер плавленый DENV-2-3' УТР амплификация cDNA | T7-DENV 3' УТР передний | TAA TAC GAC TCA CTA тег GGc ГАА tTA ГАА GGC AAA акт AAC ГПТ AAA | Курсив, T7 промоутер; строчные, прокладку; жирный, NGC нуклеотидов 10,270-10,292 DENV-2 |
| DENV 3' УТР внедорожников | АГА АКК TGT TGA TTC AAC СМЖЛ | Нуклеотиды NGC DENV-2 10,723-10,703 | |
| RT-ПЦР анализ DENV | 3 DENV-2' УТР F | AAG GAC ТЕГ AGG TTA РВОТНЫЙ РВОТНЫЙ АКК C | Ссылка 9 |
| 3 DENV-2' УТР R | GGC ГЦГ КТГ ТГК КТГ ГАА ТГ ТГ | ||
| Зонд 2 Den-2-4 | 6FAM-AAC СМЖЛ ATA TTG ACG КТГ GGA AAG АКК ТАМРА | ||
| RT-ПЦР анализ YFV | YFV NS5 F | ГАА CAG TGA TCA GGA АКК КТК TCT | Ссылка 14 |
| YFV NS5 R | GGA TGT TTG ГЦГ CAC АГТ AAA TGT G | ||
| YFV NS5 зонд | 6FAM-CTA CGT GTC TGG СМЖЛ CCG CAG УГА T-ТАМРА | ||
| RT-ПЦР анализ CHIKV | ЧИК E1 F | TCG ACG CGC CCT CTT TAA | Ссылка 15 |
| ЧИК E1 R | ATC ГАА ТГК АКК ГЦА CAC T | ||
| ЧИК E1 P | 6FAM-АКК СМЖЛ КТГ CAC ОСО TTC КТК АГА C-ТАМРА | ||
| RT-ПЦР анализ МэВ | МЭВ N F | TGG CAT CTG AAC ВРЧ GTA TCA C | Ссылка 16 |
| МЭВ N R | TGT CCT CAG ТЕГ TAT ГЦА TTG УГА | ||
| МЭВ N P | 6FAM-CCG ОБЩ ГПТ УГА GGC TTG TTT CAG A-ТАМРА |
Таблица 1: Праймера олигонуклеотида и fluorogenic зонда последовательностей, используемые в данном исследовании.
| Компоненты | Складе концентрация | Объем (мкл) | Конечная концентрация |
| Макс PrimeSTAR премикс | 2 x | 25 | 1 x |
| T7-DENV 3' УТР передний | 1 МКМ | 10 | 200 Нм |
| DENV 3' УТР внедорожников | 1 МКМ | 10 | 200 Нм |
| 3 pEU/DENV ' УТР | 1 нг/мкл | 1 | 20 ПГ/мкл |
| Нуклеаза бесплатно H2O | 4 | ||
| Итого | 50 |
Таблица 2: Компоненты PCR смесь для приготовления DENV 3' УТР шаблона ДНК.
| Компоненты | Складе концентрация | Объем (мкл) | Конечная концентрация |
| T7 последовательности плавленый DENV 3' УТР ДНК шаблон | (переменная) | x | 100 нг в реакции |
| СПС решение | 75 мм | 2 | 7.5 мм |
| Решение CTP | 75 мм | 2 | 7.5 мм |
| Решение GTP | 75 мм | 2 | 7.5 мм |
| UTP решение | 75 мм | 2 | 7.5 мм |
| Реакция буфер | 10 x | 2 | 1 x |
| T7 Фермента микс | 2 | ||
| Рекомбинатные РНКазы ингибитор | 40 единиц/мкл | 1 | 2 единицы/мкл |
| Нуклеаза бесплатно H2O | 7 - x | ||
| Итого | 20 |
Таблица 3: Компоненты IVT смесь для синтеза РНК UTR стандарт 3' DENV.
| Компоненты | Складе концентрация | Объем (мкл) | Конечная концентрация в RT-ПЦР-реакции |
| iTaq универсальные зажимные реакции микс | 2 x | 5.00 | 1 x |
| iScript Расширенный обратной транскриптазы | 40 x | 0.25 | 100 нг в реакции |
| Грунтовки/зонд микс | 3 DENV-2' УТР F: 3 МКМ | 1.00 | 300 Нм |
| 3 DENV-2' УТР R: 3 МКМ | 300 Нм | ||
| Зонд 2 Den-2-4: 2 мкм | 200 Нм | ||
| Нуклеаза бесплатно H2O | 1.75 | ||
| Итого | 8.00 |
Таблица 4: компонентов мастер смеси для реального времени анализа RT-ПЦР РНК DENV. Обратите внимание, что 2 мкл обработанные DENV образца (или стандартный РНК) следует добавить Мастер микс 8-мкл (в общей сложности 10 мкл в реакции).
Discussion
Сегодня обнаружения нуклеиновой кислоты вируса, люминесцентные ПЦР в реальном времени становится золотым стандартом для молекулярной диагностики патогенных для человека вирусов, из-за его чувствительность и скорость7. Это особенно важно для подтверждения инфекции вируса в ранней фазе острых инфекционных заболеваний, как лихорадка денге17. Кроме того в области фундаментальных исследований DNEV, RT-ПЦР анализа является незаменимым инструментом для мониторинга репликации вируса в в vitro культуре, которая приведет к пониманию репликации биологии DENV и открытие противовирусных ингибиторов. В этом исследовании на основе люминесцентных реального времени PCR assay получила дальнейшее развитие сочетание обработки буфера и реагента RT-PCR одношаговый так, что DENV РНК в надосадке культуры зараженных клеток был в состоянии быть количественно RT-ПЦР без очистки геном вирусной РНК. По сравнению с обычной анализов для выявления вирусной репликации, таких как assay металлической пластинкы, ELISA или обычных RT-ПЦР использованием РНК очистки6,7, упрощенный протокол assay RT-ПЦР привели к значительному сокращению времени и шаги, необходимые для количественного определения DENV РНК. Это также важная особенность, которая имеет преимущества в минимизации загрязнения и потеря генетических материалов. Тем не менее следует отметить, что использование чистой капот имеет важное значение в настройке ИВТ (шаг 2.1) и реакции RT-ПЦР (шаги 4.1-4.4) чтобы избежать перекрестного загрязнения любых продуктов, связанных с ампликон или РНКазы. Важно также для обработки супернатанта, включая инфекционные вирус, внутри биобезопасности кабинета (шаг 3.3) для уменьшения риска инфицирования Лаборатория культуры.
Другое значение прямых RT-ПЦР анализа является, что широкий спектр вирусных копий РНК могут быть проанализированы в то же время без разбавления или концентрация образца. Когда используется серийно разбавленных DENV 3' УТР РНК стандарт, прямой RT-ПЦР протокола производства линейной калибровочной кривой в течение семи порядков, и нижний предел количественного определения было 500 копий РНК (рис. 2). Для обнаружения DENV в надосадке культуры инфицированных клеток, 8 x 103 -8 x 10-2 PFU вирусов в 10 мкл RT-ПЦР были в пределах диапазона DENV 3' УТР РНК стандарт, и нижний предел обнаружения (8 x 10-2 PFU) было рассчитано содержит 11 , 400 ± 7,077 копий РНК (рис. 3B). Следует отметить, как сообщалось в нескольких flavivirus исследования18,19,20больше отношение вирусных копий РНК вируса инфекционного титр (т.е., PFU) в DENV образцах было также отмечено в настоящем исследовании. Это преувеличение, как предполагается, во многом вследствие наличия дефектных (то есть, не инфекционными) вирусов или бесплатные вирусной РНК, освобождены от больных и погибших клеток. Хотя отношение копий РНК: PFU полученные в настоящем исследовании (1.1 x 105 до 1.3 x 105 РНК копий/ОРП) согласуется с данными, показанного ранее (соотношения в диапазоне от 1 до 3 журнал)21,20, это может быть объяснить разницу в штаммов вируса, клетки или условий культуры занято. Еще вероятное объяснение несоответствия является, что, поскольку процесс очистки не РНК участвовала в прямых пробирного RT-ПЦР, описанные здесь, больше DENV РНК в надосадке культуры могут быть обнаружены путем ПЦР анализ в реальном времени без потери вирусных генетический материал.
Простота прямой RT-ПЦР повышает способность обрабатывать большое количество образцов в нескольких хорошо форматов, таких как 96-луночных плиты. Таким образом это свойство будет помогать будущее применение прямого assay RT-ПЦР для высокопроизводительного скрининга исследования для обнаружения анти DENV препараты. Действительно в настоящем докладе, было рассмотрено применение прямого RT-ПЦР анализа для проверки достоверности ингибитор анти DENV, МПа, и результат показал что значение IC50 МПа, полученных путем прямого RT-ПЦР анализа (рис. 4) был сопоставим с размером сообщалось в предыдущих исследованиях с использованием налета пробирного12,13. Это показывает, что прямые RT-ПЦР является полезным методом для надлежащим образом оценки тормозящий эффект противовирусных агентов и может быть принят в наркотиков скрининг исследования в будущем.
В этом исследовании были предприняты попытки применить прямой RT-ПЦР для выявления других РНК-вирусов. Как показано на рисунке 5, когда десятикратного разведений трех других РНК-вирусов (YFV, CHIKV и МэВ) подразделяются на разных родов (Flaviviridae, Togaviridaeи Paramyxoviridae, соответственно) были рассмотрены с использованием ранее сообщалось грунты и fluorogenic зонды для соответствующих вирусной РНК последовательности. Хорошей корреляции между инфекционных титры и Ct ценности были получены путем прямого RT-ПЦР-анализов, и корреляции были 4-6 линейных порядков. Это свидетельствует о том, что прямой протокол RT-ПЦР подстраивается под различные типы РНК-вирусов, просто изменив вирус специфические праймеры и fluorogenic зонды.
Тем не менее чувствительность обнаружения варьируются среди вирусов, испытания в этом исследовании (рис. 5). Одна модификация протокола, который может улучшить обнаружение РНК вируса цели следует использовать новый набор последовательностей праймера/зонд. Кроме того ключевым шагом для успешных прямых assay RT-ПЦР считается эффективным выпуск вирусного генома во время выборки, обработки шаг (шаги 3.1-3.4). Это будет иметь особое значение для количественного обнаружения стабильной вирусов, таких как вирус не охватило. Хотя как предварительного эксперимента, Coxsackievirus B3 (CVB3), не охватило РНК вируса, принадлежащие Picornaviridae, был подвергнут прямой пробирного RT-ПЦР, используя ранее описанные CVB3-специфические праймеры и флуоресцентный зонд22, позитивные ампликон сигнал может не обнаруживаться даже с запасом вирус (1 х 105 ОРП/мл) высокий титр. Это рассматривается в значительной мере можно объяснить высокой физической неприкосновенности-оболочечных вирусов. До настоящего времени, некоторые ПЦР-анализов, которые не требуют очистки нуклеиновых кислот были разработаны для обнаружения нескольких РНК-вирусов, которые используют различные протоколы в РНК-релизе шаг23,24,25, 26. Таким образом, использование альтернативных (или дополнительные) лечения, таких как инкубации образца вируса при высокой температуре, потенциально увеличивает чувствительность обнаружения.
Таким образом прямой RT-ПЦР протокол, разработанный в этом исследовании был простой и быстрый, но надежный метод для количественного определения вирусной РНК в надосадке культуры инфицированных клеток. Из-за этой простотой прямой RT-ПЦР assay может обработать ряд образцов в короткое время, которое обещает для анализа высокой пропускной способности репликации вируса. Кроме того было также продемонстрировано применение прямого RT-ПЦР протокола для других РНК-вирусов. Этот подход должен таким образом, быть полезным инструментом для эффективного мониторинга РНК вирусов в лабораторных условиях исследований и, возможно, в клинических диагнозов.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Субхаш G. Васудеван (герцог-NUS высшая медицинская школа, Сингапур) за DENV-2 изолировать EDEN2 3295 и Shunro Имура (Кобе карантинной станции, Япония) для YFV 17D вакцинного штамма. Авторы также признательны членам кафедры микробиологии и инфекционного контроля за их помощь. Эта работа поддерживается МПКСНТ Грант KAKENHI номер JP16737900.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PrimeSTAR Max DNA Polymerase | Takara Bio. Inc | R045A | Comparable PCR reagent kit can be used. |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | Comparable thermal cycler instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
| 6x Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7024S | Comparable gel loading dye can be used. |
| 2-Log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200 | 0.1-10.0 kilobase pairs. Comparable DNA molecular ladder can be used. |
| Gel Scene Tablet | Astec | GST-33 | Comparable gel imaging system can be used. |
| illustra GFX PCR Purification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9034-70 | Comparable gel extraction kit can be used. |
| BioSpectrometer | Eppendorf | 6135000905 | Comparable spectrophotometer can be used. |
| MEGAscrip T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | |
| TURBO DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | Included in MEGAscrip T7 Transcription Kit. |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio. Inc | 2313A | 40 units/μL |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Comparable RNA purification kit can be used. |
| CellAmp Direct RNA Prep Kit | Takara Bio. Inc | 3733Q | |
| Proteinase K | Nacalai Tesque | 15679-06 | >600 units/mL. Comparable reagent can be used. |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad | 1725141 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | Comparable plate or tube can be used dependent on the real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Comparable film or optical cap can be used dependent on the real-time PCR plate or tube. |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | StepOnePlus-01 | Comparable real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
References
- Pastorino, B., Nougairede, A., Wurtz, N., Gould, E., de Lamballerie, X. Role of host cell factors in flavivirus infection: Implications for pathogenesis and development of antiviral drugs. Antiviral Research. 87 (3), 281-294 (2010).
- Fauci, A. S., Morens, D. M. Zika Virus in the Americas--Yet Another Arbovirus Threat. New England Journal of Medicine. 374 (7), 601-604 (2016).
- Wen, Z., Song, H., Ming, G. L. How does Zika virus cause microcephaly? Genes and Development. 31 (9), 849-861 (2017).
- Guzman, M. G., Harris, E. Dengue. Lancet. 385 (9966), 453-465 (2015).
- Low, J. G., Ooi, E. E., Vasudevan, S. G. Current Status of Dengue Therapeutics Research and Development. Journal of Infectious Diseases. 215 (suppl_2), S96-S102 (2017).
- Sukhavachana, P., Nisalak, A., Halstead, S. B. Tissue culture techniques for the study of dengue viruses. Bulletin of the World Health Organization. 35 (1), 65-66 (1966).
- Tang, K. F., Ooi, E. E.
- Suzuki, Y., et al. Characterization of RyDEN (C19orf66) as an Interferon-Stimulated Cellular Inhibitor against Dengue Virus Replication. PLoS Pathogens. 12 (1), e1005357 (2016).
- Callahan, J. D., et al. Development and evaluation of serotype- and group-specific fluorogenic reverse transcriptase PCR (TaqMan) assays for dengue virus. Journal of Clinical Microbiology. 39 (11), 4119-4124 (2001).
- Low, J. G., et al. Early Dengue infection and outcome study (EDEN) - study design and preliminary findings. Annals of the Academy of Medicine, Singapore. 35 (11), 783-789 (2006).
- Hishiki, T., et al. Interferon-mediated ISG15 conjugation restricts dengue virus 2 replication. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 95-100 (2014).
- Diamond, M. S., Zachariah, M., Harris, E. Mycophenolic acid inhibits dengue virus infection by preventing replication of viral RNA. Virology. 304 (2), 211-221 (2002).
- Takhampunya, R., Ubol, S., Houng, H. S., Cameron, C. E., Padmanabhan, R. Inhibition of dengue virus replication by mycophenolic acid and ribavirin. Journal of General Virology. 87 (Pt 7), 1947-1952 (2006).
- Akondy, R. S., et al. Initial viral load determines the magnitude of the human CD8 T cell response to yellow fever vaccination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (10), 3050-3055 (2015).
- Edwards, C. J., et al. Molecular diagnosis and analysis of Chikungunya virus. Journal of Clinical Virology. 39 (4), 271-275 (2007).
- Hummel, K. B., Lowe, L., Bellini, W. J., Rota, P. A. Development of quantitative gene-specific real-time RT-PCR assays for the detection of measles virus in clinical specimens. Journal of Virological Methods. 132 (1-2), 166-173 (2006).
- Peeling, R. W., et al.
- Bae, H. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
- Colton, L., Biggerstaff, B. J., Johnson, A., Nasci, R. S. Quantification of West Nile virus in vector mosquito saliva. Journal of the American Mosquito Control Association. 21 (1), 49-53 (2005).
- Richardson, J., Molina-Cruz, A., Salazar, M. I., Black, W. 4th Quantitative analysis of dengue-2 virus RNA during the extrinsic incubation period in individual Aedes aegypti. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 74 (1), 132-141 (2006).
- Wang, W. K., et al. Detection of dengue virus replication in peripheral blood mononuclear cells from dengue virus type 2-infected patients by a reverse transcription-real-time PCR assay. Journal of Clinical Microbiology. 40 (12), 4472-4478 (2002).
- Gnadig, N. F., et al. Coxsackievirus B3 mutator strains are attenuated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), E2294-E2303 (2012).
- Rudenko, N., Golovchenko, M., Cihlarova, V., Grubhoffer, L. Tick-borne encephalitis virus-specific RT-PCR--a rapid test for detection of the pathogen without viral RNA purification. Acta Virologica. 48 (3), 167-171 (2004).
- Pastorino, B., et al. Development of a TaqMan RT-PCR assay without RNA extraction step for the detection and quantification of African Chikungunya viruses. Journal of Virological Methods. 124 (1-2), 65-71 (2005).
- Nishimura, N., et al. Detection of noroviruses in fecal specimens by direct RT-PCR without RNA purification. Journal of Virological Methods. 163 (2), 282-286 (2010).
- Kang, K., et al. A direct real-time polymerase chain reaction assay for rapid high-throughput detection of highly pathogenic North American porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China without RNA purification. Journal of Animal Science and Biotechnology. 5 (1), 45 (2014).
