Questo protocollo fornisce un metodo efficiente e a basso costo per rilevare virus di Zika o controllare obiettivi in campioni di urina e del siero umano o nelle zanzare di amplificazione isotermica mediata da loop trascrizione inversa (RT-LAMP). Questo metodo non richiede isolamento del RNA e può essere fatto entro 30 min.
L’infezione con il virus di Zika (ZIKV) può essere asintomatico negli adulti, tuttavia, l’infezione durante la gravidanza può portare a aborto spontaneo e difetti di nascita neurologici severi. L’obiettivo del presente protocollo è quello di rilevare rapidamente ZIKV nei campioni umani e di zanzara. Il gold standard attuale per il rilevamento di ZIKV è quantitativa trascrizione d’inversione PCR (qRT-PCR); amplificazione isotermica mediata da loop trascrizione inversa (RT-LAMP) può consentire per un test più efficiente e a basso costo senza la necessità di costose attrezzature. In questo studio, RT-LAMP è utilizzato per il rilevamento di ZIKV in vari campioni biologici entro 30 min, senza prima isolare il RNA dal campione. Questa tecnica è dimostrata utilizzando ZIKV infettato il paziente urina e del siero e infettati campioni di zanzara. Acido ribonucleico ribosomiale 18s e actina sono utilizzati come controlli in campioni umani e zanzara, rispettivamente.
Nel 2015, virus di Zika (ZIKV) guadagnato l’attenzione globale prominente come una malattia infettiva di preoccupazione perché l’infezione durante la gravidanza è stato collegato a aborto spontaneo, morte endouterina, gravi difetti di nascita neurologici compreso microcefalia, come pure altri congenita difetti di nascita1. In rari casi, ZIKV è stato associato con la sindrome di Guillain-Barré. ZIKV principalmente è trasmessa dalle zanzare Aedes ; Tuttavia, può anche essere sparso attraverso il contatto sessuale1. Dato che l’infezione con ZIKV è asintomatica nella maggior parte delle persone o presenta con lievi sintomi simil-influenzali che si sovrappongono con i sintomi di infezione di altri arborviruses1, ci era un’esigenza di miglioramento dei metodi per la rilevazione rapida e conveniente di ZIKV a schermo persone nonché a popolazioni di zanzare locali.
Trascrizione d’inversione quantitativa PCR (qRT-PCR) è un test affidabile per la determinazione di ZIKV; Tuttavia, questa tecnica richiede costose attrezzature specializzate, personale addestrato e l’isolamento di RNA dal campione di interesse. Amplificazione isotermica mediata da loop trascrizione inversa (RT-LAMP) è un metodo di amplificazione dell’acido nucleico di One-Step basato su tecnologia PCR che richiede solo una temperatura di incubazione dovute all’uso di una DNA polimerasi termofila con filo Proprietà di scostamento. Questo aggira la necessità per un termociclatore e diminuisce la lunghezza del tempo necessario per completare il test. Ulteriori vantaggi del RT-LAMP includono la sua alta specificità e sensibilità, robustezza ad una gamma di temperature e livelli di pH, di resistenza a molti di inibitori della PCR2. Ha un costo relativamente basso e i reagenti sono stabili a temperatura ambiente. Date queste caratteristiche, RT-LAMP può essere distribuito in un laboratorio o sul campo. Come tale, reazioni di lampada sono state sviluppate per rilevare una gamma di agenti patogeni e altri tipi di infezione3,4,5. L’obiettivo del protocollo RT-LAMP descritto in questa carta è di rilevare ZIKV senza isolamento del RNA in umani campioni di siero e urina come pure come in una singola zanzara infetta entro 30 min attraverso RT-LAMP. Questo metodo può essere utilizzato per sostituire qRT-PCR, in quanto è uno strumento diagnostico rapido, sensibile che funziona rapidamente e in contesti di fuori del laboratorio.
Il dosaggio di ZIKV RT-LAMP descritto in questa carta funziona utilizzando sia umani e zanzara campioni6. Il limite di rilevazione era circa 1 genoma equivalente6, che dovrebbe essere sufficiente, poiché il carico virale tipico di un paziente sintomatico ZIKV infettata è 103 a PFU/mL 106 7. Inoltre, questo metodo può rilevare ZIKV nei campioni senza primo isolamento di RNA e senza amplificazione di virus in coltur…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato dal contributo filantropico famiglia Maureen e Ronald Hirsch e campo Neurosciences Institute, s. Maria del Michigan. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. Ringraziamo anche Dr. Bernadette Zwaans ed Elijah Ward per la loro revisione critica del manoscritto.
Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | |
Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537S | |
WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380S | |
Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372S | |
MgSO4 | New England Biolabs | B1003S | |
100mM dATP Solution | New England Biolabs | N0440S | Deoxynucleotide Set N0446S |
100mM dCTP Solution | New England Biolabs | N0441S | Deoxynucleotide Set N0446S |
100mM dTTP Solution | New England Biolabs | N0443S | Deoxynucleotide Set N0446S |
100mM dGTP Solution | New England Biolabs | N0442S | Deoxynucleotide Set N0446S |
100mM dUTP Solution | Thermo Fisher Scientific | R0133 | |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S7563 | |
Nancy-520 | Sigma Aldrich | 01494 | |
Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10-068-013 | |
Zika Postive Control | Robert Koch Institute, Germany | N/A | |
Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1600 | |
BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 10816015 | |
Primers | Integrated DNA Technologies | Custom Oligo | |
Nuclease-Free Water | Ambion | AM9938 | |
Urine Preservative | Norgen Biotek | 18126 | |
ZIKV PCR Standard | Robert Koch Institute | N/A | Vero E6 cell supernatants |
DENV2 New Guinea C Control | Connecticut Agricultural Experiment Station | N/A |