Este protocolo fornece um método eficiente e de baixo custo para detectar vírus Zika ou controlar alvos em amostras de urina e soro humanas ou em mosquitos por amplificação isotérmica transcrição reversa mediada por laço (RT-lâmpada). Este método não requer isolamento de RNA e pode ser feito dentro de 30 min.
Infecção com vírus Zika (ZIKV) pode ser assintomática em adultos, no entanto, a infecção durante a gravidez pode levar a aborto e neurológicos graves defeitos de nascimento. O objetivo do presente protocolo é rapidamente detectar ZIKV em amostras de ambos humanos e mosquito. O atual padrão-ouro para a deteção de ZIKV é quantitativa transcrição reversa PCR (qRT-PCR); amplificação isotérmica transcrição reversa mediada por laço (RT-lâmpada) pode permitir um teste mais eficiente e de baixo custo sem a necessidade de equipamento caro. Neste estudo, RT-lâmpada é utilizada para detecção de ZIKV em diversas amostras biológicas dentro de 30 min, sem primeiro a isolar o RNA da amostra. Esta técnica é demonstrada usando ZIKV infectados, soro e urina de paciente e infectado amostras de mosquito. O ácido ribonucleico ribossomal 18s e actina são usados como controles em amostras de humanos e mosquito, respectivamente.
Em 2015, vírus Zika (ZIKV) ganharam atenção mundial proeminente como uma doença infecciosa de preocupação porque infecção durante a gravidez estava ligada ao aborto, morte fetal, graves defeitos congênitos neurológicos incluindo microcefalia, bem como outras doenças congênitas defeitos de nascimento1. Em casos raros, ZIKV tem sido associado com a síndrome de Guillain-Barré. ZIKV é transmitida principalmente pelo Aedes mosquitos; no entanto, ele também pode ser transmitido através de de contato sexual1. Dado que a infecção com ZIKV é assintomática na maioria das pessoas ou apresenta com gripe-como sintomas leves que se sobrepõem com os sintomas da infecção de outros arborviruses1, havia uma necessidade de métodos aperfeiçoados de detecção rápida e econômica de ZIKV para as pessoas, bem como populações locais mosquito da tela.
A transcrição reversa quantitativa PCR (qRT-PCR) é um ensaio confiável para a deteção de ZIKV; no entanto, esta técnica requer equipamento especializado caro, pessoal treinado e isolamento de RNA da amostra de interesse. Transcrição reversa mediada por laço amplificação isotérmica (RT-lâmpada) é um método de amplificação do ácido nucleico de uma etapa baseado na tecnologia PCR que apenas requer uma temperatura de incubação devido ao uso de uma DNA-polimerase termofílicas com vertente Propriedades de deslocamento. Isso evita a necessidade de um thermocycler e diminui o comprimento de tempo necessário para completar o ensaio. Vantagens adicionais da RT-lâmpada incluem sua alta especificidade e sensibilidade, robustez em uma variedade de níveis de pH e temperatura e resistência a muitos inibidores PCR2. Tem um custo relativamente baixo e os reagentes são estáveis à temperatura ambiente. Tendo em conta estas características, RT-lâmpada pode ser implantada em um laboratório ou no campo. Como tal, as reações de luz foram desenvolvidas para detectar uma gama de patógenos e outros tipos de infecção3,4,5. O objetivo do protocolo de RT-lâmpada descrito neste documento é detectar ZIKV sem isolamento de RNA no soro e urina amostras humanas, bem como em um único mosquito infectado dentro de 30 min por meio de RT-lâmpada. Esse método pode ser usado para substituir o qRT-PCR, que é uma ferramenta de diagnóstico sensível e rápida que funciona rapidamente e em configurações fora do laboratório.
O ensaio de ZIKV RT-lâmpada descrito neste papel de trabalhos usando tanto humanos como mosquito amostras6. O limite de detecção foi de aproximadamente 1 genoma equivalente6, que devem ser suficientes, desde que a carga viral típica de um paciente ZIKV infectado sintomático é 103 a 106 PFU/mL7. Além disso, este método pode detectar ZIKV em amostras sem primeiro isolamento de RNA e sem amplificação do vírus…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo Instituto de Neurociências de campo, St. Mary de Michigan e Maureen e Ronald Hirsch família contribuição filantrópica. Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Agradecemos também Dr. Bernadette Zwaans e Elijah Ward para sua revisão crítica do manuscrito.
Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | |
Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537S | |
WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380S | |
Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372S | |
MgSO4 | New England Biolabs | B1003S | |
100mM dATP Solution | New England Biolabs | N0440S | Deoxynucleotide Set N0446S |
100mM dCTP Solution | New England Biolabs | N0441S | Deoxynucleotide Set N0446S |
100mM dTTP Solution | New England Biolabs | N0443S | Deoxynucleotide Set N0446S |
100mM dGTP Solution | New England Biolabs | N0442S | Deoxynucleotide Set N0446S |
100mM dUTP Solution | Thermo Fisher Scientific | R0133 | |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S7563 | |
Nancy-520 | Sigma Aldrich | 01494 | |
Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10-068-013 | |
Zika Postive Control | Robert Koch Institute, Germany | N/A | |
Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1600 | |
BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 10816015 | |
Primers | Integrated DNA Technologies | Custom Oligo | |
Nuclease-Free Water | Ambion | AM9938 | |
Urine Preservative | Norgen Biotek | 18126 | |
ZIKV PCR Standard | Robert Koch Institute | N/A | Vero E6 cell supernatants |
DENV2 New Guinea C Control | Connecticut Agricultural Experiment Station | N/A |