该协议提供了一种高效、低成本的方法, 用于检测人体尿液、血清样品或蚊子中的 Zika 病毒或控制靶, 采用反向转录环介导的等温放大 (RT 灯)。此方法不需要 RNA 隔离, 可以在30分钟内完成。
感染 Zika 病毒 (ZIKV) 可能是无症状的成人, 但是, 在怀孕期间感染可能导致流产和严重的神经系统出生缺陷。该协议的目标是快速检测人类和蚊子样本中的 ZIKV。目前 ZIKV 检测的金标准是定量反向转录 pcr (qRT pcr);反向转录回路介导的等温放大 (RT 灯) 可能允许更有效和低成本的测试, 而不需要昂贵的设备。在本研究中, RT 灯用于在30分钟内在各种生物样品中 ZIKV 检测, 而不首先从样品中分离出 RNA。这种技术是使用 ZIKV 感染的病人尿液和血清, 以及感染的蚊子样本。18S. 核糖体核糖核酸和肌动蛋白分别用作人体和蚊子标本的对照。
在 2015年, Zika 病毒 (ZIKV) 作为一种传染性疾病引起了全球瞩目, 因为怀孕期间的感染与流产、死胎、严重的神经系统先天缺陷 (包括小头) 以及其他先天性出生缺陷1。在极少数情况下, ZIKV 与格林-巴利综合征有关。ZIKV 主要由白纹蚊传播;然而, 它也可以通过性接触传播1。鉴于感染 ZIKV 的人在多数人中无症状, 或出现轻度流感样症状, 与其他 arborviruses1感染的症状重叠, 因此需要改进方法, 快速和经济高效地检测ZIKV, 以筛查人和当地蚊子的数量。
定量反向转录 pcr (qRT pcr) 是一种可靠的 ZIKV 检测方法;然而, 这种技术需要昂贵的专业设备, 训练有素的人员, 和 RNA 分离从样本的兴趣。反向转录回路介导的等温放大 (RT 灯) 是一种基于 PCR 技术的一步核酸扩增方法, 它只需要一个孵化温度由于使用了嗜热 DNA 聚合酶与链位移特性。这就绕过了对 thermocycler 的需要, 减少了完成化验所需的时间长短。RT 灯的其他优点包括其高度特异性和灵敏度, 在 pH 水平和温度范围内的鲁棒性, 以及对许多 PCR 抑制剂2的抗性。它的成本相对较低, 试剂在室温下稳定。鉴于这些特点, RT 灯可以部署在实验室或现场。因此, 已经开发了灯反应, 以检测一系列的病原体和其他类型的感染3,4,5。本文所描述的 RT 灯协议的目标是检测在人体血清和尿样中没有 RNA 分离的 ZIKV, 以及通过 RT 灯在30分钟以内的单一感染蚊子。该方法可用于替代 qRT PCR, 因为它是一种灵敏的, 快速的诊断工具, 工作迅速和在实验室以外的设置。
本文所描述的 ZIKV RT 灯的研究工作使用的人和蚊子样本6。检测的限制约为1基因组等效6, 这应该是足够的, 因为典型的病毒负荷的症状 ZIKV 感染患者是 10 3 至 106 PFU/毫升7。此外, 该方法可以检测不先分离 RNA 的样品中的 ZIKV, 细胞培养中不存在病毒放大。与 qRT PCR 相比, 这大大降低了这种检测的时间、成本和健康风险。</p…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了莫林和罗纳德-神经家庭慈善捐款和密歇根州圣玛丽的实地研究所的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。我们还感谢伯纳黛特 Zwaans 博士和以利亚沃德对手稿的批判性审查。
Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | |
Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537S | |
WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380S | |
Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372S | |
MgSO4 | New England Biolabs | B1003S | |
100mM dATP Solution | New England Biolabs | N0440S | Deoxynucleotide Set N0446S |
100mM dCTP Solution | New England Biolabs | N0441S | Deoxynucleotide Set N0446S |
100mM dTTP Solution | New England Biolabs | N0443S | Deoxynucleotide Set N0446S |
100mM dGTP Solution | New England Biolabs | N0442S | Deoxynucleotide Set N0446S |
100mM dUTP Solution | Thermo Fisher Scientific | R0133 | |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S7563 | |
Nancy-520 | Sigma Aldrich | 01494 | |
Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10-068-013 | |
Zika Postive Control | Robert Koch Institute, Germany | N/A | |
Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1600 | |
BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 10816015 | |
Primers | Integrated DNA Technologies | Custom Oligo | |
Nuclease-Free Water | Ambion | AM9938 | |
Urine Preservative | Norgen Biotek | 18126 | |
ZIKV PCR Standard | Robert Koch Institute | N/A | Vero E6 cell supernatants |
DENV2 New Guinea C Control | Connecticut Agricultural Experiment Station | N/A |