alpacas के साथ सभी प्रक्रियाओं प्रोटोकॉल (2017-2627 और 2018-2925) केंटुकी के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित के साथ अनुसार प्रदर्शन किया गया । 1. प्रतिजन-विशिष्ट अल्पाका एंटीबॉडी की पीढ़ी अल्पाका हैंडलिंग और सामांय विचार उपयुक्त संस्थागत और/या विनियामक अनुमोदन प्राप्त करें । वयस्क alpacas प्राप्त करने के लिए, कम से कम ३.० (स्केल 1-5)12के एक शरीर की स्थिति स्कोर के साथ उंर के 10 साल से । क्योंकि वे झुंड जानवर हैं, दो की एक ंयूनतम घर लेकिन अधिमानतः तीन जानवरों के साथ ।नोट: पुरुषों की सिफारिश कर रहे हैं, क्योंकि सामान्य रूप में, वे एक और भी स्वभाव है और साथ काम करने के लिए आसान कर रहे हैं. आहार, आवास, टीकाकरण और परजीवी नियंत्रण कार्यक्रम13की समीक्षा सहित एक पशु चिकित्सा परीक्षा के माध्यम से पशुओं के स्वास्थ्य की स्थिति की जांच करें । सुनिश्चित करें कि पशुओं को पेशेवर पशु चिकित्सा सिफारिशों के आधार पर स्थानीय भौगोलिक क्षेत्र के लिए उपयुक्त टीकाकरण के साथ तारीख तक कर रहे हैं । एक ecto और endoparasite नियंत्रण कार्यक्रम एक पशुचिकित्सा मूल और विशिष्ट स्थानीय शर्तों13के झुंड के इतिहास की समीक्षा पर आधारित के साथ परामर्श में विकसित करना । Acclimatize के लिए एक सप्ताह का समय है, जिसमें लगाम प्रशिक्षण और संयम के लिए जोखिम है । एक पूर्व प्रतिरक्षण नियंत्रण के रूप में उपयोग के लिए सीरम प्राप्त करने के लिए एक 4 मिलीलीटर रक्त का नमूना लीजिए (१.४ कदम देखें). ०.५ मिलीलीटर aliquots में-20 ° c में सीरा और स्टोर को फ़्रीज़ करें ।नोट: इस समय, अतिरिक्त रक्त एक पूर्ण रक्त कोशिका (सीबीसी) विश्लेषण के लिए जानवरों की प्रारंभिक स्वास्थ्य की स्थिति पर नजर रखने के लिए लिया जा सकता है । Antigen तैयारी फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) या HEPES-बफर खारा (एचबीएस) में शुद्ध प्रोटीन एंटीजन तैयार करें और ≥ 1 मिलीग्राम/एमएल करने के लिए ध्यान केंद्रित । लगभग 3 प्रोटीन की मिलीग्राम पूर्ण प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक है, प्रतिरक्षण सहित, panning, और क्लोन की पुष्टि.नोट: Camelid एंटीबॉडी उच्च विशिष्टता और प्रोटीन एंटीजन के खिलाफ selectivity प्रदर्शित लेकिन आम तौर पर unstructure्ड प्रोटीन या पेप्टाइड एंटीजन के लिए आमतौर पर अच्छी तरह से अनुकूल नहीं हैं । प्रतिजन पवित्रता की स्थापना, पवित्रता > 90% वांछित के साथ । ऐसे एसडीएस के रूप में एक विश्लेषणात्मक विधि का उपयोग-पृष्ठ ।सावधानी: अंय प्रोटीन के साथ महत्वपूर्ण संदूषण चयन के दौरान समस्याओं के लिए नेतृत्व कर सकते है जहां एकल डोमेन एंटीबॉडी के बजाय लक्ष्य प्रोटीन संदूषण के लिए अलग किया जा सकता है । जमी aliquots antigen की १०० µ g की कुल शामिल है जो प्रतिजन की तैयारी करें । ५० µ एल ए 2 मिलीग्राम/एमएल की तैयारी आदर्श है । १०० µ एल के 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर सबसे पतला प्रोटीन समाधान प्रतिरक्षण के लिए उपयुक्त है । वैकल्पिक रूप से, यदि antigen फ्रीज/गल से गुजर नहीं कर सकता है और समाधान दीर्घकालिक में स्थिर होने के लिए जाना जाता है, यह 4 ° c पर संग्रहीत किया जा सकता है ।नोट: सुनिश्चित करने के लिए antigen एक फ्रीज/गल चक्र से गुजरना कर सकते हैं, एक 20 µ एल aliquot का परीक्षण प्रतिजन एक पतली दीवारों पीसीआर ट्यूब और तरल नाइट्रोजन में जमे हुए तस्वीर में तिरस्कृत किया जाना चाहिए । ट्यूब गल, उच्च गति केंद्रापसारक प्रदर्शन, और यूवी/विज़ अवशोषण की तुलना से पहले और ठंड के बाद या एक एसडीएस-पृष्ठ जेल चला कर मात्रात्मक वसूली की पुष्टि करें । यदि संभव हो तो, antigen भी जैविक गतिविधि की अवधारण के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए । फ्रीज गल चक्र सफल होता है, तो शेष प्रतिजन १०० µ एल aliquots में जमे हुए स्नैप है और-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित है । फ्रीज/गल चक्र के साथ मुद्दे हैं, तो प्रोटोकॉल अप करने के लिए 20% ग्लिसरॉल के अलावा के साथ दोहराया जा सकता है । प्रतिरक्षण पांच एंटीजन तक मिश्रण, २०० µ जी प्रत्येक, ३०० के बीच १,००० µ एल के बीच के एक अंतिम मात्रा में सहायक के साथ. सहायक मंदक के रूप में पानी का उपयोग कर अंतिम मात्रा के ≥ ५०% का गठन करना चाहिए ।नोट: यदि बफ़र आवश्यक है, तो HEPES, MOPS, या glycine का उपयोग करें । 5 और 6 के बीच का पीएच अक्सर कड़ाई से तटस्थ होने से ज्यादा अनुकूल साबित होता है । ऐसे फॉस्फेट या साइट्रेट के रूप में polyvalent आयनों से बचें, क्योंकि वे जमावट भड़काने कर सकते हैं । बिजली की कतरनों के साथ अल्पाका के बाल छांटो, कंधे से कंधे तक अपनी गर्दन के आधार के साथ एक वर्धमान चाँद पैटर्न में धनुष लिम्फ नोड्स से सटे क्षेत्रों को बेनकाब करने के लिए । गर्दन से अल्पाका होल्डिंग, धीरे से प्रतिजन एक 22 जी सुई का उपयोग कर धनुष लिम्फ नोड्स के पास गर्दन के आधार पर के साथ चमड़े का इंजेक्शन । प्रदर्शन के पांच इंजेक्शन ~ २०० µ एल (या कम) ~ 5 सेमी के अलावा ।नोट: पशुओं को इंजेक्शन के दौरान किसी दूसरे स्टाफ सदस्य द्वारा रोका जाना चाहिए । इंजेक्शन और alpacas से खून बह रहा है सावधानी के लिए कॉल के बाद से वे लात मार के लिए प्रवण हैं, न सिर्फ पीछे से लेकिन बग़ल में । पशुओं को एक दूसरे के करीब होने, एक समूह में, प्रक्रियाओं के दौरान इष्टतम है । यह देखते हुए कि वे झुंड जानवर हैं, वे एक समूह में शांत और कम जबरदस्ती संयम प्रक्रियाओं के दौरान की जरूरत है । तीव्रग्राहिता के लक्षण के लिए ~ 20 मिनट पोस्ट इंजेक्शन के लिए जानवरों की निगरानी (१.६ कदम देखें) । इंजेक्शन साइटों साप्ताहिक, जो अनुशंसित सहायक का उपयोग करते समय अपेक्षित नहीं है पर स्थानीयकृत सूजन के लिए मॉनिटर । यह सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन की साइट से रक्त रिसाव अत्यधिक नहीं है । पांच बाद बढ़ाने इंजेक्शन साप्ताहिक मिश्रण में प्रत्येक प्रतिजन के १०० µ जी का उपयोग करते हैं । इंजेक्शन साइटों पर बाल कतरन मौसम के आधार पर साप्ताहिक की आवश्यकता हो सकती है । गिरावट और सर्दी में जानवरों के बाल तेजी से बढ़ सकते हैं । ड्राइंग रक्त क्लिप और शराब झाड़ू के साथ संग्रह साइट को संक्रमित । गर्दन के साथ धीरे से पशुओं को नियंत्रित ईमानदार और सीधे आयोजित किया ।नोट: जानवरों मैन्युअल रूप से वीडियो में प्रदर्शन के रूप में नियंत्रित किया जा सकता है. यदि उपलब्ध है, एक अल्पाका ढलान का उपयोग करने के लिए खून बह रहा है और इंजेक्शन के दौरान alpacas नियंत्रित आसानी से निपटने कर सकते हैं । एक अल्पाका ढलान का उपयोग करने के लिए, haltered alpacas ढलान में नेतृत्व कर रहे हैं और त्वरित रिलीज के साथ गर्दन सलाखों और पट्टियों के साथ रोका । अल्पाका ढलान के संस्करणों वाणिज्यिक विक्रेताओं से उपलब्ध हैं । एक मील का पत्थर के रूप में कशेरुकाओं की अनुप्रस्थ प्रक्रिया के ventral प्रक्षेपण का प्रयोग, ventral प्रक्रिया के लिए बस औसत दर्जे का दबाव लागू करके नस बंद करना ।नोट: वयस्क अल्पाका में कोई भेद jugular कुंड नहीं है । jugular नसों अनुप्रस्थ कशेरुका प्रक्रियाओं के ventral अनुमानों द्वारा संरक्षित हैं । यह मोटी त्वचा (जैसे, 1 सेमी मोटी पुरुषों में गर्दन के बीच 1/3 से अधिक “लड़ थाली”) और गर्दन पेशियां यह मुश्किल कल्पना या टटोलना jugular नस ही बनाता है । बाद में, कशेरुका स्थलों का उपयोग jugular स्थान के लिए सबसे उपयोगी संकेतक है । एक ४५ ° कोण थोड़ा औसत दर्जे का (~ गर्दन के केंद्र की ओर प्रक्षेपण के लिए उंगली चौड़ाई) पर सुई डालें । सुई खून बहता है जब तक हेरफेर ।नोट: jugular नस और मन्या धमनी एक दूसरे के करीब हैं । शिरापरक रक्त रंग में काफी लाल हो सकता है, लेकिन अभी भी धमनी रक्त से गहरा है । संग्रह के बाद, दबाव को 0.5-1 मिनट के लिए साइट पर लागू किया जाना चाहिए (या मन्या तक पहुँचा है, तो) रक्तस्तम्भन आश्वासन दिया है जब तक लंबे समय तक. विश्लेषणात्मक प्रयोजनों के लिए रक्त की 4-10 मिलीलीटर ड्रा । एक १.५ इंच का उपयोग, 20 जी सुई आमतौर पर एक उचित आकार सिरिंज या रक्त संग्रह ट्यूब के साथ संयोजन के रूप में. लिम्फोसाइटों शुद्ध जब पूरे खून इकट्ठा करने के लिए लैवेंडर शीर्ष कश्मीर2EDTA ट्यूबों का उपयोग । उपयोग सोने शीर्ष सीरम जुदाई ट्यूबों (BD) जब सीरम उत्पादन के लिए रक्त का संग्रह. उत्पादन प्रयोजनों के लिए रक्त की 50-100 मिलीलीटर ड्रा । एक अतिरिक्त 12 इंच अर्क एक 19-20 जी पंखों वाला “तितली” अर्क सेट के साथ स्थापित विस्तार का प्रयोग करें ।नोट: एक एक्सटेंशन सेट विन्यास एक सहायक एकाधिक रक्त संग्रह ट्यूबों को भरने के लिए अनुमति देता है, venipuncturist संग्रह सुई स्थिर पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति. अर्क के अलावा सेट पशु (3-5 ंयूनतम प्रक्रिया) के संभावित आंदोलन को समायोजित और ऑपरेटरों के लिए एक आरामदायक काम दूरी देता है । प्रतिरक्षा निगरानी तीन से चार दिनों के बाद 3rd और 5गु इंजेक्शन, प्रत्येक जानवर से एक छोटे से परीक्षण भरो प्रदर्शन करने के लिए परीक्षण के लिए सीरा प्राप्त करते हैं । ०.५ एमएल aliquots में सीरा को फ्रीज और स्टोर करें । पशु के स्वास्थ्य पर नजर रखने के लिए एक ही समय में अतिरिक्त रक्त के नमूने प्राप्त, के रूप में ऊपर चर्चा की । पूर्व-प्रतिरक्षा, तीन सप्ताह, और पांच सप्ताह के समय अंक में परीक्षण खून से प्राप्त सीरा का उपयोग एलिसा द्वारा प्रतिजन-विशिष्ट एंटीबॉडी की उपस्थिति की पुष्टि करें । यह एक अंतिम खून लेने के लिए सबसे अच्छा है, जबकि एंटीबॉडी titer अभी भी बढ़ रहा है । उत्पंन प्रतिजन संबध प्लेटों सतह इलाज ९६-अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग । १०० mM सोडियम कार्बोनेट बफर, पीएच ९.० में प्रतिजन के ०.१ µ जी पतला । एक अच्छी तरह से समाधान के १०० µ एल जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी । प्रत्येक प्रतिजन के दस कमजोर पड़ने डुप्लिकेट में परीक्षण कर रहे हैं । एक रिक्त नियंत्रण अच्छी तरह से तैयार है कि कार्बोनेट बफर के साथ ही लेपित है । रात भर की गर्मी के बाद, प्लेट उलटा कुओं की सामग्री को हटाने और पंजाबियों की ०.१ मिलीलीटर, ०.१% 20 के बीच (पंजाब-टी) के साथ तीन बार धो लो । पंजाब में BSA के ०.१ मिलीलीटर (5 मिलीग्राम/एमएल) को जोड़कर कुओं को ब्लॉक टी और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए थाली मशीन । अच्छी तरह से वॉश सॉल्यूशन को pipetting करके और फिर प्लेट के उलटा करके वॉश सॉल्यूशन निकाल कर पंजाब-टी के साथ तीन बार प्लेट धो लें । ०.३ मिलीलीटर के दो-गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने की तैयारी-प्रत्येक पूर्व प्रतिरक्षा और पंजाब में प्रतिरक्षा सीरा-टी बफर 1/100 की एक प्रारंभिक कमजोर पड़ने का उपयोग कर, और अप करने के लिए 1/102400 । कुओं के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने के १०० µ एल जोड़ें और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए गर्मी की अनुमति दें । प्रत्येक कुआं से सीरम निकालें और पंजाब के ०.२ मिलीलीटर के साथ धो-टी तीन बार । 1 एच के लिए 20000 के एक कमजोर पड़ने पर एचआरपी-संयुग्मित बकरी विरोधी लामा आईजीजी एंटीबॉडी के ०.१ मिलीलीटर के साथ एक अच्छी तरह से मशीन ।नोट: प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मापा दोनों पारंपरिक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से भारी श्रृंखला केवल एंटीबॉडी, जो3संचलन में लगभग बराबर अनुपात में मौजूद हैं,14शामिल हैं । एंटीबॉडी समाधान निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से पंजाब के ०.२ मिलीलीटर के साथ धो-टी तीन बार । chromogenic peroxidase सब्सट्रेट के १०० µ एल जोड़ें अच्छी तरह से और दो उच्चतम एकाग्रता अंक की तीव्रता तक कमरे के तापमान पर गर्मी, जो आम तौर पर 5-10 मिनट लगते हैं । एक अच्छी तरह से प्रतिक्रिया को रोकने के लिए ०.१ एम सल्फर एसिड के १०० µ एल जोड़ें । एक प्लेट रीडर का उपयोग कर ४५० एनएम पर एक अच्छी तरह से अवशोषण को मापने । एक समारोह एकाग्रता के रूप में अवशोषित प्लाट । अल्पाका निगरानी और संभावित जटिलताओं प्रक्रिया के दौरान उचित अल्पाका निगरानी सुनिश्चित करें ।नोट: प्रक्रियाओं महत्वपूर्ण प्रतिकूल प्रभाव पैदा करने की उम्मीद नहीं कर रहे हैं । पशु भलाई और स्वास्थ्य को खिलाने और पानी पिलाने के दौरान पशुपालन और/या अनुसंधान कर्मियों द्वारा दैनिक निगरानी की जानी चाहिए । एक के साथ किसी भी जानवर प्रयोग जनित प्रेरित, या सहज प्राकृतिक रुग्णता उपचार के साथ पशु चिकित्सा सेवाओं द्वारा मूल्यांकन के लिए भेजा जाना चाहिए (ओं) के रूप में उपयुक्त प्रदान की, मानवीय इच्छामृत्यु के लिए, यदि आवश्यक हो ।phlebotomy के साथ जुड़े संभावित प्रतिकूल परिणाम खून बह रहा है, चोट, और रक्तगुल्म । जानवरों के खून बह रहा है के लक्षण के लिए देखने के लिए 20 मिनट के बाद रक्त ड्रा के लिए निगरानी की जानी चाहिए । साइटों पर अतिरिक्त दबाव का प्रयोग किया जाना चाहिए । अगर खून बह रहा है बंद नहीं करता है, एक पशुचिकित्सा संपर्क किया जाना चाहिए ।इंजेक्शन और रक्तस्राव के साथ जुड़े अन्य संभावित प्रतिकूल परिणामों में ग्रेन्युलोमा गठन और सूजन शामिल हैं । ग्रेन्युलोमा गठन की उंमीद नहीं है और केंटुकी के विश्वविद्यालय में नहीं मनाया गया है । इंजेक्शन साइट सूजन (लालिमा या सूजन) हो सकता है और एक पशुचिकित्सा के ध्यान में लाया जाना चाहिए । उत्पादन खून की एक संभावित महत्वपूर्ण मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है, और पशुओं को विश्वास दिलाता हूं कि वे स्थिर और रक्त संग्रह के बाद सक्रिय है निगरानी की जानी चाहिए ।तीव्रग्राहिता और pyrogenic प्रतिक्रियाओं दो सबसे अधिक संभावना गंभीर प्रतिकूल परिणाम हैं, लेकिन बहुत कम ही मनाया जाता है । यदि यह होने के लिए थे, तीव्रग्राहिता शीघ्र ही प्रतिजन इंजेक्शन के बाद हो जाएगा और मलाशय के तापमान में वृद्धि, कमजोरी, उल्टी, सांस लेने की समस्याओं के द्वारा प्रकट हो, और/ मलाशय के तापमान शरीर के तापमान में किसी भी वृद्धि का पता लगाने के लिए प्रत्येक इंजेक्शन के बाद निगरानी की जा सकती है । यदि ये मांयता प्राप्त है, एक पशुचिकित्सा तुरंत एक परामर्श के लिए सूचित करें । इसके अतिरिक्त, एक आपातकालीन “क्रैश किट” (जैसे, एड्रेनालाईन, कोर्टिकोस्टेरोइड, और antihistamine) एक पशुचिकित्सा के साथ परामर्श में तैयार पशुओं के इलाज के लिए एक प्रतिकूल प्रतिक्रिया होने का संदेह उपलब्ध होना चाहिए । 2. एकल डोमेन एंटीबॉडी पुस्तकालय निर्माण के लिए शुद्ध लिम्फोसाइटों पिछले इंजेक्शन के बाद तीन से पांच दिनों के रक्त की ५० मिलीलीटर लीजिए (चरण १.४ देखें) ।नोट: रक्त और आरएनए के अलगाव के तेजी से प्रसंस्करण एक उपयुक्त पुस्तकालय आकार15,3, जो panning की सफलता के लिए बहुत महत्वपूर्ण है प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । पंजाब के 5 मिलीलीटर के साथ एकत्र रक्त की 15 मिलीलीटर पतला । एक लिम्फोसाइट जुदाई ट्यूब का उपयोग परिधीय रक्त लिम्फोसाइटों को अलग करने के लिए (PBLs) घनत्व के अनुसार ढाल केंद्रापसारक द्वारा सुझाव बनाती है ।सावधानी: निर्माता के निर्देश संकेत मिलता है कि अप करने के लिए 25 रक्त की मिलीलीटर इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह प्रणाली संतृप्त कर सकते हैं और एक स्वच्छ लिम्फोसाइट तैयारी प्राप्त करने को रोकने. PBL करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा कर पंजाब के 5 मिलीलीटर जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर ८०० x g पर 20 मिनट के लिए स्पिन । 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ८०० x g पर 4 डिग्री सेल्सियस के लिए PBL के बाद पंजाबियों के 5 मिलीलीटर से अधिक ठंडा करने के लिए दो बार धो लें । एक स्पिन-कॉलम आधारित प्रणाली का उपयोग कर कुल आरएनए को अलग करें, निर्माता के निर्देशों के अनुसार. Homogenize उचित बफर में शीर्ष और एक गैर-बहुलक-कतरन प्रणाली के लिए आवेदन करने के द्वारा कोशिकाओं को लागू । कक्ष इनपुट के आधार पर mini या मैक्सी-स्तंभों की उचित संख्या का उपयोग करें । Oligo (डीटी) 12-18 प्राइमरों के ०.१ µ जी के मिश्रण के साथ 10 µ आरएनए के संयोजन द्वारा रिवर्स transcriptase का उपयोग सीडीएनए संश्लेषित । स्थापित विधियों का उपयोग करते हुए एक भोजी लाइब्रेरी जनरेट करें4. इस फेज प्रदर्शन वेक्टर pMES4 में प्रतिबंध एंजाइमों के साथ क्लोनिंग शामिल है फेज समाधान के उत्पादन के लिए रेशा फेज के जीन III से जुड़े डालने की अभिव्यक्ति के बाद । 3. एकल डोमेन एंटीबॉडी panning प्रतिजन संबध प्लेटों सतह इलाज ९६-well प्लेट्स का उपयोग कर उत्पादन । १०० mM सोडियम कार्बोनेट बफर, पीएच ९.० में प्रतिजन के ०.२५ µ जी पतला । इस समाधान के १०० µ एल जोड़ें एक अच्छी तरह से और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी । कोट प्रति प्रतिजन दो कुओं । एक खाली नियंत्रण अच्छी तरह से तैयार है कि कार्बोनेट बफर के साथ ही लेपित है ।नोट: प्लेटों का उत्पादन किया जा सकता है और 4 ° c पर एक सप्ताह के लिए संग्रहीत अगर चयन के कई दौर प्रदर्शन किया जाएगा । इसके अलावा, इस विधि प्रत्यक्ष अवशोषण जो लेबलिंग की आवश्यकता नहीं है, जबकि अंय तरीकों biotinylation या लेबलिंग रणनीतियों के अंय प्रकार का उपयोग करता है । थाली रात भर गर्मी । कुओं की सामग्री को हटाने के लिए पलटने और पंजाब के ०.१ मिलीलीटर के साथ तीन बार धो-टी । पंजाब में BSA की ०.१ मिलीलीटर (20 मिलीग्राम/एमएल) जोड़कर कुओं को ब्लॉक करें और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए थाली की मशीन । पंजाबियों के साथ तीन बार के बाद तीन बार प्लेट धो लें । एंटीजन भी covalently लेबल किया जा सकता है और इस तरह के रूप में कब्जा प्रणालियों में इस्तेमाल किया, उदाहरण के लिए, streptavidin/ 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक हिल मंच पर पंजाब में ४० मिलीग्राम/एमएल BSA के १०० µ एल के साथ फेज समाधान (१०० µ एल) पूर्व उपचार । प्रतिजन लेपित कुओं के लिए फेज समाधान जोड़ें और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए कोमल आंदोलन के साथ मशीन । एकाधिक कुओं का प्रयोग करें क्रम में प्रत्येक प्रतिजन के लिए 1011 फेज की कुल सुनिश्चित करने के लिए । अनबाउंड फेज को उलटा करके छोड़ें और फिर कुओं को धोकर पांच बार पंजाब के २०० µ एल के साथ पांच बार पंजाबियों के साथ पीछा किया । Elute में ०.२५ मिलीग्राम/एमएल trypsin के ०.१ मिलीलीटर जोड़कर फेज और ७०० rpm पर हिल मंच पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मशीनिंग । 4 मिलीग्राम/एमएल 4 के 5 µ एल युक्त एक शीशी के समाधान स्थानांतरण-benzenesulfonyl फ्लोराइड हाइडरोक्लॉराइड (AEBSF) trypsin गतिविधि बुझाने के लिए समाधान । TG1 फेज ३७ डिग्री सेल्सियस पर सक्षम कोशिकाओं को मिलाने के साथ जब तक ओडी६०० = ०.५ प्रदर्शन बढ़ाएँ । TG1 कोशिकाओं के 3 मिलीलीटर के लिए eluted फेज के ५० µ एल जोड़ें । 30 मिनट के लिए मिलाते हुए बिना ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन । १०० µ जी/एमएल एम्पीसिलीन, 2% ग्लूकोज के साथ पूरक पौंड मीडिया के 7 मिलीलीटर जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर हिला ।नोट: सबसे विविध एकल डोमेन एंटीबॉडी प्राप्त करने के लिए, क्लोन अनुक्रम, वांछित संपत्तियों के लिए परीक्षण किया जा सकता है, और panning के एक दौर के बाद का उपयोग । उच्चतम संबध एकल डोमेन एंटीबॉडी प्राप्त करने के लिए panning के दो दौर का उपयोग किया जाना चाहिए. प्लेट पौंड आगर पर रातोंरात विकास के बाद बैक्टीरिया १०० µ g/एमएल एम्पीसिलीन, 2% ग्लूकोज के साथ पूरक प्लेटें । कई धारावाहिक कमजोर पड़ने का परीक्षण करने की आवश्यकता होगी, दो कमजोर पड़ने के साथ शुरू, 1/10000 और 1/100000 कमजोर पड़ने के १०० µ एल चढ़ाना । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर थाली मशीन । कालोनियों उठाओ और एक बाँझ ९६-अच्छी तरह से inoculate १०० µ एल के कुओं के साथ 2XYT १०० µ जी/एमएल एम्पीसिलीन, 2% ग्लूकोज, 10% वी/वी ग्लिसरॉल प्रति अच्छी तरह से । मिलाते हुए बिना ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी । अगले दिन, ६० मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर १७० आरपीएम पर हिला । पीसीआर ट्यूबों में मीडिया के 2 µ एल निकालें । शेष समाधान प्लेट में छोड़ दिया जा सकता है और 1-2 दिन या जमे हुए और बाद में उपयोग के लिए पर संग्रहित-८० डिग्री सेल्सियस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत । प्रदर्शन पीसीआर का उपयोग करने के लिए उपयुक्त प्राइमरों का प्रयोग सदिश । pMES4 के लिए, सकारात्मक क्लोनों की पीसीआर स्क्रीनिंग प्राइमरों का उपयोग करता है कि एकाधिक क्लोनिंग साइट पार्श्व CCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTAC और GGTGGTGTGAGGAGACGGTGACCTG हैं । पोलीमरेज़ इस्तेमाल किया, ५७ डिग्री सेल्सियस, और 30 चक्र के एक एनीलिंग तापमान के लिए उपयुक्त सायक्लिंग शर्तों का उपयोग । 1% (w/v) agarose जेल चलाकर पीसीआर रिएक्शन का विश्लेषण करें । कालोनियों है कि सकारात्मक है एकल डोमेन एंटीबॉडी जीन आवेषण के ~ ५०० बीपी । सुनिश्चित करें कि सकारात्मक क्लोन नमूने के 20-50% हैं ।नोट: इस विधि क्लोन चयन और विश्लेषण है कि ज्यादातर अनुसंधान प्रयोगशालाओं में प्रदर्शन किया जा सकता है के लिए एक साधन प्रदान करता है । वैकल्पिक रूप से, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण लागू किया जा सकता है और जो सांख्यिकीय और तुलनात्मक विश्लेषण16की अनुमति बड़े डेटासेट प्रदान करता है । Inoculate थाली से सकारात्मक क्लोनों १०० µ g/एमएल एम्पीसिलीन के साथ पौंड की 7 मिलीलीटर युक्त ताजा ट्यूबों में । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए झटकों के साथ हो जाना । प्लाज्मिड डीएनए प्राप्त करने के लिए संस्कृति पर एक miniprep प्रदर्शन करते हैं । मानक अनुक्रमण प्राइमर pEX-Rev (CAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGC) का उपयोग अनुक्रम सकारात्मक क्लोन । परिणामी एकल डोमेन एंटीबॉडी अनुक्रम पर गणनात्मक विश्लेषण निष्पादित करें । सुनिश्चित करें कि कोई स्टॉप codons या फ़्रेम शिफ़्ट हैं । समानता और विविधता के लिए परिणामी अनुक्रम वर्गीकृत । अक्सर पहचाने जाते हैं जो अनुक्रम उच्च संबध बाइंडिंग अनुक्रम, विशेष रूप से चयन के दो राउंड के बाद होने की संभावना है । ई. कुंडल के एक BL21-व्युत्पन्न अभिव्यक्ति तनाव का उपयोग कर एकल डोमेन एंटीबॉडी व्यक्त. IPTG के अलावा के माध्यम से अभिव्यक्ति प्रेरित, 22 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ रही है । मैटीरियल मेटल संबध क्रोमैटोग्राफी (IMAC) का उपयोग करते हुए एकल डोमेन एंटीबॉडी को शुद्ध करना । मांय एकल डोमेन एंटीबॉडी/प्रतिजन एक सीधा संपर्क परख जैसे पुल-डाउन, देशी जेल ट्रो, या एलिसा का उपयोग बाध्यकारी । विशिष्ट प्रयोग के लिए वांछित के रूप में अनुप्रयोग विशिष्ट एकल डोमेन एंटीबॉडी प्रदर्शन, सत्यापित करें ।