所有与羊的程序都是按照肯塔基州大学动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 批准的协议 (2017-2627 和 2017-2627) 进行的。 1. 抗原特异性羊驼毛抗体的产生 羊驼毛处理和一般注意事项 获得适当的制度和监管批准。 获得成年羊, 10岁以下, 身体状况得分至少为 3.0 (1-5 级)12。因为它们是牧群动物, 所以至少有两个, 但最好是三个动物在一起。请注意:推荐男性, 因为一般来说, 他们的气质比较均衡, 更容易合作。 通过兽医检查, 包括饮食、住房、疫苗接种和寄生虫控制计划的审查, 检查动物的健康状况13。根据专业兽医的建议, 确保动物接种适合当地地理区域的疫苗, 确保动物及时接种疫苗。根据对原产地群历史和当地具体情况的回顾, 与兽医协商, 制定外和内寄生虫控制方案13。 适应至少一周, 包括吊环训练和接触约束。 收集4毫升血液样本, 以获得血清作为免疫前控制 (见步骤 1.4)。将血清冷冻, 并以 0.5 ml 的等价物储存在-20°c。请注意:此时, 可以进行完整的血细胞 (cbc) 分析, 以监测动物的初始健康状况。 抗原制备 在磷酸盐缓冲的生理盐水 (pbs) 或 heps 缓冲盐 (hbs) 中制备纯化的蛋白质抗原, 并浓缩至≥1 mg/ml。整个协议需要大约3毫克的蛋白质, 包括免疫、平移和克隆的确认。请注意:骆驼抗体对蛋白质抗原表现出较高的特异性和选择性, 但通常不适合非结构化蛋白质或多肽抗原, 而非结构化的蛋白质或肽抗原通常是非结构化的。 建立抗原纯度, 纯度和 gt;90%。使用一种分析方法, 如 sds-page。注意事项:与其他蛋白质的严重污染可能会导致在选择单域抗体时出现问题, 在选择过程中, 单域抗体可以与污染物而不是目标蛋白质隔离。 制备含有100μg 抗原的冷冻等价物。50μl 的2mgml 制剂是理想的。100μl 的 1 mgml 是最适用于免疫的稀释蛋白溶液。或者, 如果抗原不能经过冻融, 并且已知在溶液中长期稳定, 则可以将其储存在4°c。请注意:为了确保抗原可以经历冷冻解冻周期, 测试20μl 的抗原应分配到一个薄壁 pcr 管, 并在液氮中冷冻。通过比较 uv/vis 在冷冻前后的吸收情况或运行 sds-page 凝胶, 对管材进行解冻, 进行高速离心, 并验证其定量回收。在可行的情况下, 还应测试抗原是否保留生物活性。如果冻融循环成功, 剩余的抗原被在100μl 的 aliquots 中被冷冻, 并在-80°c 下储存。如果冷冻解冻周期有问题, 可以在添加高达 2 0% 的甘油的情况下重复协议。 免疫 最多5种抗原, 每种200微克, 最后体积在300至 1, 000μl 之间。佐剂应以水作为稀释剂, 占最终体积的≥50%。请注意:如果需要缓冲液, 请使用 hepes、mops 或甘氨酸。5到6之间的 ph 值往往被证明比严格的中性更有利。避免多价离子, 如磷酸盐或柠檬酸, 因为它们会引起凝固。 用电动剪子修剪羊驼毛, 在一个月牙形的月亮图案沿着其颈部基部从肩部到肩部, 以暴露与弓淋巴结相邻的区域。 用 22 g 针将羊与羊牵住, 慢慢地沿着颈部基部靠近弓淋巴结的情况下注射抗原。间隔约 200μl (或更小) ~ 5 厘米进行5次注射。请注意:在注射过程中, 应由第二名工作人员约束动物。注射和流血的羊需要小心, 因为它们容易踢, 不仅从后面, 而且从侧身。在手术过程中, 让动物彼此接近, 在一个小组中是最好的。鉴于它们是牧群动物, 它们在一个群体中更平静, 在程序过程中需要不那么有力的约束。 在注射后监测大约20分钟的动物是否有过敏反应的迹象 (参见步骤 1.6)。每周监测注射部位的局部炎症, 这在使用推荐的佐剂时是不可预料的。确保注射部位的血液泄漏不过量。 每周使用混合物中每种抗原的100μg 进行五次后续的提升注射。根据季节的不同, 每周可能需要在注射部位剪掉头发。在秋天和冬天, 动物的头发可以迅速生长。 抽血 用酒精棉签对收集网站进行夹紧和消毒。 用挺直挺直的挺直的脖子轻轻地约束动物。请注意:如视频中所示, 可以手动限制动物。如果有的话, 在出血和注射时使用羊驼毛来抑制羊的胃, 可以方便地处理。要使用羊驼毛槽, 有了悬吊的羊被带到降落伞里, 用脖子条和皮带克制住, 快速释放。羊驼毛槽的版本可从商业供应商处获得。 利用椎体横向过程的腹侧投影作为地标, 通过向腹侧过程施加压力来阻断静脉。请注意:成年羊驼毛没有明显的颈静脉沟。颈静脉受横向椎体的腹侧投射保护。这种厚实的皮肤 (例如, 1 厘米厚的 “战斗板” 在男性颈部的中间) 和颈部肌肉组织, 使其难以想象或触诊颈静脉本身。随后, 椎体地标的使用是颈静脉定位的最有用的指标。 将针头以45°角稍微内侧 (~ 手指宽度) 插入颈部中心的投影。操纵针头, 直到血液流动。请注意:颈静脉和颈动脉彼此接近。静脉血液的颜色可以是相当红色的, 但仍然比动脉血液深。收集后, 应在该部位施加 0.5-1分钟的压力 (如果进入颈动脉, 则应施加更长的压力), 直到止血得到保证。 绘制4-10 毫升的血液进行分析。使用1.5 英寸, 20 g 针通常与一个合适的大小注射器或血液收集管。使用薰衣草顶k2edta 管收集全血时, 净化淋巴细胞。利用金顶血清分离管 (bd) 采集血液进行血清生产。 为生产目的提取50-100 毫升的血液。使用一个额外的12英寸输液延长集与 19-20 g 有翅膀的 “蝴蝶” 输液套件。请注意:扩展集配置允许助手填充多个采血管, 使静脉剂能够专注于稳定采集针。输液组的加法可容纳动物的潜在运动 (3-5分钟程序), 并为操作人员提供舒适的工作距离。 免疫监测 第3 、5次注射后三到四天, 对每只动物进行小范围的出血试验, 以获得血清进行检测。将血清冷冻并存放在0.5 毫升的等价物中。同时获取额外的血液样本, 以监测动物的健康状况, 如上文所述。 通过 elisa 确认抗原特异性抗体的存在, 使用免疫前、三周和五周时间点的测试出血所获得的血清进行 elisa 检测。最好是在抗体滴度还在增加的情况下进行最后的出血。 使用表面处理96孔板生成抗原亲和板。在 100 mm 碳酸钠缓冲液中稀释0.1 微克的抗原, ph 值9.0。在每口井中加入100μl 的溶液, 并在4°c 下孵育过夜。每种抗原的10种稀释物一式两份。制备了一种仅涂有碳酸盐缓冲液的空白控制井。 隔夜孵育后, 将板材倒置取出井内物, 用0.1 毫升的 pbs 清洗三次, 0.1% tween 20 (pbs-t)。 在 pbs-t 中加入 0.1 ml 的 bsa (5 mg/ml), 并在室温下孵育板 1小时, 从而堵塞井。 用 pbs-t 将清洗液移入井中, 然后通过倒模来去除清洗液, 用 pbs-t 清洗三次。 使用开始稀释为半, 并可制备 pbs-t 缓冲液中每个免疫前血清中 0.3 ml 的两倍串行稀释剂, 最高可达1/102400。 在井中加入 100μl, 使井中的稀释时间达到 2小时, 并允许在室温下孵育2小时。 从每口井中取出血清, 用0.2 毫升的 pbs-t 清洗三次。 用0.1 毫升的 hrp 共轭山羊抗骆驼 igg 抗体在1:20000 的稀释下, 以1小时的速度, 对每口井进行培养。请注意:测量的免疫反应包括常规和重链仅抗体, 存在在近似相等的比率在循环 3,14。 取出抗体溶液, 用0.2 毫升的 pbs-t 清洗每口井三次。 在井中加入100μl 的显冷过氧化物酶底物, 并在室温下孵育, 直到两个最高浓度点的强度饱和, 通常需要5-10。 在每口井中加入 100μl 0.1 m 硫酸以停止反应。 使用板式读取器测量每口井在 450 nm 处的吸收率。 绘制吸收率作为功能浓度。 羊驼毛监测和潜在并发症 确保在整个过程中进行适当的羊驼毛监测。请注意:预计这些程序不会造成重大不利影响。在喂养和浇水过程中, 饲养和研究人员应每天监测动物的健康和健康情况。任何没有得到缓解的实验诱发或自发自然发病率的动物, 都应通过兽医服务机构进行评估, 并酌情提供治疗, 直至必要时接受人道安乐死。与静脉切开术相关的潜在不利后果是出血、擦伤和血肿。应监测动物20分钟后抽血, 寻找出血的迹象。应使用对这些地点的额外压力。如果出血不停止, 应联系兽医。与注射和出血相关的其他潜在不利后果包括肉芽肿的形成和炎症。肉芽肿的形成是意料之外的, 肯塔基州大学也没有观察到。注射部位炎症 (发红或肿胀) 可能会发生, 应引起兽医的注意。生产出血代表着潜在的大量血液, 应该对动物进行监测, 以确保它们在采集血液后是稳定和活跃的。过敏反应和热原反应是最可能的两个严重的不良后果, 但很少观察到。如果发生过敏反应, 过敏反应将发生在抗原注射后不久, 表现为直肠温度升高、虚弱、呕吐、呼吸问题和腹泻。每次注射后都可以监测直肠温度, 以检测体温的任何升高。如果这些被识别, 请立即通知兽医进行咨询。此外, 应与兽医协商准备紧急 “崩溃试剂盒” (如肾上腺素、皮质类固醇和抗组胺) 来治疗怀疑有不良反应的动物。 2. 纯化单领域抗体库构建淋巴细胞 最后一次注射后3至5天收集50毫升血液 (参见步骤 1.4)。请注意:快速处理血液和分离 rna 对于获得合适的文库尺寸15、3 具有重要意义, 这对平移的成功非常重要。 用5毫升的 pbs 稀释采集到的血液15毫升。 根据厂家的建议, 采用密度梯度离心法分离外周血淋巴细胞 (pbl)。注意事项:制造商的说明表明, 高达25毫升的血液可以使用, 但这可能会饱和系统, 并防止获得一个干净的淋巴细胞准备。 将5毫升的 pbs 预冷至4°c 添加到 pbl 中。 在4°c 的 800 x克下旋转20分钟。 在 pbl 中加入5毫升预冷到4°c 的 pbs 清洗, 然后在800xg 的4°c 下离心 20分钟. 根据制造商的说明, 使用基于自旋柱的系统隔离总 rna。通过在适当的缓冲液中进行顶点化并应用于生物聚合物切碎系统, 使细胞同质化。根据单元格输入使用适当数量的迷你列或最大列。 利用逆转录酶合成 cdna, 将10μg 的 rna 与0.1 微克的 Oligo(dT)12-18 引物混合在一起。 使用既定方法生成噬菌体库4。这包括克隆与限制酶进入噬菌体显示载体 pMES4, 然后是插入融合到丝状噬菌体的基因 iii 的表达, 用于噬菌体溶液的产生。 3. 单域抗体平移 使用表面处理96孔板生产抗原亲和板。在 100 mm 碳酸钠缓冲液中稀释0.25 微克的抗原, ph 值9.0。在每口井中加入 100μl, 并在4°c 下孵育过夜。每抗原涂两口井。准备一个空白的控制井, 只涂有碳酸盐缓冲液。请注意:如果将执行多轮选择, 则可以在4°c 下生产和储存长达一周的板材。此外, 这种方法利用直接吸收, 不需要标签, 而其他方法使用生物素化或其他类型的标签策略。 把盘子孵化一夜。倒置去除井内物, 用0.1 毫升的 pbs-t 清洗三次。 在 pbs 中加入 0.1 ml 的 bsa (20 mg/ml), 并在室温下孵育板 2小时, 从而堵塞井。 用 pbs-t 清洗三次, 然后用 pbs 清洗三次。抗原也可以共价标记, 并用于捕获系统, 例如, 链霉素系统。 在室温振动平台上, 用100μl 的 40mgmml bsa 在 pbs 中预处理噬菌体溶液 (100μl), 时间为30分钟。 将噬菌体溶液加入抗原包覆井, 在室温下温和搅拌2小时。使用多个井, 以确保每种抗原总共有 10个11 种噬菌体。 通过倒置丢弃未绑定噬菌体, 然后用200μl 的 pbs-t 清洗井五次, 然后用 pbs 清洗五次。 在 pbs 中加入 0.1 mg/ml 胰蛋白酶, 并在室温下在振动平台上孵育 30分钟, 以700转/分的速度, 以洗脱约束法道。 将溶液转移到含有 5μml 4-苯磺酰氟盐酸盐 (aebsf) 溶液的小瓶中, 以测定胰蛋白酶活性。 在37°c 下生长 tg1 噬菌体显示有能力的细胞, 并有晃动, 直到 od600 = 0.5。 在 tg1 细胞的3毫升中加入50μl 的洗脱噬菌体。 在37°c 下孵化 30分钟, 不摇晃。 加入7毫升的 lb 介质, 辅以100μgml 氨匹西林, 2% 葡萄糖。 在37°c 下夜间摇晃。请注意:为了获得最多样化的单域抗体, 克隆可以进行测序, 测试所需的特性, 并在一轮平移后使用。为了获得最高亲和力的单域抗体, 应利用两轮平移。 在 lb 琼脂板上隔夜生长后将细菌进行平板, 辅以100μgml 氨匹西林, 2% 葡萄糖。需要对几种系列稀释剂进行测试, 首先是两次稀释, 镀100微米的1/10000 和1/100000 稀释。 在37°c 下将板材连夜孵化。 选择无菌96孔板的菌落, 用100μml 的安匹西林、2% 葡萄糖、10% v/v 甘油对每口井接种96孔板的井。 在37°c 下过夜, 不发生晃动。 第二天, 在37°c 的170转/分中摇晃60分钟。 将2μl 的培养基取出到 pcr 管中。剩余的溶液可以留在盘子里, 在4°c 下储存 1-2天, 也可以冷冻, 在-80°c 下储存, 供以后使用。 使用适合所使用载体的引物进行 pcr 反应。对于 pmes4, pcr 对阳性克隆的筛选使用的引物是在多个克隆位点两侧的引物, 这些引物是 cctttgccgggggggggggggggggggtttattac 和 ggggggggggggggggggggggcg。利用适合所使用的聚合酶的循环条件、57°c 的退火温度和30个循环。 通过运行1% 琼脂糖凝胶分析 pcr 反应。阳性菌落具有约 500 bp 的单域抗体基因插入物, 确保阳性克隆为样本的20-50。请注意:这种方法为大多数研究实验室的克隆选择和分析提供了一种手段。或者, 可以应用下一代排序, 并提供允许统计和比较分析的大型数据集16。 将板中的阳性克隆体接种到含有7毫升 lb 的新鲜管中, 并含有100μgml 氨匹西林。 在37°c 下与晃动一起生长。 对培养物进行微准备, 以获得质粒 dna。 序列阳性克隆使用标准测序引物 pEX-Rev (cagtttcttttttcggc)。 对产生的单域抗体序列进行计算分析。确保没有停止密码子或帧移动。 对生成的序列进行相似性和多样性的分类。反复识别的序列最可能是高亲和力绑定序列, 尤其是在两轮选择之后。 使用 bl21 衍生的e.线圈表达株表达单域抗体。通过添加 iptg, 在22°c 下连夜生长, 产生表达式。 采用固定化金属亲和层析法 (immobilized) 纯化单域抗体。 使用直接相互作用检测 (如下拉、原生凝胶电泳或 elisa) 验证单域抗体抗原结合。 根据特定实验的需要, 验证特定于应用程序的单域抗体性能。