Her leverer vi detaljerede protokoller til oral administration af antibiotika til mus, samling af fækal prøver, DNA-ekstraktion og kvantificering af fækal bakterier af qPCR.
Gut mikrobiota har en central indflydelse på menneskers sundhed. Mikrobielle dysbiosis er forbundet med mange fælles immunopathologies som inflammatorisk tarmsygdom, astma og gigt. Dermed, forståelse af de underliggende mikrobiota immunsystemet krydstale mekanismer er af afgørende betydning. Antibiotika administration, mens medvirken patogen clearance, også inducerer drastiske ændringer i størrelse og sammensætning af intestinale bakterielle samfund, som kan have en indvirkning på menneskers sundhed. Antibiotisk behandling i mus sammenfatter indflydelse og langsigtede ændringer i menneskelige mikrobiota fra antibiotisk behandlede patienter, og giver mulighed for undersøgelse af de mekaniske forbindelser mellem ændringer i mikrobielle samfund og immun cellefunktion. Mens flere metoder for antibiotisk behandling af musene er blevet beskrevet, fremkalde nogle af dem alvorlig dehydrering og vægttab komplicerer fortolkningen af data. Her give vi to protokoller for oral antibiotika administration, som kan bruges til langtidsbehandling af mus uden inducerende store vægttab. Disse protokoller gør brug af en kombination af antibiotika, der er rettet mod både Gram-positive og Gram-negative bakterier og kan leveres enten ad libitum i drikkevandet eller ved mundtlig sonde. Desuden, vi beskriver en metode til kvantificering af mikrobielle tæthed i fecal prøver af qPCR, som kan bruges til at validere effekt af antibiotisk behandling. Kombination af disse metoder giver en pålidelig metode til manipulation af tarmens mikrobiota og undersøgelse af virkningerne af antibiotisk behandling hos mus.
Den pattedyr gastrointestinale mucosa er et unikt miljø koloniseret af en meget kompleks blanding af mikroorganismer, der opretter en mutualistic relation med værten. Forsvarssystem af tarmslimhinden består af en epitel lag og en overflod af immunceller, der begrænser latente i tarmen samtidig bevare deres antal og mangfoldighed. Omvendt, commensal organismer er nødvendige for udviklingen af et velfungerende immunsystem. Mens samspillet mellem vært og commensal bakterier er normalt gavnlige, bliver det stadig tydeligere, at dysregulated immunsystemet-mikrobiota krydstale kan favor udvikling af kroniske inflammatoriske sygdomme, sådan asinflammatory tarm sygdom, gigt eller astma1,2.
Gut mikrobiota kan ændres af forskellige faktorer, men måske de mest drastiske ændringer er induceret af antibiotisk behandling, som alvorligt ændrer både størrelse og sammensætning af bakterielle samfund3,4. Mens fordelene ved antibiotika til behandling af infektioner er ubestridelige, kan mikrobiota ændringer foranlediget af antibiotisk eksponering hos mennesker også ændre immun forsvar, hvilket kan føre til skadelige virkninger på sundhed. For eksempel, antibiotisk behandling hos mennesker er blevet forbundet med en øget risiko for Clostridium difficile-induceret diarré, astma og visse former for kræft3. Antibiotisk behandling i mus sammenfatter indflydelse og langsigtede ændringer i gut Fællesskaber af antibiotika-behandlede patienter, og har aktiveret undersøgelse af de mekaniske forbindelser mellem ændringer i mikrobielle samfund og immun cellefunktion. Flere rapporter har dog vist, at administration af antibiotika på drikkevand ad libitum resulterer i meget mærkbar vægttab som mus afstå fra drikkevand, formentlig på grund af dens foul smag5,6. Således i disse modeller kan svær dehydrering samtidige mundtlige antibiotika administration komplicere fortolkningen af eksperimenter med henblik på at identificere effekten af antibiotikabehandling i immun cellefunktion.
Flere metoder kan bruges til at udforske størrelse og sammensætning af mikrobielle samfund i tarm rum7. Next generation sequencing teknologier har givet uvurderlige data om denne sag8, men disse metoder er forholdsvis dyre og kræver ekspert bioinformatic analyser for fortolkning af data. På den anden side traditionelle mikrobiologiske kultur metoder giver mulighed for påvisning af bakteriearter, men de har lav følsomhed og en stor del af commensal bakterier (især anaerober) er meget vanskeligt eller umuligt at dyrke med i øjeblikket tilgængelige metoder8. Kvantitative polymerase kæde reaktion (qPCR) teknikker der bruges i stigende grad til kvantificering og identifikation af fækal bakteriearter, da de giver en hurtig og pålidelig kultur-uafhængig måling af total mikrobielle belastning. I overensstemmelse hermed, qPCR metoder har vist sig nyttige til at studere ændringer i mikrobiota forbundet med alder eller progression af flere sygdomme herunder inflammatoriske tarm sygdom9,10. I overensstemmelse hermed giver qPCR metoder en hurtig og omkostningseffektiv metode til at validere effekten af forskellige behandlinger (herunder antibiotika) i fecal bakteriel belastninger og mikrobiota sammensætning10,11,12.
Her præsenterer vi en detaljeret trinvis redegørelse af to adskilte protokoller for oral antibiotika administration til mus, fækal prøvetagning, DNA-ekstraktion, udarbejdelse af standarder og kvantificering af bakterier i fecal prøver af qPCR. Disse protokoller levere en pålidelig metode til at manipulere den tarmens mikrobiota i mus og studere virkningerne af antibiotikabehandling i tarm homøostase og sygdom.
Her leverer vi eksperimentelle protokoller til oral administration af antibiotika til mus og kvantificering af fækal bakterier af qPCR. Kombinationen af antibiotika anvendes i denne protokol (indeholdende ampicillin, gentamycin, neomycin, metronidazol og vancomycin) mål både Gram-positive og Gram-negative bakterier, tilbyder bakteriedræbende aktivitet mod et fuldt spektrum af bakterier. Både oral sonde og administration af antibiotika i drikkevandet i høj grad mindske fækal bakteriel indlæse5,6,12. Desuden har begge behandlinger en dybtgående indvirkning på Fænotypen af mus som de udvikler flere karakteristika typisk af Kim-fri mus herunder reduceret milt størrelse og udvidede coecum. Udvælgelsen af en bestemt metode til administration af antibiotika kan eventuelt afhænge af længden af eksperimentet som mundtlige sonde metoden kræver daglig administration af antibiotika, bliver mere arbejdskrævende og muligvis forårsager mere ubehag til den dyr i det lange løb.
For administrationen af antibiotika i drikkevandet udvises forsigtighed med tilsætning af sødemiddel til antibiotika blandingen som det er afgørende at holde mus fra dehydrering. Flere grupper har vist, hvordan administration af antibiotika i drikkevand (uden tilsætning af sødemiddel) fører til meget svær og hurtig vægttab med alle mus at miste mere end 20% af oprindelige kropsvægt inden for de første par dage af eksperiment5 , 6. i vores protokol, brug af sødemidlet sakkarin-baserede syntes at være tilstrækkelig til at maskere den antibiotiske smag i vand og mus tabte sig i de første par dage efter antibiotika administration, men genvundet deres vægte hurtigt efter at ( Figur 1). Ikke desto mindre, i vores forsøg 5-10% af mus stadig nå den menneskelige farveprøve af > 20% tab af baseline kropsvægt og skulle aflives. Vi har også testet sucralose-baserede sødestoffer, der har helt undladt at forhindre mus dehydrering (100% af mus tabte > 20% af vægten) mens andre forfattere har publiceret lignende fiaskoer for aspartam-baserede sødestoffer5,6. Føjes til dette, bør alder, genetiske baggrund og generelle sundhedstilstand mus bruges til forsøgene overvejes, da de kan påvirke vægttab og dyrs velbefindende under behandling med antibiotika. Således skal nøje overvågning af mus vægt og generelle sundhedstilstand udføres dagligt i de første to uger af oral antibiotika administration.
qPCR metoder giver en hurtig og omkostningseffektiv metode til kvantificering af 16S rRNA i fecal prøver. Dog nogle begrænsninger bør betragtes med hensyn til denne teknik herunder: Jeg) kravet om en pålidelig høj kvalitet standard; II) af design og effektiviteten af qPCR primere; III), at mikroorganismer kan have forskellige kopi numre af 16S rRNA gen, således gen kopier kan ikke direkte lig celle tæller15. Ikke desto mindre qPCR er en robust og følsom metode, som muliggør hurtig analyse af fækal prøver. Denne metode kan være særlig nyttig for hurtigt validere effekten af forskellige behandlinger (herunder antibiotika) i fecal bakteriel belastninger nemlig indgåendeher ovre. Desuden, selv om vi leverer en protokol til kvantificering af samlede 16S rRNA, denne metode kan let tilpasses (ved at designe specifikke primere16) identifikation af individuelle bakteriel taxa, hvilket giver både kvantitative og kvalitative oplysninger om microbiome størrelse og sammensætning.
I sammendrag, har vi givet to protokoller for oral antibiotikabehandling mus og en qPCR-baseret metode til kvantificering af antibiotika-inducerede ændringer i fecal bakterier. Selv om disse protokoller kan være yderligere optimeret og kombineret med andre metoder efter individuelle eksperimentelle behov, kan de tjene som hurtige, omkostningseffektive og pålidelige værktøjer til at manipulere den murine tarmens mikrobiota og studere virkninger af antibiotisk behandling i tarm homøostase og sygdom.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af den britiske Medical Research Council (tilskud til P.B. hr./L008157/1); R.J. blev støttet af et Marie Curie intraeuropæisk stipendium (H2020-MSCA-IF-2015-703639); P.M.B. blev støttet af en studentship fra britiske Medical Research Council og King’s College London ph.d.-uddannelse partnerskab i biomedicinske videnskaber (hr./N013700/1).
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich (Merck) | A9518 | |
Neomycnin trisulfate salt hydrate | Sigma-Aldrich (Merck) | N1876 | |
Metronidazole | Sigma-Aldrich (Merck) | M3761 | |
Vancomycin hydrochloride | Sigma-Aldrich (Merck) | V2002 | |
Gentamicin sulfate salt | Sigma-Aldrich (Merck) | G3632 | |
Tryptone | Sigma-Aldrich (Merck) | T7293 | |
Yeast Extract | Sigma-Aldrich (Merck) | Y1625 | |
NaCL | Sigma-Aldrich (Merck) | S7653 | |
Sweetener Sweet'n Low | Sweet'N Low | Available in the UK from Amazon.co.uk | |
X-Gal (5-brom-4-chloro-3-indoyl B-D-galactopyranoside) | Fisher scientific | 10234923 | |
Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 10010023 | |
Ultrapure Agarose | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 16500500 | |
RT-PCR grade water | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | AM9935 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530 | |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447 | |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725124 | with ROX |
TOPO TA cloningTM for sequencing | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 450030 | |
QIAamp fast DNA Stool mini kit | Qiagen | 51604 | |
QIAprep spin Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
Syringe filter 0.45µm | Fisher scientific | 10460031 | |
Swann-MortonTM Carbon steel sterile scalpel blades | Fisher scientific | 11792724 | |
Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 303172 | |
Syringe (20 ml) | BD Plastipak | 300613 | |
1.5ml Crystal clear microcentriguge tube | StarLab | E1415-1500 | |
2ml Ultra high recovery microcentrifuge tube | StarLab | I1420-2600 | |
Oral dosing needles 20Gx38 mm curved (pk/3) | Vet-Tech | DE008A | |
Sterilin petri dish 50 mm | Scientific Laboratory Supplies | PET2020 | |
Absolute qPCR plate seals | Thermo Fisher Scientific | AB1170 | |
MicroAmpTM optical 384-well plate | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | 4309849 | |
ViiA7TM 7 real-time PCR system with 384-well block | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | 4453536 | |
Spectrophotometer (Nanodrop 1000) | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | |
Labnet Prism microcentrifuge | Labnet | C2500 | |
MultiGene Optimax Thermal cycler | Labnet | TC9610 |