Summary
在这里, 我们提供了详细的方案, 口服抗生素给小鼠, 收集粪便样本, dna 提取和定量的粪便细菌的 qpcr。
Abstract
肠道微生物群对人类健康有核心影响。微生物异常与许多常见的免疫病理, 如炎症性肠病, 哮喘和关节炎。因此, 了解微生物免疫系统串扰的机制是至关重要的。抗生素管理, 同时帮助清除病原体, 也导致肠道细菌群落的大小和组成的剧烈变化, 这可能会对人类健康产生影响。小鼠抗生素治疗总结了抗生素治疗患者对人类微生物群的影响和长期变化, 并有助于调查微生物群落变化与免疫细胞功能之间的机械联系。虽然已经描述了几种抗生素治疗小鼠的方法, 其中一些会导致严重脱水和减肥, 使数据的解释复杂化。在这里, 我们提供了两个方案口服抗生素给药, 可用于长期治疗小鼠, 而不会诱导重大的减肥。这些协议使用的抗生素组合, 既针对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性菌, 并可以提供在饮用水或口服灌胃。此外, 我们还介绍了一种用 qpcr 定量粪便样本中微生物密度的方法, 该方法可用于验证抗生素治疗的有效性。这些方法的结合为操作肠道微生物群和研究抗生素治疗小鼠的效果提供了可靠的方法。
Introduction
哺乳动物胃肠道黏膜是一种独特的环境, 由高度复杂的微生物混合物组成, 与宿主建立了相互关系。肠道黏膜的防御系统包括一个上皮层和大量的免疫细胞, 限制肠道内的共生体, 同时保持其数量和多样性。相反, 同种异体生物是发展一个功能齐全的免疫系统所必需的。虽然宿主和同种细菌之间的相互作用通常是有益的, 但越来越明显的是, 调节不良的免疫系统-微生物串扰会有利于慢性炎症性疾病的发展, 如肠炎症疾病, 关节炎或哮喘1,2。
肠道微生物群可以通过多种因素改变, 但也许最剧烈的变化是由抗生素治疗引起的, 抗生素治疗严重改变了细菌群落的大小和组成 3,4。虽然抗生素治疗感染的好处是毋庸置疑的, 但人类接触抗生素引起的微生物群变化也会改变免疫防御能力, 从而对健康产生有害影响。例如, 人类的抗生素治疗与艰难梭菌引起的腹泻、哮喘和某些类型的癌症3的风险增加有关。小鼠的抗生素治疗概述了抗生素治疗患者在肠道群落中发现的影响和长期变化, 并使人们能够调查微生物群落变化与免疫细胞功能之间的机械联系。然而, 有几份报告表明, 对饮用水和脂肪的抗生素的管理导致非常明显的体重下降, 因为老鼠不喝水, 大概是由于它的污浊的味道 5,6。因此, 在这些模型中, 严重脱水伴随口服抗生素使用可能会使旨在确定抗生素治疗对免疫细胞功能的影响的实验解释复杂化。
有几种方法可以用来探索肠道室7中微生物群落的大小和组成.下一代测序技术就这一问题提供了宝贵的数据8, 但这些方法相对昂贵, 需要专家进行生物信息学分析, 以解释数据。另一方面, 传统的微生物培养方法可以检测细菌种类, 但它们的灵敏度较低, 很大一部分同种细菌 (特别是厌氧菌) 很难或不可能用当前可用的方法8。定量聚合酶链反应 (qpcr) 技术正越来越多地用于粪便细菌种类的定量和鉴定, 因为它们提供了快速可靠的细菌总负荷的文化无关的测量。因此, qpcr 方法已被证明是有用的研究微生物群的变化与年龄或进展的几种疾病, 包括炎症性肠病9,10.与此相一致, qpcr 方法提供了一种快速且经济高效的方法来验证各种治疗 (包括抗生素) 在粪便细菌负荷和微生物组成10、11、12中的效果。
在这里, 我们提出了两个不同的方案口服抗生素给小鼠, 粪便样本收集, dna 提取, 标准的准备和细菌的定量 qpcr 的详细的分步说明。这些方案为操作小鼠肠道微生物群和研究抗生素治疗对肠道稳态和疾病的影响提供了可靠的方法。
Protocol
本试验使用在特定的无病原体 (spf) 设施中维持的6-8 的野生型 (c57bl6 j) 小鼠进行。所有动物实验都得到了伦敦国王学院、弗朗西斯·克里克研究所动物福利和伦理审查机构以及联合王国内政部的批准。在开始任何动物程序之前, 确保通过当地机构/组织获得适当的许可。
1. 抗生素的管理
注: 提供了两种抗生素治疗的替代方法: 口服灌胃 (步骤 1.1) 和通过饮用水给药抗生素 (步骤 1.2)。
- 口腔灌胃
- 在高压灭菌水中溶解单个抗生素, 以下列浓度制备: 100 mg/ml 时的氨基青霉素、100 mg/ml 的 gentamicin、100 mg/ml 的新霉素、100 mg/ml 的 metronidazo 和 100 mgml 的 vancomycin。使用0.45μm 滤清器进行灭菌。在-20°c 下储存。
- 通过混合上面准备的库存来准备抗生素的鸡尾酒。对于1毫升的体积混合50μl 的氨基青霉素 (5 mg/ml 最终), 50μl 的庆大霉素 (5 mg/ml 最终), neomycin 50μl (最终为 5mg/ml), 甲硝唑 500μl (最终为 5mg/ml), vancocycin 为 25μl (最终为 2.5 mgmml), 水为325μl。使用前准备新鲜的鸡尾酒。
- 将抗生素混合装入无菌的1毫升注射器中, 并固定适当的量具灌胃针 (15-20 克小鼠 20 g), 同时消除任何气泡。
- 配有200μl 抗生素混合的 gavage 小鼠。
- 牢牢抓住老鼠肩膀上的皮肤, 伸展头部和颈部, 拉直食道。沿嘴顶和咽部后部方向引导进料针的球尖。然后, 轻轻地将其传递到食道中, 并注入200μl 溶液。
- 在实验期间, 每天服用一次抗生素鸡尾酒。
- 饮用水中的抗生素
注意: 在饮用水中使用抗生素的前两周, 每天仔细监测小鼠体重。- 在1升的蒸压水中溶解以下药物, 准备一种抗生素混合物: 1 克氨基青霉素 (1 gl 最终), 1 克 neomycin (1 gl 最终), 1 克甲硝唑 (1 gl 最终), 0.5 克 vancomycin (0.5 gl 最终) 和8袋 (每个0.75 克) 人造甜味剂 (60 克/最终)。摇一摇, 直到溶解。存放在4°c。
注: 添加甜味剂, 以隐藏抗生素的味道, 并防止小鼠脱水。虽然几个甜味剂品牌可能有效, 但每个特定品牌所需的最终浓度可能不同。 - 将抗生素鸡尾酒放入水瓶 (~ 100 ml/瓶) 中, 然后将瓶子放在鼠笼上。
注: 使用棕色瓶子或用铝箔覆盖瓶子, 以保护抗生素免受光线的影响。 - 在实验期间, 每周两次用新鲜的原料取代抗生素鸡尾酒。
- 在1升的蒸压水中溶解以下药物, 准备一种抗生素混合物: 1 克氨基青霉素 (1 gl 最终), 1 克 neomycin (1 gl 最终), 1 克甲硝唑 (1 gl 最终), 0.5 克 vancomycin (0.5 gl 最终) 和8袋 (每个0.75 克) 人造甜味剂 (60 克/最终)。摇一摇, 直到溶解。存放在4°c。
2. 从粪便、含油量和岩壁收集粪便样品
- 重量和标签2毫升高压灭菌管的样品收集。
- 为了收集新鲜的粪便样本, 将每只老鼠放入约束器中, 并直接从肛门中收集粪便颗粒。
注: 也可以通过将老鼠放在干净的蒸压笼中, 用干净的灭菌钳收集大便样本来获得样品。 - 用 co2 窒息对小鼠进行安乐死, 然后进行宫颈脱位。
- 将鼠标尸体放置在腹部完全暴露的情况下, 用70% 乙醇喷洒腹部。
- 使用消毒钳和剪刀, 在腹部做一个横向切口, 以暴露腹膜, 而不会损坏任何内部组织。提起腹膜, 做一个切口, 露出肠子。
- 用钳子和剪刀取出肠子 (从结肠到胃), 并将其放入无菌的 petri 培养皿中。
- 小心使用钳子将小肠 (si) 从肠系膜动脉和脂肪中移开。伸展肠道, 并把它放在一个干净的实验室擦拭。
- 用尺子测量和切割 si (最接近塞子的部分) 的远端回肠4厘米。切割和丢弃盲肠近端的1厘米的肠子。将有一个3厘米的部分回肠将用于收集肠道细菌。
- 将回肠部分 (3 厘米) 固定在2毫升的无菌管上。通过直接挤压肠道并将样品收集到试管中, 收集肠道内容。这个样本将含有来自回肠含量的细菌。
- 准备一个20毫升的注射器与冷磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 和冲洗回肠部分 (丢弃流动)。
- 将回肠部分放在干净的纸巾上, 用剪刀纵向打开。
- 用手术刀刮伤回肠墙的内部。
- 收集手术刀上的任何细菌, 用1毫升的 pbs 在干净的离心管上清洗手术刀。以 8, 000xg旋转5分钟, 将细菌颗粒状, 并丢弃上清液。这个样本将含有回肠壁的细菌。
注: 粪便、回肠含量和壁面的粪便样品可冷冻并储存在-80°c, 直至使用。 - 称量含有粪便和回肠含量样品的管, 并从空管中减去重量 (从步骤 2.1) 中减去, 以获得每个样本中的粪便重量。
- 使用市售试剂盒从粪便、回肠含量和回肠壁样品中提取细菌 dna。将 dna 样本存放在-20°c, 直至使用。
3. qpcr 对肠道微生物区系进行定量
注: 此过程包括生成标准 (步骤 3.1) 和标准和粪便样本的 qpcr 设置方法 (步骤 3.2)
- qpcr 标准的生成
- 利用聚合酶链反应 (pcr), 利用表1中详述的试剂13和 pcr 条件, 从细菌培养中提取的基因组 dna 中扩增 16s rrna 基因。
- 在1.5% 琼脂糖凝胶上运行 pcr 产品, 并使用市售 dna 提取试剂盒纯化 dna 带。
- 使用克隆试剂盒将纯化后的 dna 片段结扎 (见《材料表》, 使用含有抗生素耐药标记的载体和β-半乳糖苷酶 (lacz) 基因融合进行蓝/白色菌落选择), 并将 dh10 转化为合格的 dh10按照制造商的说明进行大肠杆菌。板材转化为氨基青霉素 (100μg/ml), x-gal (20μg/ml) luria bertani (lb) 琼脂板 (10 gml 色拉坦, 5 gl 酵母提取物, 10 gml ncl, 15 gl 琼脂)。在37°c 下隔夜孵化 (on)。
- 从板材中选择一个正 (白色) 菌落。在含有100μgml 氨基青霉素的5毫升 lb 肉汤中接种, 在37°c 下孵育 obe, 在250转/分的情况下晃动。
- 从 on 培养中, 根据制造商的说明, 使用商用微型制备试剂盒分离和纯化质粒。
注: 重要的是要在这个阶段对质粒插入进行排序, 以确保质粒只包含 16s rrna 基因的一个副本, 并以基对 (bp) 确定其长度。 - 用限制性酶对质粒进行线性化, 该酶只将质粒切掉一次。
- 使用市售试剂盒纯化线性化质粒。
- 利用分光光度计测量260纳米的吸收率, 测定质粒的浓度。
- 使用以下公式14计算样品质粒的数量:
份数= (数量* 6.0 22x1023)/(长度* 1x109 * 650)
其中数量是在步骤 3.1.8 (ngμl) 中获得的 dna 浓度;和长度是质粒的总长度 (与插入) 在 bp。副本的数量将以副本的方式获得。
注: 有基于上述公式的在线工具, 可以轻松计算质粒副本的数量。 - 在-20°c 的温度下, 根据需要将标准储存至使用前。
- 标准样品和粪便样品的 qpcr 设置
- 在冰上解冻 qpcr 标准 (从步骤 3.1.10)、粪便样本 dna (从步骤 2.15) 和 qpcr 试剂 (从市售试剂盒)。
注: 本例中使用的 qpcr 试剂包括 sybr 绿色 qpcr 反应混合物以及正向和反向引物 (表 2)。 - 在无菌无 dna 水中稀释标准, 范围为 107 至10 2 铜(例如,从 107 到 6.4 x 10 铜的连续稀释从 10 7 到 6.4 x10铜)。稀释粪便样本 dna 到半, 半, 半.
- 对反应总数加1进行主混合反应 (表 2)。
- 混合30μl 的主混合和5μl 的模板 (标准, 样品或水的负控制)
- 在384口井的光学 qpcr 板中, 将这种混合物的10μl 添加到每口井中。执行每个反应一式三份。
- 密封 qpcr 位置, 短暂地离心并将板材加载到 qpcr 机器上, 其循环条件如下: 95°c 20分钟, 然后40个周期 95°c 15秒, 60°c, 1分钟。
- 获取标准和示例的 ct值。
- 通过绘制标准的 ct 值与质粒复制数的对数 (在步骤3.1.9 中计算) 来生成标准曲线。执行标准曲线的线性回归。
- 通过在标准曲线中插值 ct值 (在步骤3.2.2 中获得), 计算粪便样本的 16s rdna 拷贝数。
注: 应考虑到样品的稀释系数 (在步骤3.2.2 中制备)、被洗脱的最终体积核酸 (步骤2.15 中) 和粪便样本的数量 (在第2.15 步中计算), 应更正每个样品的 16s rdna 拷贝数, 以获得每克粪便的基因拷贝。
- 在冰上解冻 qpcr 标准 (从步骤 3.1.10)、粪便样本 dna (从步骤 2.15) 和 qpcr 试剂 (从市售试剂盒)。
Representative Results
在这里, 我们提供了两个替代方案的口服抗生素治疗小鼠。图 1显示了连续10天用口服灌胃 (红色) 或在饮用水 (蓝色) 中使用抗生素治疗的小鼠体重百分比 (与每种动物的原始基准线重量有关)。在接受口服灌胃抗生素的小鼠中没有发现明显的减肥。然而, 当小鼠在饮用水中使用抗生素和脂质进行治疗时, 它们在服用抗生素的头几天内就会减肥 (~ 10%), 但此后恢复正常体重增加 (图 1)。尽管如此, 在饮用水中接受抗生素的老鼠中, 约有5-10 的老鼠在治疗的第一周内可以达到 gt;20% 的体重减轻, 在这种情况下, 它们将被安乐死。
粪便样本中细菌的定量需要使用足够的标准曲线, 该曲线是通过绘制标准的复制编号日志 (在步骤3.2.2 中计算) 而不是从 qpcr (步骤 3.2.7) 获得的 ct 值获得的。图 2 a显示了标准曲线的一个代表性示例, 该曲线满足标准曲线性能标准, r2值为 0.99827, 斜率为-3.09, 效率 (-1 + 10^(-1/slope))*100) 为110%。r2值为 0.99, pcr 效率在90% 至110% 之间是首选。在线性范围内, 回归分析方程可以对粪便样本中的 16s rdna 丰度进行量化。图 2b显示了粪便粪便、si 含量和 si 壁中 16s rdna 拷贝的数量。在图2b 中, 数据显示为粪便粪便和 si 含量的粪便样本的 16s rdna 副本。对于 si 壁, 数据以从从3厘米的 si 壁回收的细菌中获得的 16s rdna 副本的总数 (因为起始材料的数量太小, 无法获得精确的重量)。
为评价抗生素对粪便样本中细菌密度的影响, 在抗生素治疗期间, 每天用口服灌胃对小鼠进行 10天 (第1至第10天) 的口服抗生素治疗, 并在抗生素治疗期间的不同时间点收集大便样本 (第5天和第10天), 停止抗生素使用后 7天 (第17天;图 3 a)。如图 3b所示, 抗生素治疗可使第5天和第10天检测到的粪便中 16s rdna 铜/的数量大幅下降, 而粪便中的细菌密度在1周后恢复到正常水平 (与预处理相当)抗生素管理被停止 (第17天)。
图 1: 抗生素的管理.老鼠连续 1 0天通过口服灌胃 (红色) 或在饮用水 (蓝色) 中接受抗生素治疗。plot 显示了在整个实验期间小鼠的体重相对于抗生素服用前的原始重量 (第0天)。数据显示为平均± sem. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:16s rrna 基因 qpcr 扩增标准和粪便样本.(a) 标准曲线与标准曲线描述符的线性回归。(b) 计算粪便样本中的基因丰度。数据显示为平均± sem. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 抗生素治疗过程中的粪便细菌.(a) 口服灌胃 (ab) 和样品采集的抗生素给药时间表示意图, 如 * 所示。(b) 在指定日期从小鼠粪便样本中每克粪便中复制 16s rdna。数据显示为平均± sem. 请点击这里查看此图的较大版本.
| 试剂 | 体积 | |
| Dna | 8μl | |
| 缓冲区10倍 | 2μl | |
| dntp (10mm) | 0.4μl | |
| 欧氏菌-f 底漆 (10 mm) | 1μl | |
| 欧氏菌-r 底漆 (10 mm) | 1μl | |
| taq Polimerase | 0.2μl | |
| h2o | 7.4μl | |
| 总成交量 | 20μl | |
| 底漆序列 | ||
| 欧氏菌-f 底漆 | 5 "作用 gggagcagcagcagt3" | |
| 欧氏菌-r 底漆 | 5 "attaccggctgctgctgc 3" | |
| 骑行条件 | ||
| 温度 | 时间 | 周期 |
| 94°c | 5分钟 | 1个 |
| 94°c | 30秒 | 30x |
| 60°c | 30秒 | 30x |
| 72°c | 1分钟 | 30x |
| 72°c | 5分钟 | 1个 |
| 4°c | ∞ | 1个 |
表 1: pcr 试剂和条件.此表提供了试剂和 pcr 循环条件, 以扩增细菌培养中的 16s rrna 基因, 从而生成用于 qpcr 检测的标准。引物序列最初由 kruglov等人出版.13岁
| 试剂 | 体积 |
| sybr 绿色主混料 (2倍) | 17.5μl |
| 欧氏菌-f 底漆 (10 mm) | 0.7 微米 |
| 欧氏菌-r 底漆 (10 mm) | 0.7 微米 |
| h2o | 11.1μl |
表2:qpcr 主混合物.所显示的体积 (最终体积 35μl) 是单样本在384井 qpcr 板上单片 (每片 10μl) 运行的 (移液误差额外增加 5μl)。数量可以根据要分析的样本数量进行放大。
Discussion
在这里, 我们提供了实验方案, 口服抗生素给小鼠和定量的粪便细菌的 qpcr。该协议中使用的抗生素组合 (含氨匹西林、庆大霉素、新霉素、甲硝唑和万古霉素) 针对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性菌, 对全系列细菌提供杀菌活性。口服灌胃和在饮用水中使用抗生素都能显著降低 5、6、12 的粪便细菌负荷。此外, 这两种治疗方法对小鼠的表型有深远的影响, 因为它们发展出几个典型的无菌小鼠特征, 包括脾脏大小缩小和湿疹扩大。抗生素给药的特定方法的选择可能取决于实验的长度, 因为口服灌胃方法需要每天服用抗生素, 因为这种方法需要更多的劳动密集型, 并可能对抗生素造成更多的不适。动物在长期。
对于饮用水中抗生素的使用, 必须谨慎使用在抗生素混合物中添加甜味剂, 因为这是防止小鼠脱水的关键因素。有几个小组已经证明, 在饮用水中使用抗生素 (不添加甜味剂) 是如何导致非常严重和迅速的减肥的, 所有的老鼠在实验的头几天都会失去20% 以上的初始体重,6. 在我们的协议中, 使用糖精基甜味剂似乎足以掩盖抗生素在水中的味道, 小鼠在服用抗生素后的头几天体重减轻, 但之后很快恢复了体重 (图 1)。尽管如此, 在我们的实验中, 5-10 的老鼠仍然达到了人类的终点, 基线体重下降了 gt;20, 需要安乐死。我们还测试了以蔗糖为基础的甜味剂, 这些甜味剂完全未能防止小鼠脱水 (100% 的老鼠体重下降, gt;20%), 而其他作者也公布了类似的基于天冬氨酸的甜味剂5,6的失败。除此之外, 还应考虑用于实验的小鼠的年龄、遗传背景和一般健康状况, 因为它们可能会在抗生素治疗过程中影响减肥和动物福祉。因此, 在口服抗生素的头两周内, 应每天对小鼠体重和一般健康状况进行仔细监测。
qpcr 方法为粪便样本中 16s rrna 的定量提供了一种快速且经济高效的方法。但是, 在这一技术方面应考虑一些限制, 包括: i) 对可靠的高质量标准的要求;(ii) qpcr 引物的设计和效率;iii) 微生物可能具有 16s rrna 基因的不同拷贝数, 因此基因拷贝可能不直接等于细胞计数 15。尽管如此, qpcr 是一种可靠和敏感的方法, 可以快速分析粪便样本。这种方法可以是特别有用的快速验证各种治疗 (包括抗生素) 在粪便细菌负荷的效果, 详见此处。此外, 尽管我们提供了一个对总数 16s rrna 进行量化的协议, 但这种方法可以很容易地进行调整 (通过设计特定引物16), 以便能够识别单个细菌分类群, 从而提供定量和关于微生物群大小和组成的定性信息。
总之, 我们为小鼠口服抗生素治疗提供了两种方案, 并提供了一种基于 qPCR-based 的方法来量化抗生素引起的粪便细菌的变化。虽然这些方案可以根据个别实验需要进一步优化并与其他方法结合起来, 但它们可以作为快速、具有成本效益和可靠的工具来操纵小鼠肠道微生物群和研究其效果在肠道稳态和疾病中的抗生素治疗。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由联合王国医学研究委员会资助 (赠款给 p. b. mr/mr815");r. j. 得到了玛丽·居里欧洲内部研究金 (h2020-msca-if-2015-703639) 的支持;p. m. b. 得到了英国医学研究理事会和伦敦国王学院生物医学博士培训伙伴关系 (mrmr/n013001) 的学生支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich (Merck) | A9518 | |
| Neomycnin trisulfate salt hydrate | Sigma-Aldrich (Merck) | N1876 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich (Merck) | M3761 | |
| Vancomycin hydrochloride | Sigma-Aldrich (Merck) | V2002 | |
| Gentamicin sulfate salt | Sigma-Aldrich (Merck) | G3632 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich (Merck) | T7293 | |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich (Merck) | Y1625 | |
| NaCL | Sigma-Aldrich (Merck) | S7653 | |
| Sweetener Sweet'n Low | Sweet'N Low | Available in the UK from Amazon.co.uk | |
| X-Gal (5-brom-4-chloro-3-indoyl B-D-galactopyranoside) | Fisher scientific | 10234923 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 10010023 | |
| Ultrapure Agarose | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 16500500 | |
| RT-PCR grade water | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | AM9935 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725124 | with ROX |
| TOPO TA cloningTM for sequencing | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 450030 | |
| QIAamp fast DNA Stool mini kit | Qiagen | 51604 | |
| QIAprep spin Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Syringe filter 0.45 µm | Fisher scientific | 10460031 | |
| Swann-MortonTM Carbon steel sterile scalpel blades | Fisher scientific | 11792724 | |
| Syringe (1 mL) | BD Plastipak | 303172 | |
| Syringe (20 mL) | BD Plastipak | 300613 | |
| 1.5 mL Crystal clear microcentriguge tube | StarLab | E1415-1500 | |
| 2 mL Ultra high recovery microcentrifuge tube | StarLab | I1420-2600 | |
| Oral dosing needles 20 G x 38 mm curved (pk/3) | Vet-Tech | DE008A | |
| Sterilin petri dish 50 mm | Scientific Laboratory Supplies | PET2020 | |
| Absolute qPCR plate seals | Thermo Fisher Scientific | AB1170 | |
| MicroAmpTM optical 384-well plate | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | 4309849 | |
| ViiA7TM 7 real-time PCR system with 384-well block | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | 4453536 | |
| Spectrophotometer (Nanodrop 1000) | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | |
| Labnet Prism microcentrifuge | Labnet | C2500 | |
| MultiGene Optimax Thermal cycler | Labnet | TC9610 |
References
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