Isolasjon, fiksering og Immunofluorescence avbildning av musen binyrene
Summary
Her presenterer vi en metode for å isolere binyrene fra mus, fikse vev, del dem og utføre immunofluorescence flekker.
Abstract
Immunofluorescence er en veletablert teknikk for påvisning av antigener i vev med ansettelse av fluorochrome-konjugerte antistoffer og har et bredt spekter av programmer. Påvisning av antigener gir karakterisering og identifikasjon av flere celletyper. Ligger ovenfor nyrer og innkapslet av en lag av mesenchymal celler, er binyrene en endokrine organ består av to ulike vev med forskjellige embryologiske opprinnelse, mesonephric mellomliggende mesoderm-avledet ytre cortex og den nevrale kam-avledet indre marg. Binyrebarken utskiller steroider (dvs. mineralkortikoider, glukokortikoider, sex hormoner), mens adrenal medulla produserer katekolaminer (dvs. adrenalin, noradrenalin). Mens drive adrenal forskning, er det viktig å kunne skille unike celler med ulike funksjoner. Her gir vi en protokoll utviklet i vårt laboratorium som beskriver en rekke sekvensielle trinn kreves for å få immunofluorescence flekker som karakteriserer i celletyper av det adrenalin kjortelen. Vi fokusere på Disseksjon av musen binyrene, mikroskopiske fjerning av periadrenal fett etterfulgt av fiksering, behandling og parafin innebygging av vev. Vi beskriver snitting av vev blokker med en roterende mikrotom. Til slutt, detalj vi en protokoll for immunofluorescent farging av binyrene som vi har utviklet for å redusere både ikke-spesifikke antistoffer bindende og autofluorescence for å oppnå en optimal signal.
Introduction
Immunohistochemistry er en teknikk for å oppdage vev komponenter med bruk av antistoffer mot bestemte mobilnettet molekyler og påfølgende flekker teknikker for å oppdage den konjugert antistoffer1. Denne immunohistochemical prosedyren krever bestemte fiksering og behandling av vev som bestemmes ofte empirisk for spesifikke antigen, vev og antistoff utnyttet2. Fixation er avgjørende for å bevare “originale” staten av vev og dermed opprettholde intakte mobilnettet og subcellular strukturer og uttrykk mønstre. Videre er behandling og innebygging prosedyrer pålagt å utarbeide vevet snitting i tynne skiver som brukes for histologic studier som involverer immunohistochemistry.
Immunostaining kan utføres med enten kromogent eller fluorescerende oppdagelsen. Kromogent oppdagelsen krever bruk av et enzym å konvertere et løselig substrat i en uløselig farget produkt. Mens dette enzymet kan være bøyd til antistoffer gjenkjenner antigen (primære antistoffer) er det oftere konjugert til antistoffer erkjenner det primære antistoffet (dvs., sekundær antistoffer). Denne teknikken er svært følsom; farget produktet som følge av den enzymatiske reaksjonen er photostable og krever bare et brightfield mikroskop for bildebehandling. Imidlertid kan kromogent immunostaining ikke være egnet når prøver å visualisere to proteiner som co Lokaliser, siden avsetning i én farge kan maskere avsettelsen av den andre. Ved co flekker, har immunofluorescence vist seg for å være mer fordelaktig. Ankomsten av immunofluorescence tilskrives Albert Svartfugl og kolleger, som har utviklet et system for å identifisere vev antigener med antistoffer merket med fluorescein og vise dem i inndelte vev under ultrafiolett lys3. Fluorescens gjenkjenning er basert på et antistoff konjugert med en fluorophore som sender ut lys etter eksitasjon. Fordi det finnes flere fluorophores med utslipp ved forskjellige bølgelengder (med ingen eller lite overlapp), denne oppdagelsen metoden er ideell for studiene i flere proteiner.
Binyrene er et par organ ligger over nyrene og preget av to embryologically forskjellige komponenter omgitt av en mesenchymal kapsel. Ytre binyrebarken, avledet fra det mesonephric mellomliggende mesoderm, utskiller steroidhormoner mens den indre margen, avledet fra neural toppen, produserer katekolaminer inkludert adrenalin, noradrenalin og dopamin. Binyrebarken er histologisk og funksjonelt delt i tre konsentriske soner, med hver sone sekresjon forskjellige klasser av steroidhormoner: ytre zona glomerulosa (zG) produserer mineralkortikoider som regulerer elektrolytt homeostase og intravascular volum; den midterste zona fasciculata (zF), utskiller direkte under zG, glukokortikoider som megle stressrespons gjennom mobilisering av energi butikker å øke plasma glukose; og de indre zona reticularis (zR), som syntetiserer sex steroid prekursorer (dvs. Dehydroepiandrosteron (DHEAS))4.
Noe variasjon i adrenocortical zonation finnes mellom arter: for eksempel Mus musculus mangler zR. Det unike postnatal X-sonen av M. musculus er rester av fetal cortex preget av små lipid-fattige celler med syre cytoplasms5. X-sonen forsvinner i puberteten i mannlige mus og etter det første svangerskapet i kvinnelige mus eller utarter gradvis i ikke-avlet kvinner6,7. Videre merket tortuosity og tykkelsen av zG utstillinger variasjon mellom arter som gjør organiseringen av eksterne stammen og stamfar celler i og ved siden av zG. Rotte, i motsetning til andre gnagere, har en synlig udifferensierte sone (zU) mellom zG og zF som fungerer som en stilk cellen sone eller en sone av forbigående forsterke progenitors. Om på zU er unik for rotter eller bare en mer fremtredende organisert klyngen av celler er ukjent8,9.
Celler av binyrebarken inneholder lipid dråper som lagrer kolesterol estere som tjener som forløperen til alle steroidhormoner10,11. Begrepet “steroidogenesis” definerer prosessen med produksjon av steroid hormoner fra kolesterol via en rekke enzymatiske reaksjoner som involverer aktiviteten til steroidogenic faktor 1 (SF1), hvis uttrykket er en steroidogenic potensial. I binyrene finnes Sf1 uttrykk bare i celler av cortex12. En interessant studie fant uttrykket av endogene biotin i adrenocortical celler med steroidogenic potensielle13. Mens dette kan være årsaken til høyere bakgrunn i biotin/streptavidin-baserte flekker metoder, på grunn av gjenkjenning av endogene biotin av antistoff konjugert med streptavidin, kan denne karakteristiske brukes også til å skille de steroidogenic celler fra andre populasjoner i binyrene, dvs. endothelial, capsular og forlengede celler.
Innerveres av sympatiske preganglionic nerveceller, er adrenal medulla preget av basophilic celler med en detaljert cytoplasma som inneholder adrenalin og noradrenalin. Forlengede celler kalles “chromaffin” på grunn av det høye innholdet av katekolaminer som danner en brun pigment etter oksidering14. Tyrosin hydroksylase (TH) er enzymet som gir hastighetsbegrensning trinnet i syntesen av katekolaminer og i binyrene, uttrykkes bare i medulla15.
Her presenterer vi en protokoll for isolering av musen binyrene, deres behandling for innebygging i parafin snitting og en metode for å utføre immunofluorescence flekker på adrenal deler for å identifisere hvilke mobilnettet utgjør den binyrebarken og forlengede. Denne protokollen er en standard i vårt laboratorium for immunostaining med flere antistoffer rutinemessig brukes i vår forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver en metode for isolering av musen binyrene sammen med utarbeidelse og flekker av appa parafin-innebygd mus binyrene.
Sammenlignet med andre protokoller vi testet, har denne immunofluorescence protokollen bevist egnet for fleste av antistoffer i vårt laboratorium. I enkelte tilfeller kan det imidlertid krever noen justeringer for å forbedre flekker resultatene. En variabel som lett kan endres og testet er lengden på fiksering. I vårt laboratorium, inkubasjon i 4% …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Mohamad Zubair for hans forslag og teknisk assistanse i etableringen av denne protokollen. Dette arbeidet ble støttet av National Institute Diabetes og fordøyelsesenzymer og nyre sykdommer, nasjonale institutter for helse Research Grant 2R01-DK062027 (til G.D.H).
Materials
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co. | 0412B | |
| Disposable needles 25Gx5/8" | Exel International | 26403 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Paraplast plus | McCormik scientific | 39502004 | Paraffin for tissue embedding |
| Shandon biopsy cassettes II with attached lid | Thermo scientific | 1001097 | Cassettes for tissue processing |
| High Profile Microtome Blades | Accu-Edge | 4685 | Disposable stainless steel blades |
| Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds | Polysciences Inc. | 18986 | Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | 75x25x1 mm |
| Xylene | Fisher Chemical | X5P1GAL | |
| 200 Proof Ethanol | Decon Labs, Inc. | ||
| Certi-Pad Gauze pads | Certified Safety Mfg, Inc | 231-210 | 3"x3. Sterile latex free gauze pads |
| M.O.M kit | Vector laboratories | BMK-2202 | For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue |
| KimWipes | Kimtech | 34155 | Wipes 4.4×8.4 inch |
| Super PAP PEN | Invitrogen | 00-8899 | Pen to draw on slides |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544-D | Size: 22x50x1.5 |
| DAPI | Sigma | D9542 | (Prepared in 20mg/mL stock) |
| ProLong Gold antifade reagent | Molecular Probes | P36930 | Mounting agent for immunofluorescence |
| X-cite series 120Q | Lumen Dynamics | Light source | |
| Coolsnap Myo | Photometrics | Camera | |
| Optiphot-2 | Nikon | Microscope | |
| microtome | Americal Optical | ||
| Tissue embedder | Leica | EG1150 H | |
| Tissue processor | Leica | ASP300S | |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-TH | Millipore | MAB318 | Primary antibody |
| Rabbit anti-SF1 | Ab proteintech group (PTGlabs) | custom made | Primary antibody |
| Alexa-488 Mouse IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Secondary antibody |
| Dylight-549 Rabbit IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 111-505-003 | Secondary antibody |
| Citrate acid anhydrous | Fisher Chemical | A940-500 | |
| NIS-Elements Basic Research | Nikon | Software for imaging |
References
- Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
- Yates, R., et al. Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease. Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).
- Jones, I. C. Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory. Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53 (1948).
- Sucheston, M. E. C., Samuel, M. The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland. The Ohio Journal of Science. 72, 120-126 (1972).
- Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).
- Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling. Frontiers in Endocrinology. 6, 27 (2015).
- Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. Lipid droplets and steroidogenic cells. Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).
- Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. Hedgehog signaling and steroidogenesis. Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Lowe, J., Anderson, P. . Stevens & Lowe’s Human Histology, 4th Edition. , 263-285 (2015).
- Nagatsu, T. Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes. Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).
- Berthon, A., et al. Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function. Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).
- Brown, C. Antigen retrieval methods for immunohistochemistry. Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).
- Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
- Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins. Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 28 (2017).
- Watson, J. Suppressing autofluorescence of erythrocytes. Biotechnic & Histochemistry. 86 (3), 207 (2011).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
