यहाँ, हम कैसे छोटे कोण एक्स-रे कैटरिंग (SAXS) macromolecular संरचनाओं का प्रतिनिधित्व कम संकल्प लिफाफे पर जानकारी प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जा सकता वर्तमान. जब इस तरह के एक्स-रे क्रि और परमाणु चुंबकीय अनुनाद के रूप में उच्च संकल्प संरचनात्मक तकनीक के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया, SAXS में समाधान multidomain प्रोटीन और macromolecular परिसरों में विस्तृत अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं ।
प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत एकाधिक गोलाकार डोमेन के साथ प्रोटीन शामिल कैसे इस तरह के परिसरों के रूप में निर्धारित करने के लिए तकनीकी चुनौतियों वर्तमान और कैसे डोमेन उंमुख/ यहां, elucidating जो विशिष्ट डोमेन के लिए क्षमता के साथ एक प्रोटोकॉल multicomponent प्रणाली में अटल बिहारी initio मॉडलिंग के माध्यम से बातचीत की मध्यस्थता वर्णन किया गया है । अणुओं और उनकी विधानसभाओं के समाधान संरचनाओं की गणना के लिए एक विधि प्रदान की गई है जिसमें छोटे कोण X-ray कैटरिंग (SAXS), क्रोमैटोग्राफी, और एक हाइब्रिड approach में एक साथ परमाणु रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं से डेटा समेकित करना शामिल है । एक विशिष्ट उदाहरण है कि पूर्ण लंबाई nidogen-1 के परिसर की है, जो extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन और रूपों एक विस्तारित, घुमावदार nanostructure इकट्ठे । इसके गोलाकार डोमेन में से एक laminin γ-1 को अटैच करता है, जो बेसमेंट झिल्ली की संरचना करता है । यह लचीला multidomain प्रोटीन परिसरों की सटीक संरचनाओं का निर्धारण करने के लिए एक आधार प्रदान करता है और सिंक्रोट्रॉन स्वचालन रोबोटिक्स और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी प्रणालियों के साथ युग्मित स्रोतों द्वारा सक्षम है । इस संयोजन में तेजी से विश्लेषण की अनुमति देता है जिसमें कई oligomeric राज्यों सिर्फ SAXS डेटा संग्रह से पहले अलग कर रहे हैं । विश्लेषण परिचलन, कण आयाम, आणविक आकार और डोमेन बाँधना की त्रिज्या पर जानकारी पैदावार । घटक प्रोटीन की उच्च संकल्प संरचनाओं फिटिंग द्वारा परिसरों के 3d मॉडल पैदा करने के लिए प्रोटोकॉल भी दिया जाता है ।
कोशिकाओं प्रोटीन के जटिल नेटवर्क है कि आणविक मशीनों के रूप में काम करने के लिए इस तरह के कैस्केडिंग संकेतन और संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने के रूप में सेलुलर कार्य शामिल हैं । तरीके में इन विभिंन घटकों चाल और तीन आयामी अंतरिक्ष में बातचीत अणुओं के विशिष्ट कार्यों को जंम देता है । प्रोटीन संरचना, गतिशीलता, और समारोह के निर्धारण में बातचीत के महत्व को लगातार विकसित करने के लिए की जरूरत है, जटिल तकनीक इन गुणों को मापने के लिए प्रदान की गई है । इनमें से, नाभिकीय चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर), एक्स-रे क्रि (XRC) और अधिक हाल ही में, क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (CEM) उच्च संकल्प संरचनात्मक जानकारी प्रदान करते हैं । हालांकि, XRC और CEM कई आणविक राज्यों में से एक की उपज संरचनाओं और प्रोटीन संरचना की गतिशीलता के बारे में जानकारी की कमी है, जबकि 3 डी एनएमआर द्वारा संरचना निर्धारण आमतौर पर छोटे गोलाकार प्रोटीन के लिए सीमित है । इन सीमाओं को दूर करने के लिए एक रास्ता छोटे कोण एक्स-रे कैटरिंग (SAXS) का उपयोग करने के लिए बड़े, multidomain, या जटिल प्रणालियों के आणविक लिफाफे उत्पंन है, और उच्च संकल्प कठोर macromolecular संरचनाओं गठबंधन के लिए वैश्विक स्पष्ट वास्तुकला और गतिशील सुविधाओं ।
SAXS लगभग 10-20 Å 1के एक संकल्प के साथ macromolecular परिसरों के कम संकल्प लिफाफे पैदा करता है, न केवल संरचना में अंतर्दृष्टि दे लेकिन यह भी गतिशील विशेषताओं है कि जटिल प्रदर्शित करता है । हालांकि SAXS एक्स-रे का इस्तेमाल आणविक संरचना को उजागर करने के लिए, यह XRC के विपरीत है कि समाधान में कणों के यादृच्छिक आइसोट्रोपिक उंमुखीकरण विवर्तन करने के लिए नेतृत्व नहीं करता है, बल्कि तितर बितर करने के लिए, जो परमाणु संकल्प उपज नहीं कर सकते । इसके बजाय, macromolecule का एक इलेक्ट्रॉन “लिफ़ाफ़ा” उत्पन्न होता है जो कि macromolecule को प्रदर्शित करने वाले अनुरूपता के औसत का प्रतिनिधित्व करता है. यह जानकारी पहले हल परमाणु संकल्प संरचनाओं के सीधे फिटिंग में इस्तेमाल किया जा सकता है एक प्रोटीन या उप इकाई संगठन में लचीलापन के क्षेत्रों का अनुमान, या गतिशीलता में एक बड़ा, बहु-प्रोटीन जटिल । SAXS डेटा उच्च ऊर्जा रंग एक्स-रे या से घर में सूत्रों का उपयोग कर synchrotrons पर एकत्र किया जाता है, जो एक कमजोर एक्स-रे स्रोत के बजाय घंटे की आवश्यकता नमूना जोखिम समय के सेकंड (चित्रा 1) प्रदान करते हैं । SAXS डेटा अक्सर एक प्रायोगिक सेटअप और बफर के साथ कई नमूनों से एकत्र की है, एक विस्तारित समय की आवश्यकता के लिए एक प्रणाली पर उपयोगी डेटा का एक चक्कर इकट्ठा । नमूनों, इसलिए होना चाहिए स्थिर और गैर-एकत्रीकरण के लिए कुछ ही घंटे के आधार पर सत्यापित करने योग्य गुणवत्ता नियंत्रण विधियों जैसे डायनामिक लाइट कैटरिंग (DLS) और/या विश्लेषणात्मक ultracentrifuge (ईमेज) विश्लेषण उच्च-गुणवत्ता SAXS डेटा प्राप्त करने के लिए2 , 3. यहां हम SAXS का एक व्यावहारिक वर्णन प्रदान करते हैं, इसके उपयोग, लाभ, सीमाएं और नमूना तैयारी के पीछे सिद्धांतों और डेटा संग्रह और विश्लेषण पर भारी ध्यान केंद्रित, के साथ पर संक्षेप में छू के साथ एबी initio मॉडलिंग का उपयोग extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन nidogen-1 और laminin γ-1 एक प्रायोगिक उदाहरण के रूप में ।
SAXS के सिद्धांत, लाभ और सीमाएं:
SAXS के पीछे मार्गदर्शक सिद्धांत (ओं) अपेक्षाकृत सरल है: ब्याज की macromolecule (ओं) के monodispersed तैयारी का एक समाधान एक केशिका के भीतर रखा जाता है और एक उच्च ऊर्जा रंग एक्स-रे बीम के संपर्क में है । फोटॉनों परमाणु खोल के इलेक्ट्रॉनों के कारण दोलन शुरू करने के लिए, एक गोलाकार लहर में जिसके परिणामस्वरूप एक ही ऊर्जा और तरंग दैर्ध्य उत्सर्जित किया जा रहा है । के बाद से हर इलेक्ट्रॉन दोलन, एक निरंतर पृष्ठभूमि प्राप्त होगा, और macromolecule के परिणामस्वरूप इलेक्ट्रॉन घनत्व पृष्ठभूमि के विपरीत है । जिसके परिणामस्वरूप कैटरिंग तीव्रता कैटरिंग कोण, 2Θ (चित्रा 1) के एक समारोह के रूप में एकत्र किया जाता है.
जबकि अंय तकनीकों जैसे XRC, एनएमआर, और CEM परमाणु स्तर पर संरचनात्मक जानकारी प्रदान करते हैं, वहां SAXS करने के लिए कई लाभ है कि अंय तकनीकों प्रदान नहीं कर सकते हैं । SAXS लगभग किसी भी बफर में प्रदर्शन किया जा सकता है और किसी भी विशेष नमूना तैयारी की आवश्यकता नहीं है । इस तरह की उपस्थिति या मोनो की अनुपस्थिति या divalent cations या पीएच4,5में परिवर्तन के रूप में बदलती शर्तों के तहत अणुओं के व्यवहार और संरचना का अध्ययन करने में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । SAXS के लिए एक macromolecule6के लचीले क्षेत्रों के बारे में जानकारी प्रदान करने की क्षमता है, कुछ अंय सूचीबद्ध तकनीक के साथ संघर्ष कर सकते हैं । इसलिए, SAXS एक मजबूत मानार्थ तकनीक के रूप में एक macromolecule के स्थिर भागों XRC, एनआरएम या CEM के साथ अध्ययन किया जा रहा है के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और पूरे macromolecule या जटिल SAXS के साथ कम संकल्प में विश्लेषण और विभिंन विश्लेषण उपकरण का उपयोग कर संयुक्त ऐसे महापालिकेच्या FoXSDock७ या CRYSOL८. चूंकि SAXS एक समाधान तकनीक है, यह अक्सर पुष्टि करने के लिए उपयोग किया जाता है, तो ऐसे XRC से प्राप्त उन के रूप में स्थैतिक संरचनाओं समाधान6में संगत कर रहे हैं । SAXS भी एक तकनीक है कि नमूना निवेश की एक अपेक्षाकृत छोटी राशि (आमतौर पर 50-100 µ एल) और प्रयोग समय की एक अपेक्षाकृत छोटी राशि (30 मिनट-1 ज) की आवश्यकता होने का फायदा है ।
SAXS की सबसे बड़ी सीमा नमूना एकत्रीकरण और/या गिरावट, जो गलत संरचनात्मक भविष्यवाणियों के लिए नेतृत्व कर सकते है के लिए भेद्यता है । एक एकत्रीकरण, 5% के रूप में भी कम के रूप में, बहुत अधिक मात्रा में प्रकाश तितर बितर कर सकते हैं, अधिकतम कण आयाम (डीमैक्स) और परिचलन (आरजी) के त्रिज्या के एक अनुमान के लिए अग्रणी । दूसरी ओर, नमूना गिरावट आणविक संपत्तियों की एक मूल्यवान समझना करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इस भेद्यता एक औसत तकनीक है, जिसका अर्थ है कि नमूना एकरूपता विश्वसनीय और reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है जा रहा है SAXS से उठता है । किसी भी नमूना है कि SAXS द्वारा विश्लेषण किया जाना चाहिए है, इसलिए, इस तरह के denaturing और देशी जेल ट्रो, आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी, गतिशील प्रकाश बिखरने, और विश्लेषणात्मक के रूप में शुद्धि और सजातीयता की जांच, के कई तरीकों से गुजरना ultracentrifugation । अक्सर, SAXS beamlines SAXS (S-SAXS)3,9से पहले एक अंतिम गुणवत्ता नियंत्रण चरण के रूप में उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से नमूने चलेंगे । SAXS डेटा एकाधिक सांद्रता पर एकत्र किया जाना चाहिए और प्रत्येक डेटा सेट के आरजी तुलना की जानी चाहिए, एक करीबी समानता सुनिश्चित करने के लिए कण बातचीत और एकत्रीकरण, जो कण के एक अनुमान में परिणाम से बचने के लिए आयाम, गलत डेटा विश्लेषण और मॉडलिंग के लिए अग्रणी । तितर बितर के बाद से दोनों एकाग्रता और आकार पर निर्भर करता है, छोटे अणुओं एकाग्रता रेंज के एक अधिक विशिष्ट अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है । इस पारस्परिकता प्रमेयके कारण है, जहां बड़े आकार बड़े कोणों की ओर छोटे कोणों और छोटे आकार की ओर तितर बितर । यह डेटा संग्रह में प्रकट होता है, जहां मैंओ आर6के लिए आनुपातिक है, जहां आर कण त्रिज्या है । SAXS की एक अंतिम सीमा जोखिम के दौरान नमूने के लिए विकिरण क्षति के लिए क्षमता है, जो डेटा की विकृति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । यह अच्छा अभ्यास से पहले और बाद नमूना गुणवत्ता की तुलना करने के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए SAXS नमूना जोखिम उत्पंन नहीं हो रहा है ।
इस काग़ज़ के प्रोटोकॉल अनुभाग में उल्लिखित SAXS डेटा विश्लेषण के महत्वपूर्ण चरणों में बफ़र घटाव, Guinier विश्लेषण, Kratky विश्लेषण, डेटा मर्जिंग और P (r) बंटन शामिल हैं । अटल बिहारी initio मनका मॉडलिंग भी विस्तार से यहां कवर किया जा व्यापक है और इसलिए केवल संक्षेप में शामिल है ।
synchrotrons पर (उदा. जर्मनी में DESY, ब्रिटेन और फ्रांस में ESRF में डायमंड), यह एक बहुत छोटे अंश के लिए SAXS डेटा एकत्र संभव है (~ कुछ µ l) प्रत्येक नमूने के रूप में अंशों से कनेक्टेड है s स्तंभ से eluted किया जा रहा है लाइन (देखें चित्रा 1 ). लोचदार बिखरे हुए SAXS डेटा साधन निर्माता द्वारा या बफर घटाव जगह ले जा सकते हैं पहले सिंक्रोट्रॉन द्वारा प्रदान की संकुल का उपयोग कर औसत है । जिसके परिणामस्वरूप 1 डी डेटा बिखरे हुए प्रकाश की मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है ( मैं(क्यू)) Y-अक्ष और कैटरिंग कोण पर (q= 4πsinθ/λ, जहां λ घटना एक्स-रे की तरंग दैर्ध्य है) और चित्रामें उल्लिखित है । प्रोग्राम प्राइमस/क्यूटी12 सीधे बफ़र के कारण किसी भी पृष्ठभूमि को घटाना और खंड १.१ में वर्णित करने के लिए उपयोग किया जाता है । अंय प्रोग्रांस जैसे; ScÅtter४३ ( www.bioisis.netपर उपलब्ध डाउनलोड) एक ट्यूटोरियल https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeAपर उपलब्ध है, और bioXtas कच्चे४४ के साथ ( https://पर उपलब्ध bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html) ATSAS पैकेज के लिए एक विकल्प के रूप में उपयोग किया जा सकता है ।
Guinier विश्लेषण नमूना एकत्रीकरण और समरूपता पर जानकारी प्रदान करता है और साथ ही कम एस क्षेत्र14से SAXS डेटा के आधार पर ब्याज की macromolecule के लिए परिचलन (आरजी) की त्रिज्या प्रदान करते हैं । एक भूखंड प्राइमस/क्यूटी के साथ प्रत्येक एकाग्रता से प्राप्त SAXS डेटा के लिए, अप करने के लिए १.३० तक की अधिकतम सीमा के साथ वक्र फिटिंग के बाद का निर्माण किया है q x Rg। एक monodispersed नमूना तैयारी इस क्षेत्र (चित्रा 2d) में एक रैखिक Guinier भूखंड प्रदान करना चाहिए, जबकि एक रैखिक Guinier भूखंड15,16में एकत्रीकरण परिणाम. यदि Guinier विश्लेषण रैखिक है, ब्याज की एक macromolecule की “unfolded” की डिग्री Kratky भूखंड, जो कि कठोर शरीर मॉडलिंग प्रदर्शन या कम संकल्प मॉडल के पहनावे का निर्माण करने के लिए तय करते समय उपयोगी है के साथ मनाया जा सकता है । एक गोलाकार प्रोटीन एक Kratky साजिश में दिखाई देगा एक घंटी के आकार का वक्र है, जबकि विस्तारित अणुओं या सामने आया पेप्टाइड्स पठार के लिए दिखाई देगा या भी बड़ा क्यू रेंज में वृद्धि और घंटी की कमी-आकार (चित्रा 2c) ।
Guinier विश्लेषण से Rg प्राप्त करना केवल 1 d तितर बितर भूखंड के कम q क्षेत्र से डेटा बिंदुओं पर विचार करता है (चित्रा 2d), तथापि, यह लगभग पूरे डेटासेट का उपयोग करने के लिए एक अप्रत्यक्ष रूपान्तर परिवर्तन करने के लिए संभव है एक वास्तविक अंतरिक्ष दूरी वितरण समारोह (पी(आर))है जो डीमैक्स और आरजी के बारे में जानकारी प्रदान करता है (क्यू) बनाम ln के पारस्परिक अंतरिक्ष जानकारी में परिवर्तित करने के लिए (चित्र b) P(r) भूखंड की आकृति18,19ब्याज की macromolecule के सकल समाधान अनुरूपता का प्रतिनिधित्व करती है । वास्तविक अंतरिक्ष डेटा के लिए पारस्परिक अंतरिक्ष डेटा का रूपांतरण एक महत्वपूर्ण कदम है, लेकिन एक विस्तृत विवरण इस पत्र के दायरे के भीतर नहीं है. इसलिए, प्रत्येक पैरामीटर को समझने के लिए20 Svergun द्वारा एक आलेख देखें ।
एक बार जब बफर व्यक्तिगत सांद्रता पर घटाया डेटा Guinier विश्लेषण के माध्यम से आरजीके लिए एक सुसंगत मूल्य के साथ संसाधित कर रहे हैं, उनके तह Kratky विश्लेषण का उपयोग कर पैटर्न की जांच के बाद, इन आंकड़ों को विलय किया जा सकता है । nidogen-1, laminin γ-1, और उनके परिसर के लिए मर्ज किए गए डेटा ऊपर वर्णित के रूप में संसाधित किया गया था और परिणामी P (r) प्लॉट चित्र 2 बीमें प्रस्तुत किए गए हैं । आदर्श रूप में, एक भी की गणना करना चाहिए जोड़ी दूरी वितरण समारोह पी (आर) प्रत्येक एकाग्रता के लिए निर्धारित करने के लिए यदि प्रत्येक एकाग्रता के लिए एकत्र SAXS डेटा इसी तरह आरजी और डीअधिकतम मान प्रदान करता है । यदि आरजी और डीमैक्स सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला के समान रहते हैं, तो उपयोगकर्ता को आगे बढ़ना चाहिए । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि संकेत के आधार पर, डेटा को मर्ज करने से पहले छोटा किया जा सकता है । यह अक्सर मामला है अगर सांद्रता और/या जांच के तहत अणुओं के आणविक वजन कम है ।
DAMMIN का उपयोग कर कम संकल्प आकार विश्लेषण विभिन्न मोड में किया जा सकता है (जैसे तेजी से, धीमी गति से, विशेषज्ञ मोड, आदि). फास्ट मोड अगर पी (आर) साजिश अच्छी गुणवत्ता मॉडल प्रदान करता है मूल्यांकन करने के लिए एक आदर्श पहला कदम है । आमतौर पर, कम 10 मॉडल प्रत्येक पी के लिए प्राप्त किया जाना चाहिए (r) भूखंड की जांच करने के लिए यदि reproducible परिणाम, कम संकल्प संरचना के संदर्भ में, प्राप्त कर रहे हैं, फिट पैरामीटर की एक कम अच्छाई के साथ χ बुलाया (0.5-1.0 का एक मूल्य हमारे व्यापक काम के आधार पर अच्छा माना जाता है ), एक मान जो कि प्रयोग किए गए SAXS डेटा और मॉडल-व्युत्पन्न डेटा के बीच एक अनुबंध का वर्णन करता है. प्रकाशन उद्देश्य के लिए, हम आमतौर पर धीमी या विशेषज्ञ मोड का उपयोग करें और कम से 15 मॉडल की गणना । DAMMIN के अलावा, यह की एक तेजी से संस्करण, DAMMIF३७, साथ ही GASBOR३८ भी विकल्प हैं । इसके अलावा, प्रोटीन प्रोटीन या प्रोटीन न्यूक्लिक एसिड परिसरों का अध्ययन करने के लिए, यह MONSA कार्यक्रम३५है, जो दोनों अणुओं के रूप में अच्छी तरह से अपने परिसर के लिए व्यक्तिगत SAXS डेटा के एक साथ फिटिंग की सुविधा का उपयोग संभव है । उच्च संकल्प मॉडल गणना के लिए के रूप में अच्छी तरह से आरएनए-प्रोटीन इंटरेक्शन स्टडीज के बारे में अधिक जानकारी के लिए, पटेल एट अल3द्वारा हाल ही के एक लेख को देखें ।
SAXS सैद्धांतिक रूप से सरल है, लेकिन निस्संदेह अंय संरचनात्मक जीव विज्ञान उपकरण और कम संकल्प संरचनात्मक डेटा है कि अपने आप में या उच्च संकल्प तकनीकों के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है स्पष्ट जानकारी में परिणाम के लिए एक उच्च पूरक विधि macromolecular संरचना और गतिशीलता के बारे में । जब तक अणुओं की एक monodispersed तैयारी और उनके परिसरों प्राप्त किया जा सकता है, SAXS में समाधान संरचना और जैविक macromolecule के किसी भी प्रकार की बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । यहां पर चर्चा की गई जटिल के मामले में, यह उल्लेखनीय है कि नाइट्रोजन-1 और laminin γ-1 के समग्र सुलभ सतह क्षेत्र के 10% से भी कम इस परिसर में दफन है, जबकि बाकी दोनों प्रोटीन के डोमेन के लिए स्वतंत्र रूप से अन्य के साथ बातचीत करने के लिए सुलभ हैं extracellular मैट्रिक्स में प्रोटीन अपनी संरचनात्मक कठोरता (चित्रा 3) को बनाए रखने के लिए । के साथ एक जटिल के लिए ऐसी जानकारी प्राप्त ~ 240kDa बहुत ऐसे एक्स के रूप में अंय संरचनात्मक जीवविज्ञान तकनीकों का उपयोग करना चुनौतीपूर्ण होगा रे क्रि, एनएमआर, और क्रायो-उंहें माइक्रोस्कोपी ।
एक्स-रे क्रि या एनएमआर के माध्यम से प्रोटीन संरचना का पर्दाफाश एक स्वाभाविक समय लेने वाली प्रक्रिया है । संरचना निर्धारण में यह अड़चन एक ऐसा क्षेत्र है जहां SAXS एक संरचनात्मक तकनीक के रूप में अपनी ताकत से पता चलता है; एकल SAXS प्रयोग के लिए डेटा प्राप्ति एक घंटे से कम समय में और सुव्यवस्थित विश्लेषण सॉफ़्टवेयर की सहायता से कर सकते हैं, विश्लेषण को शीघ्रता और कुशलता से किया जा सकता है. SAXS एक खड़े अकेले तकनीक के रूप में संरचनात्मक अध्ययन के प्रवाह को बढ़ाने के लिए बहुत क्षमता है क्योंकि यह उच्च संकल्प डेटा उपलब्ध है पहले macromolecular संरचना के एक कम संकल्प मॉडल प्रदान करता है । अंय संरचनात्मक तकनीक के लिए एक बाधा डेटा अधिग्रहण है, जो प्रोटीन अभिव्यक्ति और समय की एक लंबी अवधि में स्थिरता के एक उच्च स्तर आवश्यक के लिए एक उच्च शुद्ध, केंद्रित नमूना के लिए आवश्यकता है । जबकि SAXS नमूने भी शुद्ध और ध्यान केंद्रित करने की जरूरत है, नमूना मात्रा मोटे तौर पर कर रहे हैं १०० µ एल SAXS अन्य संरचनात्मक तकनीक की तुलना में विश्लेषण का एक अपेक्षाकृत सस्ती विधि बनाने. इसके अलावा, SAXS अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी आकार के साथ युग्मित तेजी से आम होता जा रहा है जो एक अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण कदम प्रदान करता है । हाल ही में वहां एनएमआर और SAXS के संयोजन में मजबूत अग्रिम किया गया है पहनावा अनुकूलन विधि (EOM)४५,४६ लचीला सिस्टम स्पष्ट के लिए उपयोग कर डेटा । Mertens और Svergun४७द्वारा हाल ही में एक पत्र में, लेखक एनएमआर के साथ संयोजन में EOM SAXS के कई हाल ही के उदाहरणों का वर्णन, SAXS के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है डेटा के अनेक अंय उदाहरणों के साथ साथ । अग्रिम लगातार SAXS के क्षेत्र में किया जा रहा है, और नई तकनीक SAXS के लिए विकसित किया जा रहा है के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा, न सिर्फ मानार्थ, अंय संरचनात्मक तकनीक । नतीजतन, हमें विश्वास है कि SAXS के लिए मांग केवल समय के साथ वृद्धि होगी, विशेष रूप से एनएमआर के साथ संयोजन के रूप में गतिशील सिस्टम जहां कार्यों लचीलापन द्वारा परिभाषित कर रहे है की विशेषताएं ।
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना NSERC RGPIN द्वारा समर्थित किया गया है-2018-04994, परिसर अलबर्टा नवाचार कार्यक्रम (आरसीपी-12-002C) और अलबर्टा Prion अनुसंधान संस्थान/अलबर्टा नवाचारों जैव समाधान (२०१६०००१८) अनुदान M.O. टीआरपी के लिए संमानित किया गया एक कनाडा में एक रिसर्च चेयर आरएनए और प्रोटीन (२०१७०४) भौतिकी और NSERC डिस्कवरी अनुदान (RGPIN-2017-04003) स्वीकार करता है । TM टीआरपी को NSERC डिस्कवरी अनुदान द्वारा वित्त पोषित है ।
HEK 293 EBNA Cell Line | In-Lab availability | – | Cell line used to overexpress protein(s) |
Ni Sepharose High Performance histidine-tagged protein purification resin | GE Healthcare | 17524801 | Affinity protein purification resin |
Superdex 200 Increase 10/300 | GE Healthcare | 28990944 | SEC Column |
ÄKTA Pure FPLC | GE Healthcare | – | FPLC System |
Nanodrop | Nanodrop | – | Spectrophotometer |
Basic Reagents (NaCl, Tris-HCl etc.) | |||
S-MAX3000 | Rigaku | – | SAXS Pinhole Camera System |
Zetasizer Nano-S | Malvern Instruments Ltd | – | Dynamic Light Scattering instrument |
0.1µm Filter | Millipore | JVWP04700 | Used to Concentrate Sample Prior to DLS |
Thrombin cleavage kit | abcam | ab207000 | Thrombin cleavage to remove His tag |
Strep-Tactin Sepharose Column | IBA | 2-1201-010 | Strep-Tag Affinity Purification |
D-desthiobiotin | Sigma-Aldrich | 533-48-2 | Elution of Strep Tag Protein |
Software | |||
SAXGUI | Rigaku | – | Data Collection for SAXS and data reduction |
ATSAS Suit | Franke et al., 2017 | – | SAXS Data Analysis Software program suite |
PRIMUS | Konarev et al., 2003 | – | Buffer Subtraction |
GNOM | Svergun, 1992 | – | Rg, Dmax and p(r) Calculation |
DAMMIF | Franke and Svergun, 2009 | – | Ab initio model calculation |
DAMAVER | Volkov and Svergun, 2003 | – | Averaged Solution Conformation calculations |
MONSA | Svergun, 1999 | – | Simultaneous model fitting for the complex |
GASBOR | Svergun et al., 2001 | – | Alternative Ab initio model calculations |
DTS Software V6.20 | Malvern Instruments Ltd | – | DLS supplied instrument software |
PyMOL | Schrodinger, LLC. | – | The PyMOL Molecular Graphics System V2.0 |
The Protein Data Bank | Berman et al., 2000 | – | PDB ID: 1NPE |