Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

الدراسات الهيكلية "للجزيئات الكبيرة" في الحل باستخدام "تبعثر الأشعة السينية زاوية صغيرة"

doi: 10.3791/58538 Published: November 5, 2018

Summary

نقدم هنا، كيف يمكن استخدام تشتت الأشعة السينية زاوية صغيرة (ساكسس) الحصول على معلومات عن مغلفات ذات الدقة المنخفضة تمثل هياكل الجزيئات. عندما تستخدم بالاقتران مع تقنيات الهيكلية ذات الدقة العالية مثل البلورات بالأشعة السينية والرنين المغناطيسي النووي، يمكن أن توفر ساكسس مفصلة ثاقبة multidomain البروتينات والجزيئات المجمعات في الحل.

Abstract

تفاعلات البروتين البروتين التي تنطوي على البروتينات مع عدة مجالات كروي تحديات تقنية لتحديد شكل مجمعات وكيف المجالات الموجهة نحو وضع. ويرد هنا، بروتوكولا مع إمكانية توضيح التفاعلات التوسط فيها مجالات محددة في نظام متعددة المكونات عن طريق النمذجة منذ البداية . أسلوب لحساب حل هياكل الجزيئات الكبيرة وتلك الجمعيات شريطة أن ينطوي على تكامل البيانات من تبعثر الأشعة السينية زاوية صغيرة (ساكسس) واللوني، وهياكل القرار الذري معا في نهج هجين. مثال محدد هو مجمع كامل طول نيدوجين-1، التي تجمع البروتينات المصفوفة خارج الخلية، ويشكل nanostructure الموسعة، منحنى. واحدة من المجالات كروي تولي laminin γ-1، الذي بني الغشاء. هذا يوفر أساسا لتحديد هياكل دقيقة من مجمعات البروتين multidomain مرنة ويتم تمكين بمصادر السنكروتروني مقترنة مع نظم التشغيل الآلي الروبوتيات، وحجم الاستبعاد اللوني. ويسمح هذا الجمع بين التحليل السريع الذي يتم فصل الدول oligomeric متعددة قبل جمع البيانات ساكسس. غلة التحليل المعلومات في دائرة نصف قطرها من gyration والبعد الجسيمات والشكل الجزيئي والمزاوجة بين المجالات. ويرد أيضا البروتوكول المتعلق بإنشاء نماذج ثلاثية الأبعاد للمجمعات بتركيب هياكل ذات الدقة العالية من البروتينات مكون.

Introduction

تحتوي الخلايا على شبكات معقدة من البروتينات التي تعمل كالآلات الجزيئية الاضطلاع بالوظائف الخلوية مثل إشارات الشلالات والحفاظ على السلامة الهيكلية. الطرق الذي نقل هذه العناصر المختلفة وتتفاعل في الفضاء ثلاثي الأبعاد يؤدي إلى المهام المحددة للجزيئات. وقدمت أهمية بروتين بنية وديناميات التفاعل في تحديد وظيفة الحاجة إلى تقنيات متطورة باستمرار، ومعقدة لقياس هذه الخصائص. هذه، "الرنين المغناطيسي النووي" (الرنين المغناطيسي النووي)، و "علم البلورات بالأشعة السينية" (XRC) وأكثر مؤخرا، Cryo-إلكترون مجهرية (جيم) تقديم المعلومات الهيكلية ذات الدقة العالية. ولكن XRC وجيم تسفر عن هياكل لواحدة من العديد من الدول الجزيئية البيولوجية وتفتقر إلى المعلومات حول الديناميات هيكل البروتين، بينما تصميم هيكل ثلاثي الأبعاد بالرنين المغناطيسي النووي يقتصر عادة على أصغر البروتينات كروي. إحدى الطرق للتغلب على هذه القيود استخدام صغيرة زاوية الأشعة السينية ونثر (ساكسس) إنشاء مغلفات الجزيئية للنظم الكبيرة أو multidomain الرصاصية، والجمع بين الهياكل الجزيئات الصلبة عالية الدقة لإلقاء الضوء على الصعيد العالمي الهندسة المعمارية والسمات الحيوية.

وتنتج ساكسس مغلفات منخفضة الدقة من مجمعات الجزيئات مع قرار من حوالي 10-20 1، يعطي البصيرة ليس فقط في الهيكل ولكن أيضا الخصائص الحيوية التي يعرض المجمع. على الرغم من أن ساكسس يستخدم الأشعة السينية للكشف عن التركيب الجزيئي، أنه على عكس XRC في هذا التوجه الخواص عشوائي للجسيمات في الحل لا يؤدي الحيود، وإنما نثر، الذي لا يمكن أن تسفر عن قرار الذرية. بدلاً من ذلك، يتم إنشاء إلكترون "المغلف" لجزيء ضخم يمثل في متوسط والتشكلات التي تعرض جزيء ضخم. يمكن أن تستخدم هذه المعلومات في تركيب هياكل القرار الذري سبق حلها مباشرة للاستدلال على مناطق من المرونة في البروتين وحيد أو منظمة فرعية، أو الديناميات في مجمع أكبر، والبروتين متعدد. يتم جمع بيانات ساكسس في سينتشروترونس باستخدام الأشعة السينية أحادية اللون ذات الطاقة العالية أو من مصادر داخلية، والتي توفر مصدر الأشعة السينية ضعيفة التي تتطلب ساعات بدلاً من الثواني من وقت التعرض للعينة (الشكل 1). غالباً ما يتم جمع بيانات ساكسس من عدة عينات بإعداد تجريبية واحدة والمخزن المؤقت، التي تحتاج إلى فترة طويلة لجمع جولة بيانات المفيدة عن نظام. عينات، ولذلك ينبغي مستقرة وغير تجميع لساعات قليلة على الأقل استناداً إلى أساليب مراقبة الجودة يمكن التحقق منها مثل تشتت الضوء الحيوي (DLS) و/أو تحليل ultracentrifuge التحليلية (AUC) للحصول على جودة عالية ساكسس البيانات2 , 3. هنا نقدم وصف عملية ساكسس، المبادئ الكامنة وراء الاستخدام، الفوائد، والقيود وإعداد العينة والتركيز بشكل كبير على جمع البيانات والتحليل، جنبا إلى جنب مع مس بإيجاز على أساسه النمذجة باستخدام المصفوفة خارج الخلية البروتينات نيدوجين-1 ولامينين γ-1 كمثال تجريبي.

المبادئ والفوائد والقيود المفروضة على ساكسس:

Principle(s) التوجيهية وراء ساكسس بسيط نسبيا: إيجاد حل لإعداد مونوديسبيرسيد macromolecule(s) للفائدة وضعت في إطار الشعرية ويتعرض لشعاع الأشعة سينية ذات طاقة عالية أحادي اللون. تسبب الفوتونات الإلكترونات لشل الذري تبدأ تتأرجح، أسفر عن موجه كروية المنبعثة من نفس الطاقة والطول الموجي. منذ سوف يتذبذب كل إلكترون، سيتحقق على خلفية ثابتة، وهو يتناقض الناتجة عن كثافة الإلكترون جزيء ضخم للخلفية. كثافة ونثر الناتجة يتم جمعها كدالة لزاوية التشتت، 2Θ (الشكل 1).

مع تقنيات أخرى مثل XRC، والرنين المغناطيسي، وجيم معلومات هيكلية على المستوى الذري، هناك فوائد متعددة ساكسس التي لا توفر تقنيات أخرى. يمكن أن يؤديها في المخزن المؤقت تقريبا أي ساكسس ولا يتطلب أي تحضير العينة الخاصة. هذا مهم خصوصا في دراسة السلوك وهيكل الجزيئات تحت ظروف مختلفة، مثل وجود أو غياب مونو-أو الكاتيونات divalent أو التغييرات في درجة الحموضة4،5. ساكسس لديه القدرة على تقديم معلومات عن المناطق مرونة جزيء ضخم6، شيء يمكن مع النضال التقنيات الأخرى المدرجة في القائمة. ولذلك، يمكن استخدام ساكسس تقنية مجانية قوية مع أجزاء مستقرة جزيء ضخم يجري درس مع XRC، وإدارة الموارد الطبيعية أو جيم، وجزيء ضخم كامل أو مجمع تحليلها بدقة منخفضة مع ساكسس والجمع بين استخدام مختلف أدوات تحليل هذه فوكسسدوك7 أو8من كريسول. منذ ساكسس أسلوب حل، فإنه يستخدم غالباً للتأكد إذا كانت الهياكل الثابتة مثل تلك التي تم الحصول عليها من XRC تتسق في الحل6. وقد ساكسس أيضا ميزة كونها تقنية تتطلب كمية صغيرة نسبيا من الاستثمار العينة (عادة 50-100 ميليلتر) وكمية صغيرة نسبيا من التجربة المرة (30 دقيقة-1 ح).

هو الحد أكبر من ساكسس تعرض لتجميع عينة و/أو تدهور، والتي يمكن أن تؤدي إلى توقعات الهيكلية غير صحيحة. يمكن تجميع، بل منخفضة تصل إلى 5%، مبعثر الضوء بكميات عالية جداً، مما يؤدي إلى المبالغة في تقدير البعد الجسيمات القصوى (دكحد أقصى) ونصف قطرها من gyration (صز). من ناحية أخرى، يمكن أن يؤدي تدهور عينة إلى نقلل خصائص الجزيئية. تنشأ مشكلة عدم الحصانة هذه من ساكسس يجري أسلوب حساب المتوسطات، مما يعني أن تجانس عينة أمر حاسم لتحقيق نتائج يمكن الاعتماد عليها واستنساخه. أي نموذج ليتم تحليلها بواسطة ساكسس ينبغي، ولذلك الخضوع لأساليب متعددة لتنقية وتجانس الشيكات، مثل الهنود ويشوه التفريد هلام، حجم الاستبعاد اللوني، دينامية الضوء التشتت، والتحليلية تنبيذ فائق. غالباً، سيتم تشغيل بياملينيس ساكسس خطوة عينات عن طريق عالية الأداء اللوني السائل كعنصر تحكم الجودة نهائية قبل ساكسس (S-ساكسس)3،9. وينبغي جمع البيانات ساكسس بتركيزات متعددة وينبغي مقارنة Rg لكل مجموعة بيانات، ضمان تشابه وثيق لتجنب التفاعلات إينتيربارتيكلي والتجميع، مما يؤدي إلى المبالغة في الجسيمات الأبعاد، مما أدى إلى تحليل البيانات غير الدقيقة، والنمذجة. نظراً تشتت يعتمد على التركيز والحجم، قد تتطلب الجزيئات أصغر من تحسين أكثر تحديداً لنطاق التركيز. ويرجع نظرية المثل، حيث مبعثر أحجام كبيرة نحو زوايا صغيرة وأحجام صغيرة نحو زوايا كبيرة. ويتجلى هذا في جمع البيانات، حيث أنايا غير متناسب إلى ص6، حيث R هو نصف قطر الجسيمات. هو حد نهائي ساكسس احتمالات الضرر الإشعاعي للعينة خلال التعرض، والذي يمكن أن يؤدي إلى تحريف للبيانات. أنها ممارسة جيدة لمقارنة نوعية العينة قبل وبعد التعرض ساكسس عينة لضمان أن لا يحدث هذا.

Protocol

1-ساكسس عينة من إعداد والحصول على البيانات

  1. تحضير العينة:
    1. تجارب ساكسس تتطلب عينات متجانسة ومستقرة وغير تجميع البروتين؛ مراعاة الاستقرار والدولة أوليجوميريك مع حجم الاستبعاد اللوني (S)، DLS و/أو أوك قبل جمع البيانات.
    2. تخضع العينات (نيدوجين-1 ولامينين γ-1 في هذه الحالة) لتحليل DLS وتريسيني الحزب الديمقراطي الصربي صفحة لتصور نموذج النقاء10.
      ملاحظة: العينات قد تغطي طائفة من تركيزات (1-4 مغ/مل) تبعاً لحجمها وسلوكهم الحل مثل رابطة الذاتي والتجميع جنبا إلى جنب مع الاستقرار؛ هنا، تركيزات خمسة من نيدوجين-1، (كاتشين 139)، ثلاثة من laminin γ-1 (109 كاتشين) وأربعة من المجمع اكويمولار تنقية S تم إعداد كما هو موضح سابقا10.
  2. جمع البيانات:
    1. جمع بيانات ساكسس استخدام نظام داخلي أو السنكروتروني، طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة أو مرفق.
      ملاحظة: تم جمع البيانات المستخدمة في هذا العمل باستخدام نظام داخلي (انظر الجدول للمواد) الذي يحتوي على كاميرا 3-الثقب مجهزة + 002 ميكروفوكوس أغلقت أنبوب (Cu Kα الإشعاع في 1.54) والبصريات [كنفوكل] ماكس-الجريان (الأسرة) تعمل في 40 دبليو النظام مجهز أيضا 200 نانومتر أسلاك متعددة 2D كاشف لجمع البيانات. ومع ذلك، مع توافر سينتشروترونس الحديثة في فرنسا وألمانيا والمملكة المتحدة، والولايات المتحدة الأمريكية وبلدان أخرى، التي توفر الوصول إلى إعداد S-ساكسس تسهل فصل إعداد مونوديسبيرسيد من الممكن تجميع/تدهور، ونحن الآن بشكل روتيني جمع البيانات في مرافق السنكروتروني. مقال نشر مؤخرا الحمض النووي ز-quadruplex11 مثال على استراتيجية جمع البيانات ساكسس S. في هذه الحالة، تم جمع البيانات ساكسس في نطاق 0.08 ≤ س ≤ 0.26 Å لمدة 3 ساعات نيدوجين-1 (2.0، 2.5، 3.0، 3.5 و 4.0 مغ/مل)؛ لامينين γ-1 (1.5 و 2.0 و 2.5 ملغ/مل) وبها مجمع (0.8، 1.0 و 1.25 و 1.5 ملغ/مل).
    2. الحد من البيانات المخزن المؤقت والعينات باستخدام برامج معالجة خاصة بالنظام. طرح مساهمة المخزن المؤقت لبيانات البروتين باستخدام برنامج مثل بريموس/كيو تي12 (الشكل 2A).

2. بيانات التحليل

ملاحظة: في الوقت الراهن، هناك عدد قليل من حزم البرامج التي مفيدة لتحليل البيانات ساكسس: ScÅtter بيوكستاس الخام44،43 (التحميل المتوفرة في www.bioisis.net) و جناح أتساس13. يوفر هذا القسم نظرة عامة للخطوات العامة التي يجب اتخاذها عند تحليل ساكسس الخام البيانات باستخدام أتساس في برنامج جناح واتخاذ خطوات محددة من أتساس 2.8.1 تحميل. يمكن استخدام برامج أخرى وتناقش بإيجاز في وقت لاحق.

  1. المخزن المؤقت للطرح
    ملاحظة: هذه الخطوات ذات الصلة لعينات ساكسس ثابتة فقط.
    1. حدد خيار القائمة "فتح" في بريموس/كيو تي وحدد ملفات البيانات للفائدة. أن تدرك أنه يجب أن تكون ملفات البيانات بتنسيق ASCII، التي يكون العمود الأول هو المحور المتجه s والعمود الثاني هو الكثافة. كرر هذه الخطوة للبيانات التي تم جمعها للمخزن المؤقت نفسه بإدراج هذه البيانات في نفس القائمة.
    2. حدد "طرح" في إطار معالجة البيانات، التي سوف تولد منحنى نثر المطروحة تمثل فقط نثر من جزيء ضخم للفائدة. كرر هذه الخطوة لكل تركيز.
  2. تحليل جينر
    1. لإجراء تحليل جينر، تحميل منحنى مبعثر المخزن مؤقت مطروحاً في بريموس/كيو تي كما هو موضح سابقا في الخطوة 2.1.1.
    2. انقر فوق "دائرة نصف قطرها Gyration" التي تشرع في فتح معالج جينر بريموس؛ سيتم عرض قطعة ln(ط) مقابل 2 .
    3. للحصول على استخدام أولية Rg الدالة "أوتورج"، الذي هو وحدة خارجية في صلب البحث عن بريموس/الطاقة الزر "أوتورج"، وانقر فوقه.
    4. إدخال ملفات متعددة في وقت واحد بتسليط الضوء على كل منهم، وإدراج لهم في القائمة الموجودة على الجانب الأيمن، مشابهة جداً ل 2.1.1.
    5. استخدام جوينير المؤامرة التي تم إنشاؤها سابقا لتقييم نوعية البيانات؛ ويبين الخط الأخضر تحت الأرض جينر المؤامرة المخلفات تمثل الخطي يصلح ل. أن تدرك أن اللاخطية في تحليل جينر يمكن أن يكون علامة على تجميع العينة وينبغي عدم إجراء المزيد من التحليل في هذه الحالة.
      ملاحظة: نوبة جينر خطي يعطي آرز مع خطأ صغير (< 5%)، ويشير إلى عينة عالية الجودة.
  3. تحليل كراتكي
    1. تحميل البيانات إلى تصور بطريقة مماثلة كما هو موضح أعلاه.
    2. انقر فوق "مربع تحديد" الموجود بجوار اسم ملف البيانات. وهذا سوف رسم البيانات في نافذة منفصلة.
    3. انقر فوق الزر "مؤامرة" متبوعاً بالتحديد "مؤامرة كارتكي" في القائمة المنسدلة.
    4. وهذا سوف رسم البيانات ك "2 × L(q) مقابل q". كن على علم أن البروتينات كروي عرض ذروة ضبابي، بينما البروتينات تكشفت سيتم عرض هضبة بدلاً من ذروة ويشابه الأرض الزائدي17.
  4. دمج البيانات
    1. تحميل المخزن المؤقت طرح بيانات لكل تركيز في بريموس/كيو تي مرة أخرى، كما هو الحال في الخطوة 2.1.1.
    2. لدمج البيانات، ببساطة انقر فوق الزر "دمج" في إطار معالجة.
    3. افحص كل منحنى وأنا رقم المقياس، والذي يرتبط بتخفيف من العينة الأصلية.
      ملاحظة: عرض عينات في أعلى تركيز أقل ضوضاء في منطقة الذيل من المنحنيات.
  5. توزيع P(r)
    1. لإنشاء هذه المؤامرة P(r)، تحميل منحنيات البيانات المدمجة في بريموس/كيو تي كما تم وصفه سابقا.
    2. انقر فوق الزر "توزيع المسافة" لفتح نافذة جديدة عرض البيانات المدمجة من كثافة متناثرة الخفيفة مقابل وبعد الزوج توزيع الدالة الأرض على الجانب الأيمن.
      ملاحظة: المعلومات الموجودة على الجانب الأيمن يعرض الجودة الشاملة للعمليات الحسابية دالة التوزيع بعد الزوج.
    3. ضبط نطاق البيانات البيانات المدمجة لتجنب أي ضجيج كبير في ذيل البيانات الخام.
    4. حذف نقاط البيانات قريبة من شعاع أوقفوا في منطقة منخفضة-q.
    5. لتحديد بدء دكحد أقصى، مع مجموعة من 5 مرات ~ Rg التي تم الحصول عليها من خلال تحليل جينر. خفض هذه القيمة بشكل تدريجي حتى لا تسقط فجأة إلى الصفر على المحور الصادي على الأرض P(r) وليس لديه ذيل طويل قبل أن تقترب من الصفر.
    6. تحقق من أن التجريبية Rg/أنا0 (مشتقة من تقريب جينر) و P(r) Rg/أنا0أرقام متشابهة.
      ملاحظة: في بعض الحالات، كذلك التلاعب في النطاق من البيانات ونقاط البيانات، وألفا (معلمة تنظيم الذي يحكي البرنامج نسبة كم من الاهتمام لنعومة توزيع مقارنة لاحتواء البيانات التجريبية) أيضا 21 مطلوب للحصول على قطعة أرض P(r) ذات نوعية جيدة.

3-حبةمنذ البداية ب النمذجة، وبلغ متوسط

  1. عندما يتم دمج البيانات المجمعة بتركيزات متعددة، أو يتم تصغير البيانات المجمعة باستخدام S-ساكسس، وتم التحقق من الأرض كراتكي والأرض P(r) وتحليل جينر، حساب هياكل منخفضة الدقة من الجزيئات و هذه المجمعات. يمكن استخدام هذه الأنابيب لدراسة هياكل الحل وتفاعلات الأحماض النووية والبروتينات، والأحماض النووية-البروتين أو البروتين-بروتين مجمعات10،11،،من2122،23 ،24،25،،من2627،،من2829،30،31،32 ،،من3334. أحد البرامج الأكثر شعبية هو دامين، وضعتها سفيرجون35 وجزء من أتساس حزمة13، التي تستخدم بروتوكولات انلينغ محاكاة مع معلومات الإدخال الأولية في صز و دماكس . يرد وصف نهج النمذجة منذ البداية والمبادئ بالتفصيل في مكان آخر18،36.

Representative Results

واستخدم نهج تحليل البيانات المذكورة أعلاه لحساب Rز ودماكس laminin γ-1 نيدوجين-1 ومجمع استخدام الدالة P(r). يمكننا الحصول على قيم Rز 7.20 شمال البحر الأبيض المتوسط (±0.10)، وشمال البحر الأبيض المتوسط (±0.20) 8.10 و 10.9 نانومتر (روبلين) نيدوجين-1, لامينين γ-1 وعلى مجمع على التوالي (الشكل 2 أ). وبالإضافة إلى ذلك، قيم دماكس 24 نانومتر، 26 شمال البحر الأبيض المتوسط، و 35 نانومتر laminin γ-1 نيدوجين-1 وعلى مجمع على التوالي (الشكل 2)10 تم الحصول عليها. تم استخدام برنامج داميف للحصول على هياكل منخفضة الدقة من نيدوجين-1 ولامينين γ-1، الذي اقترح أن تعتمد كلا البروتينات شكل موسع في الحل. قيم X وأن إس دي نيدوجين-1 (~ 1 و 0.8) و laminin γ-1 (~0.9 و 0.8 على التوالي) وكانت أيضا في النطاق المقبول. المحاذاة لهياكل عالية الاستبانة، مجالات اثنين من نيدوجين-1 واثنين من لامينين γ-1، على هياكلها ذات الدقة المنخفضة التي تم الحصول عليها باستخدام ساكسس أتاح التعرف على المناطق الطرفية ن وج10.

نيدوجين-1 حدد كشريك متفاعلة من لامينين،γ-13940 والموقع التفاعل تم تعيينها باستخدام علم البلورات بالأشعة السينية ل المجالات ج-مبنى رقم41. غير أن تشارك هياكل ذات الدقة العالية فقط مجالات التفاعل وليس كامل طول نيدوجين-1 أو الذراع γ-1 laminin كامل. ولذلك، نحن تنقيته معقدة التي تحتوي على نيدوجين-1 (الطول الكامل) والذراع γ-1 لامينين لتحديد المناطق متفاعلة فيما بينها، وكذلك فيما يتعلق بدراسة التوجه النسبي لمجالات البروتينات كلا الطرفي ن. البيانات ساكسس للمجمع أسفرت عن Rز من 10.9 (روبلين) نانومتر و دماكس 35 شمال البحر الأبيض المتوسط. لقد استخدمت مونسا للحصول على بنية منخفضة الدقة من المجمع بأكمله، مما يوحي بأن الواقع، فقط المنطقة ج-الطرفية كلا البروتينات المشاركة في الوساطة التفاعلات، بينما بقية المجالات الآن بعيداً عن بعضها البعض ( 3 الرقم، فيديو 1).

Figure 1
رقم 1- الخطط لإنشاء ساكسس. مستعدة استعدادا مونوديسبيرسيد من الجزيئات الحيوية أو تلك المجمعات، يليه التعرض مع الأشعة السينية ذات الطاقة العالية. تبعاً للمصدر (مثلاً، داخلية مقابل السنكروتروني)، يمكن أن تختلف الطاقة من الأشعة السينية وعينه لمسافة المصدر. نمط تبعثر الأشعة السينية (وهذا يعتمد على حجم وشكل الجزيئات الحيوية) يتم تسجيلها واشعاعيا في المتوسط للحصول على قطعة أرض 1-الأبعاد (1-د) الذي يحتوي على معلومات بشأن الكثافة الضوء مبعثرة فيما يتعلق بزاوية التشتت. كما الجزيئات المخزن المؤقت مبعثر أيضا الضوء، تم خصم المساهمات المقدمة من هذه الجزيئات للحصول على نمط تشتت الجزيئات الحيوية ذات الاهتمام. في السنكروتروني، قبل جمع البيانات ساكسس، يتم أيضا عادة خطوة تنقية إضافية باستخدام حجم خط الإقصاء/عالية الأداء اللوني (أعلى طريقة العرض). تعد هذه الخطوة الحاسمة لإزالة أي منتج مجمعة و/أو المتدهورة، وكذلك فيما يتعلق بإزالة أي الجزيئات الحيوية غير منضم من المجمع. يتم تحويل الأرض ونثر د 1 إلى المؤامرة توزيع زوج إلكترون-المسافة (ف(r) الأرض)، الذي يوفر نصف قطر gyration والبعد الجسيمات الحد الأقصى من الجزيئات الحيوية. هذه المؤامرة كملف الإدخال أصلها النمذجة الحزم (أي، دامين/داميف) للحصول على هياكل منخفضة الدقة من الجزيئات الحيوية، أو الحزم الأخرى (أي، ساسرف/المرجان) إذا كان بنية عالية الدقة لأجزاء من ومن المعروف الجزيئات الحيوية أو الجزيئات الحيوية الفردية للمجمع.  الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2- (أ) قطعة كثافة متناثرة الخفيفة مقابل زاوية التشتت (q = 4πsinθ/λ، شمال البحر الأبيض المتوسط-1) مما يوحي بنوعية الجزيئات الحيوية (منطقة منخفضة) والشكل (منطقة عالية) من الجزيئات الحيوية. (ب) توزيع زوج إلكترون-المسافة P(r) تحدد من تشتت البيانات توحي شكل ممدود الجزيئات الحيوية قيد التحقيق (laminin γ-1، نيدوجين-1، وعلى مجمع). (ج) كراتكي الأرض مما يوحي بأن نيدوجين-1 والبروتينات γ-1 laminin لا تكشفت. (د) مؤامرة جينر نيدوجين-1, لامينين γ-1 وبهم معقدة، مما يشير إلى منطقة الخطي لتحديد نصف قطر gyration باستخدام البيانات في زاوية منخفضة-نثر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3- هيكل منخفضة الدقة من مجمع نيدوجين-1، و laminin γ-1 التي تم الحصول عليها عن طريق تحليل مجموعات البيانات المدمجة باستخدام برنامج مونسا. نظام الألوان هو نفس الرقم 2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Movie 1
فيديو 1. بنية ذات الدقة المنخفضة من نيدوجين-1 ولامينين مجمع γ-1. أعد هذا الفيلم باستخدام بيمول لتصور مختلف السمات الهيكلية للمجمع. بنية بلورية من مجمع لامينين-نيدوجين (معرف PDB: 1NPE) يظهر كالرسوم الشريط، وتسليط الضوء على التفاعل في مواقع لهذا المجمع. نظام الألوان هو نفس الرقم 2. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

Discussion

الخطوات الحاسمة لتحليل البيانات ساكسس المبينة في المقطع بروتوكول من هذا الطرح المخزن المؤقت لتضمين الورقة، تحليل جينر وتحليل كراتكي، ودمج البيانات وتوزيع P(r). واسع جداً تكون مشمولة هنا بالتفصيل النمذجة حبة منذ البداية وذلك يغطي فقط بإيجاز.

في سينتشروترونس (مثلاً قد في ألمانيا، والماس في المملكة المتحدة، وأسرف في فرنسا)، فمن الممكن جمع بيانات ساكسس لنسبة ضئيلة جداً (~ ميليلتر قليلة) لكل عينة كالكسور التي يجري التيد من العمود s هو متصل في خط (انظر الشكل 1 ). هو متوسط البيانات ساكسس متناثرة الاستيكالي إشعاعيا استخدام حزم توفرها الشركة المصنعة الصك أو السنكروتروني في قبل الطرح المخزن المؤقت يمكن أن تحدث. البيانات الناتجة عن د 1 يمثل كمية الضوء المتناثرة ( أنا(q)) في ص-المحور وزاوية التشتت (q= 4πsinθ/λ، حيث λ هو الطول الموجي للحادث العاشر-أشعة) ويرد في الشكل 1. البرنامج بريموس/كيو تي12 يستخدم لطرح أي خلفية بسبب المخزن المؤقت مباشرة، ويرد في الفرع 1-1. برامج أخرى مثل؛ ScÅtter43 (التحميل المتوفرة في www.bioisis.net) مع برنامج تعليمي متاح في https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeA، وبيوكستاس الخام44 (https://المتاحة في bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html) يمكن أن تستخدم كبديل لمجموعة أتساس.

تحليل جينر يوفر معلومات حول تجميع العينة والتجانس، فضلا عن توفير دائرة نصف قطرها Gyration (صز) لجزيء ضخم للفائدة استناداً إلى البيانات ساكسس من منطقة منخفضة s 14. مؤامرة هي التي شيدت مع بريموس/كيو تي ساكسس البيانات التي تم الحصول عليها من كل تركيز، تليها المنحنى المناسب مع نطاق الحد الأقصى ليصل إلى 1.30 س س صز. ينبغي أن توفر إعداد نموذج مونوديسبيرسيد مؤامرة جينر خطي في هذه المنطقة (الشكل 2D)، حين تجميع النتائج في جينر غير خطية مؤامرة15،16. إذا كان التحليل جينر الخطية، يمكن ملاحظة درجة "أونفولديدنيس" من جزيء ضخم للفائدة مع المؤامرة كراتكي، وهو أمر مفيد عند البت فيما إذا كان تنفيذ النمذجة هيئة جامدة أو بناء فرق نماذج ذات الدقة المنخفضة. بروتين كروي ستظهر في كراتكي مؤامرة لمنحنى على شكل جرس، بينما مددت الجزيئات أو الببتيدات تكشفت ستظهر على هضبة أو حتى زيادة في النطاق أكبر وتفتقر إلى بيل-الشكل (الشكل 2).

الحصول على آرز من تحليل جينر إلا ترى نقاط البيانات من منطقة منخفضة q مؤامرة مبعثر د 1 (الشكل 2D)، ومع ذلك، من الممكن استخدام dataset كامل تقريبا للقيام تحويل فورييه غير المباشرة لتحويل المعلومات المتبادلة والفضاء ln (ط (q)) مقابل (q) إلى دالة توزيع مسافة الفضائية حقيقية (P(r)) الذي يوفر معلومات عن دماكس و آرز (الشكل 2) ويمثل شكل الأرض P(r) تكيف الحل الإجمالي من جزيء ضخم الفائدة،من18إلى19. تحويل البيانات المتبادلة-مساحة للبيانات الفضائية الحقيقي خطوة بالغة الأهمية ولكن وصفاً مفصلاً لا يدخل في نطاق هذه الورقة. ولذلك، الرجوع إلى مقال سفيرجون20 فهم كل معلمة.

وبمجرد طرح المخزن المؤقت البيانات الفردية تركيزات تتم معالجتها من خلال التحليل جوينير مع قيمة متسقة Rg، متبوعاً بالتحقيق على نمط الطي باستخدام تحليل كراتكي، يمكن دمج هذه البيانات. وترد في الشكل 2Bالبيانات المدمجة laminin γ-1 نيدوجين-1 وعلى مجمع جهزت كما هو موضح أعلاه والمؤامرات P(r) الناجمة عن ذلك. ومن الناحية المثالية، ينبغي أيضا حساب دالة التوزيع بعد الزوج P(r) لكل تركيز تحديد ما إذا كان يوفر ساكسس البيانات المجمعة لكل تركيز مماثل Rز دماكس القيم. إذا صز دماكس تظل مماثلة عبر طائفة واسعة من التركيزات، ينبغي المضي قدما للمستخدم. تجدر الإشارة إلى أن اعتماداً الإشارة، ويمكن أن يتم اقتطاعها البيانات قبل دمج البيانات. وهذا غالباً ما الحال إذا كان منخفضا بتركيزات و/أو الوزن الجزيئي للجزيئات قيد التحقيق.

يمكن إجراء تحليل الشكل منخفضة الدقة باستخدام دامين في أوضاع مختلفة (مثل سريعة وبطيئة، وأوضاع الخبراء، إلخ). الوضع السريع خطوة أولى مثالية لتقييم إذا كانت الأرض P(r) يوفر نماذج ذات نوعية جيدة. عادة، يجب الحصول على نماذج 10 على الأقل لكل قطعة P(r) للتحقق إذا استنساخه، من حيث الهيكل ذات الدقة المنخفضة، ويتم الحصول على النتائج، مع الخير منخفضة لتناسب معلمة تسمى χ (قيمة 0.5-1.0 تعتبر جيدة على أساس عملنا واسعة النطاق )، قيمة التي تصف اتفاقا بين البيانات ساكسس تجريبيا المجمعة والبيانات المستمدة من نموذج. لغرض النشر، ونحن عادة استخدام وضع بطيئة أو خبير وحساب نماذج على الأقل 15. بالإضافة إلى دامين، يتم إصدار أسرع من ذلك، داميف37، فضلا عن جاسبر38 أيضا البدائل. وعلاوة على ذلك، من الممكن لدراسة البروتين-بروتين أو مجمعات الأحماض النووية البروتين، استخدم مونسا البرنامج35، مما يسهل تركيب متزامنة من البيانات ساكسس الفردية للجزيئات الكبيرة، فضلا عن مجمع على. لمزيد من التفاصيل حول حسابات نموذج الاستبانة، وكذلك لدراسات التفاعل البروتين الحمض النووي الريبي، الرجوع إلى مقالة نشرت مؤخرا باتل وآخرون3.

ساكسس بسيط من الناحية النظرية ولكن بلا شك وسيلة تكميلية عالية إلى أدوات علم الأحياء الهيكلية والنتائج في البيانات الهيكلية ذات الدقة المنخفضة التي يمكن استخدامها بمفردها أو بالاشتراك مع تقنيات عالية الاستبانة توضيح المعلومات الأخرى حول هيكل الجزيئات والقوى المحركة. طالما أنه يمكن الحصول على إعداد مونوديسبيرسيد من الجزيئات، وهذه المجمعات، ويمكن استخدام ساكسس لدراسة هيكل في الحل والتفاعلات بين أي نوع من جزيء ضخم البيولوجية. وفي حالة المجمع مناقشتها هنا، الجدير بالملاحظة أن أقل من 10 في المائة المساحة السطحية عموما موجوداً من النيتروجين-1 ولامينين دفن γ-1 في هذا المجمع، بينما بقية المجالات كلا البروتينات متاحة بحرية للتفاعل مع الآخر البروتينات في المصفوفة خارج الخلية الاحتفاظ الصلابة الهيكلية (الشكل 3). الحصول على هذه المعلومات لمجمع مع ~ 240kDa ستكون صعبة للغاية باستخدام تقنيات البيولوجيا الهيكلية الأخرى مثل علم البلورات بالأشعة السينية والرنين المغناطيسي المجهري م البرد.

كشف بنية البروتين عن طريق البلورات بالأشعة السينية أو الرنين المغناطيسي النووي عملية تستغرق وقتاً طويلاً أصلاً. هذا الاختناق في تصميم هيكل هو أحد المجالات حيث يظهر ساكسس قوتها كتقنية هيكلية؛ الحصول على البيانات لتجربة ساكسس واحد يمكن أن يستغرق أقل من ساعة، ويمكن أن يتم بمساعدة برمجيات تحليل مبسط، التحليل بسرعة وكفاءة. ساكسس لديه القدرة على زيادة الإنتاجية الدراسات الهيكلية إلى حد كبير كأسلوب قائم بذاته لأنه يقدم نموذجا منخفضة الدقة من هيكل الجزيئات قبل أن تتوفر بيانات عالية الدقة. حاجزاً أمام غيرها من التقنيات الهيكلية هو شرط عينة نقية جداً ومركزة للحصول على البيانات، مما يتطلب مستوى عال من البروتين التعبير والاستقرار على مدى فترة طويلة من الزمن. بينما ساكسس عينات أيضا ضرورة أن تكون نقية ومركزة، حجم العينة هي تقريبا 100 ميليلتر صنع ساكسس طريقة غير مكلفة نسبيا لتحليل مقارنة بغيرها من التقنيات الهيكلية. وعلاوة على ذلك، ساكسس مقترنة بحجم الاستبعاد اللوني أصبحت شائعة بشكل متزايد مما يوفر خطوة إضافية في مجال مراقبة الجودة. مؤخرا كان هناك تقدم قوي في الجمع بين البيانات الرنين المغناطيسي النووي وساكسس باستخدام ال45،الأسلوب الأمثل فرقة (الانتخابات)46 إلى توضيح نظم مرنة. في ورقة صدرت مؤخرا بواسطة ميرتنز وسفيرجون47، وصف الكتاب العديد من الأمثلة الأخيرة من ساكسس بعثة لمراقبة الانتخابات في تركيبة مع الرنين المغناطيسي، جنبا إلى جنب مع العديد من الأمثلة الأخرى ساكسس بيانات يتم استخدامها بالاقتران مع الرنين المغناطيسي النووي. وتبذل باستمرار التقدم في ميدان ساكسس، ويجري التقنيات الجديدة المتقدمة ساكسس لاستخدامها بالاقتران مع، لا مجرد مجانية على التقنيات الهيكلية الأخرى. ونتيجة لذلك، نحن نعتقد أن الطلب على ساكسس ستزداد مع مرور الوقت، لا سيما بالاقتران مع الرنين المغناطيسي لتوصيف نظم ديناميكية حيث يتم تعريف الدالات بالمرونة.

Disclosures

المؤلف بالكشف عن لا إعلان.

Acknowledgments

هذا المشروع قد حظي بمقدمة رجبين-2018-04994، برنامج الابتكار ألبرتا للحرم الجامعي (ج RCP-12-002) ومعهد بحوث بريون ألبرتا/المنح "ألبرتا يبتكر الحلول الحيوية" (201600018) للحزب مو هو "كرسي أبحاث كندا" في الجيش الملكي النيبالي & الفيزياء الحيوية البروتين (201704) وتسلم منحة "اكتشاف الأموال" (رجبين-2017-04003). الخرائط المواضيعية وتمول بمنحه "الاكتشاف مقدمة" للحزب الراديكالي عبر الوطني

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK 293 EBNA Cell Line In-Lab availability - Cell line used to overexpress protein(s)
Ni Sepharose High Performance histidine-tagged protein purification resin GE Healthcare 17524801 Affinity protein purification resin
Superdex 200 Increase 10/300 GE Healthcare 28990944 SEC Column
ÄKTA Pure FPLC GE Healthcare - FPLC System
Nanodrop Nanodrop - Spectrophotometer
Basic Reagents (NaCl, Tris-HCl etc.)
S-MAX3000 Rigaku - SAXS Pinhole Camera System
Zetasizer Nano-S Malvern Instruments Ltd - Dynamic Light Scattering instrument
0.1µm Filter Millipore JVWP04700 Used to Concentrate Sample Prior to DLS
Thrombin cleavage kit abcam ab207000 Thrombin cleavage to remove His tag
Strep-Tactin Sepharose Column IBA 2-1201-010 Strep-Tag Affinity Purification
D-desthiobiotin Sigma-Aldrich 533-48-2 Elution of Strep Tag Protein
Software
SAXGUI Rigaku - Data Collection for SAXS and data reduction
ATSAS Suit Franke et al., 2017 - SAXS Data Analysis Software program suite
PRIMUS Konarev et al., 2003 - Buffer Subtraction
GNOM Svergun, 1992 - Rg, Dmax and p(r) Calculation
DAMMIF Franke and Svergun, 2009 - Ab initio model calculation
DAMAVER Volkov and Svergun, 2003 - Averaged Solution Conformation calculations
MONSA Svergun, 1999 - Simultaneous model fitting for the complex
GASBOR Svergun et al., 2001 - Alternative Ab initio model calculations
DTS Software V6.20 Malvern Instruments Ltd - DLS supplied instrument software
PyMOL Schrodinger, LLC. - The PyMOL Molecular Graphics System V2.0
The Protein Data Bank Berman et al., 2000 - PDB ID: 1NPE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Advances in structure analysis using small-angle scattering in solution. Current Opinion in Structural Biology. 12, (5), 654-660 (2002).
  2. Patel, T. R., Chojnowski, G., Koul, A., McKenna, S. A., Bujnicki, J. M. Structural studies of RNA-protein complexes: A hybrid approach involving hydrodynamics, scattering, and computational methods. Methods. 118, 146-162 (2017).
  3. Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8, (4), 409-427 (2016).
  4. Uversky, V. N., Gillespie, J. R., Fink, A. L. Why are “natively unfolded” proteins unstructured under physiologic conditions? Proteins. 41, (3), 415-427 (2000).
  5. Uversky, V. N., Gillespie, J. R., Millett, I. S., Khodyakova, A. V., Vasiliev, A. M., Chernovskaya, T. V., Abramov, V. M. Natively Unfolded Human Prothymosin α Adopts Partially Folded Collapsed Conformation at Acidic pH. Biochemistry. 38, (45), 15009-15016 (1999).
  6. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Letters. 589, (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  7. Schneidman-Duhovny, D., Hammel, M., Tainer, J. A., Sali, A. FoXS, FoXSDock and MultiFoXS: Single-state and multi-state structural modeling of proteins and their complexes based on SAXS profiles. Nucleic Acids Research. 44, 424-429 (2016).
  8. Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL - a Program to Evaluate X-ray Solution Scattering of Biological Macromolecules from Atomic Coordinates. Journal of Applied Crystallography. 28, (6), 768-773 (1995).
  9. Pérez, J., Vachette, P. A Successful Combination: Coupling SE-HPLC with SAXS. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1009, 183-199 (2017).
  10. Patel, T. R., Bernards, C., Meier, M., McEleney, K., Winzor, D. J., Koch, M., Stetefeld, J. Structural elucidation of full-length nidogen and the laminin-nidogen complex in solution. Matrix Biology. 33, 60-67 (2014).
  11. Meier, M., Moya-Torres, A., Krahn, N. J., McDougall, M. D., Orriss, G. L., McRae, E. K. S. Structure and hydrodynamics of a DNA G-quadruplex with a cytosine bulge. Nucleic Acids Research. (2018).
  12. Franke, D., Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Panjkovich, A., Tuukkanen, A., Mertens, H. D. T. ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50, 1212-1225 (2017).
  13. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36, (5), 1277-1282 (2003).
  14. Tuukkanen, A. T., Svergun, D. I. Weak protein-ligand interactions studied by small-angle X-ray scattering. The FEBS Journal. 281, (8), 1974-1987 (2014).
  15. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496, (7446), 477-481 (2013).
  16. Koch, M. H., Vachette, P., Svergun, D. I. Small-angle scattering: a view on the properties, structures and structural changes of biological macromolecules in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 36, (2), 147-227 (2003).
  17. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40, (3), 191-285 (2007).
  18. Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Applications of small-angle X-ray scattering to biomacromolecular solutions. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45, (2), 429-437 (2013).
  19. Svergun, D. I. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25, (4), 495-503 (1992).
  20. Patel, T. R., Morris, G. A., Zwolanek, D., Keene, D. R., Li, J., Harding, S. E. Nano-structure of the laminin γ-1 short arm reveals an extended and curved multidomain assembly. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 29, (7), 565-572 (2010).
  21. Patel, T. R., Reuten, R., Xiong, S., Meier, M., Winzor, D. J., Koch, M., Stetefeld, J. Determination of a molecular shape for netrin-4 from hydrodynamic and small angle X-ray scattering measurements. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 31, (2), 135-140 (2012).
  22. Dzananovic, E., Patel, T. R., Deo, S., McEleney, K., Stetefeld, J., McKenna, S. A. Recognition of viral RNA stem-loops by the tandem double-stranded RNA binding domains of PKR. RNA. 19, (3), New York, N.Y. 333-344 (2013).
  23. Meier, M., Patel, T. R., Booy, E. P., Marushchak, O., Okun, N., Deo, S. Binding of G-quadruplexes to the N-terminal recognition domain of the RNA helicase associated with AU-rich element (RHAU). The Journal of Biological Chemistry. 288, (49), 35014-35027 (2013).
  24. Dzananovic, E., Patel, T. R., Chojnowski, G., Boniecki, M. J., Deo, S., McEleney, K. Solution conformation of adenovirus virus associated RNA-I and its interaction with PKR. Journal of Structural Biology. 185, (1), 48-57 (2014).
  25. Bacik, J. -P., Tavassoli, M., Patel, T. R., McKenna, S. A., Vocadlo, D. J., Khajehpour, M., Mark, B. L. Conformational itinerary of Pseudomonas aeruginosa 1,6-anhydro-N-acetylmuramic acid kinase during its catalytic cycle. The Journal of Biological Chemistry. 289, (7), 4504-4514 (2014).
  26. Deo, S., Patel, T. R., Dzananovic, E., Booy, E. P., Zeid, K., McEleney, K. Activation of 2’ 5’-oligoadenylate synthetase by stem loops at the 5’-end of the West Nile virus genome. PloS One. 9, (3), e92545 (2014).
  27. Vadlamani, G., Thomas, M. D., Patel, T. R., Donald, L. J., Reeve, T. M., Stetefeld, J., Mark, B. L. The β-lactamase gene regulator AmpR is a tetramer that recognizes and binds the D-Ala-D-Ala motif of its repressor UDP-N-acetylmuramic acid (MurNAc)-pentapeptide. The Journal of Biological Chemistry. 290, (5), 2630-2643 (2015).
  28. Deo, S., Patel, T. R., Chojnowski, G., Koul, A., Dzananovic, E., McEleney, K., McKenna, S. A. Characterization of the termini of the West Nile virus genome and their interactions with the small isoform of the 2’ 5’-oligoadenylate synthetase family. Journal of Structural Biology. 190, (2), 236-249 (2015).
  29. Ariyo, E. O., Booy, E. P., Patel, T. R., Dzananovic, E., McRae, E. K., Meier, M., McKenna, S. A. Biophysical Characterization of G-Quadruplex Recognition in the PITX1 mRNA by the Specificity Domain of the Helicase RHAU. PloS One. 10, (12), (2015).
  30. Hyde, E. I., Callow, P., Rajasekar, K. V., Timmins, P., Patel, T. R., Siligardi, G., Scott, D. J. Intrinsic disorder in the partitioning protein KorB persists after co-operative complex formation with operator DNA and KorA. The Biochemical Journal. 474, (18), 3121-3135 (2017).
  31. Dzananovic, E., Astha, null, Chojnowski, G., Deo, S., Booy, E. P., Padilla-Meier, P., McKenna, S. A. Impact of the structural integrity of the three-way junction of adenovirus VAI RNA on PKR inhibition. PloS One. 12, (10), (2017).
  32. Krahn, N., Meier, M., To, V., Booy, E. P., McEleney, K., O’Neil, J. D., Stetefeld, J. Nanoscale Assembly of High-Mobility Group AT-Hook 2 Protein with DNA Replication Fork. Biophysical Journal. 113, (12), 2609-2620 (2017).
  33. Patel, T. R., Besong, T. M. D., Meier, M., McEleney, K., Harding, S. E., Winzor, D. J., Stetefeld, J. Interaction studies of a protein and carbohydrate system using an integrated approach: a case study of the miniagrin-heparin system. European Biophysics Journal: EBJ. (2018).
  34. Svergun, D. I. Restoring low resolution structure of biological macromolecules from solution scattering using simulated annealing. Biophysical Journal. 76, (6), 2879-2886 (1999).
  35. Blanchet, C. E., Svergun, D. I. Small-Angle X-Ray Scattering on Biological Macromolecules and Nanocomposites in Solution. Annual Review of Physical Chemistry. 64, (1), 37-54 (2013).
  36. Volkov, V. V., Svergun, D. I. Uniqueness of ab initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 36, 860-864 (2003).
  37. Kozin, M. B., Svergun, D. I. Automated matching of high- and low-resolution structural models. Journal of Applied Crystallography. 34, (1), 33-41 (2001).
  38. Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42, (Pt 2), 342-346 (2009).
  39. Svergun, D. I., Petoukhov, M. V., Koch, M. H. J. Determination of Domain Structure of Proteins from X-Ray Solution Scattering. Biophysical Journal. 80, (6), 2946-2953 (2001).
  40. Baumgartner, R., Czisch, M., Mayer, U., Pöschl, E., Huber, R., Timpl, R., Holak, T. A. Structure of the nidogen binding LE module of the laminin gamma1 chain in solution. Journal of Molecular Biology. 257, (3), 658-668 (1996).
  41. Stetefeld, J., Mayer, U., Timpl, R., Huber, R. Crystal structure of three consecutive laminin-type epidermal growth factor-like (LE) modules of laminin gamma1 chain harboring the nidogen binding site. Journal of Molecular Biology. 257, (3), 644-657 (1996).
  42. Takagi, J., Yang, Y., Liu, J. -H., Wang, J. -H., Springer, T. A. Complex between nidogen and laminin fragments reveals a paradigmatic beta-propeller interface. Nature. 424, (6951), 969-974 (2003).
  43. Förster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J. Appl. Cryst. 43, 639-646 (2010).
  44. Hopkins, J. B., Gillilan, R. E., Skou, S. BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis. J. Appl. Cryst. 50, 1545-1553 (2017).
  45. Bernadó, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. (17), 5656-5664 (2007).
  46. Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2, (Pt 2), 207-217 (2015).
  47. Mertens, H. D. T., Svergun, D. I. Combining NMR and small angle X-ray scattering for the study of biomolecular structure and dynamics. Arch Biochem Biophys. 628, 33-41 (2017).
الدراسات الهيكلية "للجزيئات الكبيرة" في الحل باستخدام "تبعثر الأشعة السينية زاوية صغيرة"
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mrozowich, T., McLennan, S., Overduin, M., Patel, T. R. Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering. J. Vis. Exp. (141), e58538, doi:10.3791/58538 (2018).More

Mrozowich, T., McLennan, S., Overduin, M., Patel, T. R. Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering. J. Vis. Exp. (141), e58538, doi:10.3791/58538 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter