Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Strukturella studier av makromolekyler i lösningen med små Angle X-Ray Scattering

doi: 10.3791/58538 Published: November 5, 2018

Summary

Här presenterar vi hur små Angle X-Ray Scattering (SAXS) kan utnyttjas för att få information på lågupplösta kuvert som representerar de makromolekylära strukturerna. När den används tillsammans med högupplösta strukturella tekniker såsom röntgenkristallografi och kärnmagnetisk resonans, kan SAXS ge detaljerade inblickar i flera domäner proteiner och makromolekylärt komplex i-lösning.

Abstract

Protein-protein interaktioner mellan proteiner med flera klotformig domäner presentera tekniska utmaningar för att avgöra hur en sådan komplex form och hur domäner orienterade/placerad. Här beskrivs ett protokoll med potential för att klarlägga vilka specifika domäner medla interaktioner i flerkomponents systemet genom rättsverkan modellering. En metod för beräkning av makromolekyler och deras församlingar strukturer på lösning tillhandahålls som innebär att integrera data från små angle X-ray scattering (SAXS), kromatografi och atomär upplösning strukturer tillsammans i en hybrid strategi. Ett konkret exempel är komplex av fullängds nidogen-1, som monterar extracellulära matrix proteiner och bildar en utökad, böjda nanostruktur. En av dess klotformig domäner fäster laminin γ-1, som strukturerar basalmembranet. Detta ger en grund för att fastställa korrekta strukturer av flexibla flera domäner proteinkomplex och aktiveras av synkrotron källor tillsammans med robotteknik och storlek utslagning kromatografi automationssystem. Denna kombination tillåter snabb analys i vilken flera Oligomera tillstånd är skilda strax före SAXS datainsamling. Analysen ger information om radien av gyration, partikel dimension, molekylära form och interdomain ihopkoppling. Protokollet för att skapa 3D-modeller av komplex genom att montera högupplöst strukturer av proteinerna som komponent ges också.

Introduction

Cellerna innehåller intrikata nätverk av proteiner som fungerar som molekylära maskiner att utföra cellulära funktioner såsom signalering kaskader och bibehålla strukturella integritet. De sätt på vilka dessa olika komponenter flytta och interagera i tredimensionella rymden ger upphov till specifika funktioner av makromolekyler. Vikten av Proteiners struktur, dynamik och interaktioner för att fastställa funktion har lämnat behovet av ständigt föränderliga och komplexa tekniker för att mäta dessa egenskaper. Av dessa, kärnmagnetisk resonans (NMR), röntgenkristallografi (XRC) och mer nyligen, Cryo-Electron Microscopy (CEM) ger högupplösta strukturell information. Dock XRC och CEM avkastning strukturer i en av många Biomolekylär stater och saknar information om dynamiken av proteinstruktur, medan 3D strukturbestämning av NMR är vanligtvis begränsad till mindre globulära proteiner. Ett sätt att övervinna dessa begränsningar är att utnyttja små vinkel X-Ray Scattering (SAXS) för att generera molekylär kuvert av stora, flera domäner eller komplexa system och kombinera de högupplösta styva makromolekylära strukturerna för att belysa den globala arkitektur och dynamiska funktioner.

SAXS producerar lågupplösta kuvert av makromolekylära komplex med en upplösning på cirka 10-20 Å 1, ge insikt inte bara in i strukturen, men också de dynamiska egenskaper som anläggningen visar. Även SAXS använder röntgenstrålning för att avslöja molekylära struktur, är det till skillnad från XRC däri slumpmässiga isotropiskt orienteringen av partiklar i lösningen inte leder till diffraktion, utan snarare att spridning, som inte kan ge atomär upplösning. Istället genereras en elektron ”kuvert” av makromolekyl som representerar ett genomsnitt av de konformationer som makromolekyl visar. Denna information kan användas i direkt montering av tidigare löst atomär upplösning strukturer för att härleda regioner av flexibilitet i ett enda protein eller delenhet organisation eller dynamik i ett större, flera protein komplex. SAXS data samlas på synkrotroner använder högenergetiska monokromatiska röntgenstrålar eller från interna källor, som erbjuder en svagare röntgen källa som kräver timmar i stället för sekunder av provet exponeringstid (figur 1). SAXS data samlas ofta från flera prover med en enda experiment och buffert, som kräver en längre tid att samla in en runda av användbara data om ett system. Prover bör därför vara stabil och icke-sammanläggning för minst ett par timmar baserat på verifierbar kvalitet kontrollmetoder som dynamiska ljusspridning (DLS) eller analytiska ultracentrifugen (AUC) analys för att få hög kvalitet SAXS data2 , 3. här ger vi en praktisk Beskrivning av SAXS, principerna bakom dess användning, förmåner, begränsningar och provberedning och fokus tungt på datainsamling och analys, tillsammans med att trycka kort på rättsverkan modellering med hjälp av den extracellulära matrix proteiner nidogen-1 och laminin γ-1 som experimentella exempel.

Principer, fördelar och begränsningar av SAXS:

Den vägledande principle(s) bakom SAXS är relativt enkel: en lösning med monodispersed utarbetandet av macromolecule(s) av intresse är placerad inom en kapillär och utsätts för en hög energi monokromatiska X-ray balk. Fotonerna orsaka elektronerna av det atomära-beskjuter börja oscillerande, vilket resulterar i en sfärisk våg som avges av samma energi och våglängd. Eftersom varje elektron kommer att svänga, en konstant bakgrund kommer att uppnås, och den resulterande elektrontätheten av makromolekyl är kontrast till bakgrunden. Den resulterande scattering intensiteten samlas som en funktion av scattering vinkel, 2Θ (figur 1).

Medan andra tekniker såsom XRC, NMR och CEM ger strukturell information på atomär nivå, det finns flera fördelar med SAXS som andra tekniker inte kan tillhandahålla. SAXS kan utföras i nästan alla buffert och kräver inte någon särskild provberedning. Detta är särskilt viktigt att studera beteende och struktur av makromolekyler under varierande förhållanden, såsom närvaron eller frånvaron av mono - eller divalenta katjoner eller förändringar i pH4,5. SAXS har förmågan att ge information om flexibla regioner en makromolekyl6, något andra börsnoterade tekniker kan kämpa med. Därför kan SAXS användas som en stark gratis teknik med stabil portionr av en makromolekyl som studerade med XRC, NRM eller CEM och den hela makromolekyl eller komplexa analyseras i låg upplösning med SAXS och tillsammans med hjälp av olika analysverktyg sådana som FoXSDock7 eller CRYSOL8. Eftersom SAXS är en lösning-teknik, används det ofta för att kontrollera om statiska strukturer såsom de som erhållits från XRC är konsekvent i lösning6. SAXS har också fördelen att vara en teknik som kräver en relativt liten mängd prov investeringar (vanligen 50-100 µL) och en relativt liten mängd experiment tid (30 min - 1 h).

Den största begränsningen av SAXS är sårbarhet att prov aggregering och/eller nedbrytningsprodukter, vilket kan leda till felaktiga strukturella förutsägelser. En aggregering, även så låg som 5%, kan skingra ljus i mycket höga belopp, vilket leder till en överskattning av maximal partikel dimension (Dmax) och tröghetsradie (Rg). Å andra kan prov nedbrytning leda till en underskattning av molekylära egenskaper. Detta säkerhetsproblem uppstår SAXS är en genomsnitt teknik, vilket innebär att prov homogenitet är avgörande för att uppnå tillförlitliga och reproducerbara resultat. Varje prov som ska analyseras av SAXS bör därför genomgå flera metoder för rening och homogenitet kontroller, såsom denaturering och infödda gelelektrofores, storlek utslagning kromatografi, dynamiskt ljus spridning, och analytisk ultracentrifugering. Ofta, körs SAXS linjer prover genom högpresterande vätskekromatografi som en sista kvalitetskontroll steg innan SAXS (S-SAXS)3,9. SAXS data bör samlas vid flera koncentrationer och den Rg av varje datamängd ska jämföras, säkerställa en nära likhet för att undvika interparticle interaktioner och aggregation, vilket resulterar i en överskattning av partikel dimensioner, vilket leder till felaktig dataanalys och modellering. Eftersom spridningen beror på både koncentration och storlek, kan mindre makromolekyler kräva en mer specifik optimering av koncentrationsintervallet. Detta beror på Ömsesidighet teorem, där stora storlekar scatter mot små vinklar och små storlekar mot stora vinklar. Detta yttrar i datainsamling, där jagO är proportionell mot R6, där R är radien partikel. En sista begränsning av SAXS är risken för strålskador till provet under exponering, vilket kan leda till snedvridning av data. Det är god praxis att jämföra prov kvalitet före och efter SAXS prov exponering att säkerställa att detta inte sker.

Protocol

1. SAXS prov förberedelse och datainsamling

  1. Provberedning:
    1. SAXS experiment kräver homogena, stabil och icke-sammanläggning protein prover; iaktta stabilitets- och Oligomera stat med storlek utslagning kromatografi (S), DLS eller AUC före datainsamling.
    2. Ämne prover (nidogen-1 och laminin γ-1 i det här fallet) till DLS analys och tricine SDS-PAGE att visualisera prov renhet10.
      Obs: Prover kan omfatta en serie koncentrationer (1-4 mg/mL) beroende på deras storlek, deras lösning beteende som egenföretagare association och aggregering tillsammans med stabilitet. här, fem koncentrationer av nidogen-1, (139 kDa), tre av laminin γ-1 (109 kDa) och fyra av S-renat equimolar komplexet utarbetades som tidigare beskrivits10.
  2. Datainsamling:
    1. Samla SAXS data med en egen system- eller synchrotron, enligt tillverkarens eller anläggning riktlinjer.
      Obs: Inhämtades uppgifter används i detta arbete använder ett internt system (se Tabell för material) som innehåller en 3-pinhole kamera utrustad med + 002 microfocus sealed tube (Cu Kα strålning på 1,54 Å) och Confocal Max-Flux (CMF) optik på 40 W. Systemet är också utrustat med en 200 nm multi wire 2D detektor för datainsamling. Dock med tillgängligheten av moderna synkrotroner i Frankrike, Tyskland, UK, USA och andra länder, som ger tillgång till en S-SAXS set-up som underlättar separationen av ett monodispersed preparat från eventuell aggregering/nedbrytning, vi nu rutinmässigt samla in data på synkrotron faciliteter. En nyligen publicerad artikel på en DNA G-quadruplex11 är ett exempel på ett S-SAXS data collection strategi. I det här fallet SAXS data samlades in i spänna av 0,08 ≤ q ≤ 0,26 Å 3 timmar för nidogen-1 (2,0, 2,5, 3,0, 3,5 och 4,0 mg/mL); den laminin γ-1 (1,5, 2,0 och 2,5 mg/mL) och deras komplexa (0,8, 1,0, 1,25 och 1,5 mg/mL).
    2. Minska data för buffert och prover med bearbetning programvara specifikt för system. Subtrahera buffert bidrag från protein data med hjälp av ett program som PRIMUS/qt12 (figur 2A).

2. dataanalys

Obs: För närvarande finns det några programvarupaket som är användbara för SAXS dataanalys: ScÅtter43 (nedladdning finns på www.bioisis.net), bioXtas rå44och ATSAS suite13. Detta avsnitt ger en översikt över allmänna åtgärder som vidtas när analysera raw SAXS data med hjälp av ATSAS program svit och särskilda åtgärder från ATSAS 2.8.1 Hämta. Andra program kan användas och diskuteras kort senare.

  1. Buffert subtraktion
    Obs: Dessa steg är relevanta för statiska SAXS prover endast.
    1. Välj alternativet ”öppna” i PRIMUS/qt och välj datafiler av intresse. Tänk på att datafiler måste vara i ASCII-format, där den första kolumnen är den s-vektor-axeln och den andra kolumnen är intensiteten. Upprepa detta steg för data som samlas in för bufferten sig själv genom att infoga informationen i samma meny.
    2. Välj ”SUBTRAHERA” i fönstret databehandling, som kommer att generera en subtraherade scattering kurva som representerar endast spridning från makromolekyl sevärdheter. Upprepa detta steg för varje koncentration.
  2. Guinier analys
    1. För att utföra Guinier analys, läsa in en buffert subtraheras scatter kurva i PRIMUS/qt som tidigare beskrivits i steg 2.1.1.
    2. Klicka på ”radie av Gyration” som fortsätter i öppna guiden Primus Guinier; en tomt på ln(I) vs q2 visas.
    3. För att få Använd en preliminär Rg funktionen ”AUTORG”, som är en extern modul inbyggd i PRIMUS/qt. hitta knappen ”Autorg” och klicka på den.
    4. Mata in flera filer samtidigt genom att markera dem alla och infoga dem i menyn på höger sida, mycket lik 2.1.1.
    5. Använda Guinier tomten skapade tidigare att bedöma kvaliteten på uppgifterna; den gröna linjen under Guinier tomten visar residualerna tomten som representerar en linjäritet passar. Vara medveten om att icke-linjäritet i Guinier analysen kan vara ett tecken på prov aggregering och ytterligare analys bör inte utföras i det här fallet.
      Obs: En linjär Guinier passform ger en Rg med ett litet fel (< 5%) och föreslår ett högkvalitativt urval.
  3. Kratky analys
    1. Ladda data till visualiseras på ett liknande sätt som beskrivs ovan.
    2. Klicka på ”Välj rutan” bredvid namnet på filen. Detta kommer att rita data i ett separat fönster.
    3. Klicka på knappen ”PLOT” följt av ”Kartky tomten” val i rullgardinsmenyn.
    4. Detta kommer att rita data som ”q2 x L(q) vs q”. Tänk på att globulära proteiner visar en Gaussisk topp, medan Övik proteiner visar en platå i stället för en topp och likna en hyperbolisk tomt17.
  4. Data samgående
    1. Load buffert subtraheras data för varje koncentration i PRIMUS/qt återigen, som i steg 2.1.1.
    2. För att sammanfoga data, klicka på knappen ”dokument” i den behandling fönstret.
    3. Inspektera varje kurva och I skala nummer, som korrelerar till de spädningar som gjorts från det ursprungliga provet.
      Anmärkning: Prover vid högre koncentration Visa mindre buller i regionen svans i kurvorna.
  5. P(r) Distribution
    1. För att generera P(r) tomten, Fyll på sammanslagna data kurvorna i PRIMUS/qt som tidigare beskrivits.
    2. Klicka på knappen ”avstånd Distribution” att öppna ett nytt fönster som presenterar kopplade data av intensiteten av spritt ljus vs. q och par-avstånd distribution funktion tomt på höger sida.
      Obs: Informationen på höger sida presenterar den övergripande kvaliteten på par-avstånd distribution funktion beräkningarna.
    3. Justera data för kopplade data att undvika någon betydande buller i svansen slutet av rådata.
    4. Utelämna datapunkter nära hållplatsen balk i regionen låg-q.
    5. Att bestämma Dmax, start med ett utbud av ~ 5 gånger Rg Guinier analysresultaten. Gradvis minska detta värde tills P(r) tomten inte abrupt sjunker till noll på y-axeln och inte har en lång svans innan närmar sig noll.
    6. Kontrollera att den experimentella Rg/jag0 (härlett från Guinier tillnärmning) och P(r), Rg/jag0siffror är liknande.
      Obs: I vissa fall ytterligare manipulation på spänna av data, datapunkter och ALPHA (en regularization parameter som talar om för programmet förhållandet mellan hur mycket uppmärksamhet ägnas åt jämnhet fördelningen jämfört med passande experimentella data) är också krävs21 att få en god kvalitet P(r) tomt.

3. enb initio pärla modellering och genomsnitt

  1. När de insamlade vid flera koncentrationer sammanfogas, eller den data som samlas in med S-SAXS minimeras, och Kratky tomt, P(r) handlingen och Guinier analys har verifierats, beräkna lågupplösta strukturer av makromolekyler och sina komplex. Denna pipeline kan användas för att studera lösning strukturer och interaktioner av nukleinsyror, proteiner och nukleinsyror-protein eller protein-protein komplex10,11,21,22,23 ,24,25,26,27,28,29,30,31,32 ,33,34. En av de mest populära programmen är DAMMIN, utvecklat av Svergun35 och en del av den ATSAS paket13, som sysselsätter simulerade glödgning protokoll med preliminära ingående information om Rg och Dmax . Rättsverkan modellering metoder och principer beskrivs i detalj på annan plats18,36.

Representative Results

Den strategi för analys av data som beskrivs ovan utnyttjades för att beräkna Rg och Dmax för nidogen-1, laminin γ-1 och deras komplex med funktionen P(r). Vi fick Rg -värden 7,20 (±0.10) nm, 8.10 (±0.20) nm och 10,9 (0,4) nm för nidogen-1, laminin γ-1 och deras komplexa respektive (figur 2A-B). I tillägg, Dmax värden 24 nm, 26 nm och 35 nm för nidogen-1, laminin γ-1 och deras komplexa respektive (figur 2)10 erhölls. DAMMIF programmet användes för att hämta lågupplösta strukturer av nidogen-1 och laminin γ-1, som föreslog att båda proteiner anta en utökad form i lösning. X och NSD värdena för nidogen-1 (~ 1 och 0,8) och laminin γ-1 (~0.9 och 0,8 respektive) var också i det godkända intervallet. Anpassningen av högupplöst strukturer, två domäner för nidogen-1 och två av laminin γ-1, på deras lågupplösta strukturer som erhållits med SAXS tillåtna identifiering av sin N - och C-terminal regioner10.

Nidogen-1 identifierades som en samverkande partner laminin γ-139,40 och webbplatsen interaktion var mappade med röntgenkristallografi i C-terminal domäner41. Dock, högupplöst strukturer involverade endast samverkande domäner och inte hellångt nidogen-1 eller hela laminin γ-1 armen. Därför renas vi en komplex innehåller nidogen-1 (full längd) och laminin γ-1 arm att identifiera de samverkande regionerna samt för att studera relativa orienteringen för de N-terminala domänerna av både proteiner. SAXS data för anläggningen gav en Rg 10,9 (0,4) nm och en Dmax 35 nm. Vi utnyttjade MONSA för att erhålla den lågupplösta strukturen i hela komplexet, som föreslog att faktiskt endast C-terminal regionen av både proteiner delta i medla interaktioner, medan resten av domänerna är långt ifrån varandra ( Figur 3, Video 1).

Figure 1
Figur 1. Scheman över SAXS set-up. En monodispersed beredning av biomolekyler eller deras komplex är beredd, följt av exponering med hög energi röntgenstrålar. Energin från röntgen och provet till källa avstånd kan variera beroende på källan (t.ex., in-house vs. synkrotron). Röntgenstrålarna spridning mönster (som beror på storleken och formen av biomolekyler) registreras och radiellt i genomsnitt för att få en 1-dimensionella tomt (1D) som innehåller information om intensiteten av spritt ljus med avseende på scattering vinkel. Som buffert molekyler scatter också ljus, subtraheras bidragen från dessa molekyler för att få en spridning mönster av biomolekyler sevärdheter. På synchrotron, före SAXS datainsamling, utförs också normalt en ytterligare reningssteg som använder i linjens storlek utslagning/högpresterande vätskekromatografi (ovanifrån). Detta steg är avgörande för att ta bort någon aggregerad och/eller försämrade produkt samt att ta bort eventuella obundna biomolekyler från anläggningen. 1D scattering tomten konverteras till elektron par-avstånd fördelningen tomten (P(r) tomt), som ger radien tröghetsradie och maximal partikel dimensionen av biomolekyler. Denna tomt används som indatafil för den rättsverkan modellering paket (dvs, DAMMIN/DAMMIF) för att erhålla lågupplösta strukturer av biomolekyler, eller andra paket (dvs. SASREF/CORAL) om högupplösta strukturen av delar av den biomolekyler eller enskilda biomolekyler i komplexet är känd.  Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. (A) en tomt på en intensiteten av spritt ljus vs. scattering vinkel (q = 4πsinθ/λ, nm-1) tyder på kvaliteten på biomolekyler (låg region) och form (hög region) av biomolekyler. (B) elektron par-avstånd fördelningen P(r) bestäms från scattering data tyder på en avlång form av biomolekyler under utredning (laminin γ-1, nidogen-1 och deras komplexa). (C) Kratky tomt vilket tyder på att nidogen-1 och laminin γ-1 proteiner är inte Övik. (D) Guinier tomt för nidogen-1, laminin γ-1 och deras komplexa, vilket indikerar linjär regionen för bestämning av radien tröghetsradie med hjälp av data i låg-scattering vinkel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Komplex av nidogen-1 och laminin γ-1 erhålls genom analys av sammanslagna data med hjälp av programmet MONSA lågupplösta struktur. Färgschemat är samma som bild 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Movie 1
Video 1. Lågupplöst strukturen av nidogen-1 och laminin γ-1 komplex. Denna film var beredd med PYMOL för att visualisera olika strukturella funktioner av komplexa. Kristallstrukturen av laminin-nidogen komplexet (PDB-ID: 1NPE) visas som band tecknat, belyser de interagerar platser för denna anläggning. Färgschemat är samma som bild 2. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Discussion

De kritiska steg SAXS data analys beskrivs i avsnittet protokollet av detta papper inkludera buffert subtraktion, Guinier analys, Kratky analys, data samgående och P(r) distribution. Rättsverkan pärla modellering är alltför omfattande för att täckas här i detalj och omfattas därför endast kortfattat.

På synkrotroner (e.g. DESY i Tyskland, DIAMOND i Storbritannien och ESRF i Frankrike), är det möjligt att samla in SAXS data för en mycket liten bråkdel (~ några mikroliter) av varje prov som fraktionerna som elueras från kolumnen s som är anslutna i linje (se bild 1 ). Elastiskt spridda SAXS data är radiellt i genomsnitt de paket som tillhandahålls av instrumenttillverkaren eller av synkrotron innan buffert subtraktion kan äga rum. Den resulterande 1D data representerar mängden spritt ljus (i jag(q)) på Y-axeln och scattering vinkel (q= 4πsinθ/λ, där λ är våglängden av incident X-strålar) och beskrivs i figur 1. Programmet PRIMUS/qt12 används för att direkt subtrahera någon bakgrund på grund av buffert och beskrivs i avsnitt 1.1. Andra program såsom; ScÅtter43 (nedladdning finns på www.bioisis.net) med en tutorial finns på https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeA, och bioXtas rå44 (tillgänglig på https:// bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html) kan användas som ett alternativ till ATSAS paketet.

Guinier analysen ger information om provet aggregering och homogenitet samt föreskriver makromolekyl av intresse utifrån SAXS data från låg s region14den radie av Gyration (Rg). En tomt är konstruerad med PRIMUS/qt för SAXS data som erhållits från varje koncentration, följt av kurva montering med den maximala räckvidden upp till 1,30 för q x Rg. En monodispersed provberedning bör ger en linjär Guinier tomt i denna region (figur 2D), medan aggregering resultat i en ickelinjär Guinier tomt15,16. Om Guinier analysen är linjär, kan graden av ”unfoldedness” av en makromolekyl sevärdheter observeras med Kratky tomten, vilket är användbart vid beslut om huruvida att utföra stel kropp modellering eller konstruera ensembler av lågupplösta modeller. Ett globulärt protein kommer att visas i en Kratky komplott för att ha en klockformad kurva, medan extended molekyler eller Övik peptider verkar platå eller även öka i större q intervallet och saknar bell-form (figur 2 c).

Bara att få den Rg från Guinier analys anser datapunkter från regionen låg q av 1 D spridningsdiagrammet (figur 2D), det är dock möjligt att använda nästan hela datamängden för att genomföra en indirekt Fourier-transformation att konvertera den ömsesidiga-space informationen av ln (I (q)) vs. (q) i en fördelningsfunktionen för verkliga rymden-avstånd (P(r)) som ger information på Dmax och Rg (Figur 2B) Form av P(r) tomten representerar brutto lösning konformation av makromolekyl intresse18,19. omvandlingen av ömsesidiga-space data till real-space data är ett kritiskt steg men en detaljerad beskrivning är inte inom ramen för denna uppsats. Därför hänvisa till en artikel av Svergun20 att förstå varje parameter.

När bufferten subtraheras data på enskilda koncentrationer som bearbetas genom Guinier analys med ett konsekvent värde för Rg, följt av undersöka sina fällbara mönster med Kratky analys, dessa data kan slås samman. Kopplade data presenteras för nidogen-1, laminin γ-1 och deras komplexa bearbetades enligt ovan och den resulterande P(r) tomter i figur 2B. Helst bör man också beräkna den par-avstånd fördelningsfunktionen P(r) för varje koncentration att avgöra om SAXS data samlas in för varje koncentration ger liknande Rg och Dmax värden. Om de Rg och Dmax förblir liknande över ett brett spektrum av koncentrationer, då användaren bör gå vidare. Det bör noteras att data beroende på signalen, kan trunkeras innan data samgående. Detta är ofta fallet om de koncentrationer och/eller molekylvikt av makromolekyler under utredning är låg.

Lågupplöst form analys med DAMMIN kan utföras i olika lägen (t.ex. snabb, långsam, Expert lägen, etc.). Snabb läge är en perfekt första steg att utvärdera om P(r) tomten ger bra kvalitet modeller. Normalt bör minst 10 modeller erhållas för varje P(r) komplott för att kontrollera om reproducerbara resultat, när det gäller den lågupplösta strukturen, erhålls, med en låg godhet fit parameter kallas χ (ett värde på 0,5-1,0 anses bra baserat på vårt omfattande arbete ), ett värde som beskriver ett avtal mellan experimentellt insamlade SAXS data och modell-härledda data. I publikationen syfte vi vanligtvis använda långsam eller Expert läge och beräkna minst 15 modeller. Utöver DAMMIN, en snabbare version av det, DAMMIF37, samt GASBOR38 finns också alternativ. Dessutom, för att studera protein-protein eller protein-nucleic acid komplex, är det möjligt att använda MONSA program35, vilket underlättar samtidig montering av enskilda SAXS data för makromolekyler såväl som deras komplex. För mer information om högupplösta modellberäkningar samt för RNA-protein interaktionsstudier, se en artikel nyligen av Patel et al3.

SAXS är teoretiskt enkel men utan tvekan en mycket kompletterande metod till andra strukturbiologi verktyg och resultat i lågupplöst strukturella uppgifter som kan användas på egen hand eller tillsammans med högupplösta tekniker för att belysa information om makromolekylära struktur och dynamik. Så länge en monodispersed beredning av makromolekyler och deras komplex kan erhållas, kan SAXS utnyttjas för att studera i-lösning struktur och interaktioner av någon typ av biologiska makromolekyl. När det gäller de komplexa som diskuteras här, det är anmärkningsvärt att mindre än 10% av den totala tillgängliga ytan kväve-1 och laminin γ-1 är begravd i detta komplex, medan resten av domänerna av både proteiner är fritt tillgängliga att interagera med andra proteiner på den extracellulära matrixen att upprätthålla dess strukturella stelhet (figur 3). Att få sådan information för en komplex med ~ 240kDa skulle vara mycket utmanande med andra strukturbiologi tekniker såsom röntgenkristallografi, NMR och Cryo-EM mikroskopi.

Avtäckning proteinstruktur via röntgenkristallografi eller NMR är en inneboende tidskrävande process. Denna flaskhals i strukturbestämning är ett område där SAXS visar sin styrka som en strukturell teknik; datainsamling för en enda SAXS experiment kan ta mindre än en timme och med hjälp av strömlinjeformad analysprogram, analys kan ske snabbt och effektivt. SAXS har potential att kraftigt öka genomströmningen av strukturella studier som en fristående teknik eftersom det ger en lågupplöst modell av makromolekylära struktur innan högupplösta data är tillgängliga. Ett hinder för andra strukturella tekniker är kravet för en mycket ren, koncentrerad prov för datainsamling, vilket kräver en hög nivå av proteinuttryck och stabilitet över en lång tidsperiod. Medan SAXS prover också måste vara ren och koncentrerad, provmängder är ungefär 100 µL att göra SAXS en relativt billig analysmetod som jämfört med andra strukturella tekniker. Dessutom blir SAXS tillsammans med storlek utslagning kromatografi allt vanligare som ger en ytterligare kvalitetskontroll steg. Nyligen har det varit stark framsteg i kombinationen av NMR och SAXS data med hjälp av den Ensemble optimering metod (EOM)45,46 för att belysa flexibla system. I en nyligen papper av Mertens och Svergun47beskriver författarna flera aktuella exempel på EOM SAXS i kombination med NMR, tillsammans med många andra exempel på SAXS data som används i samband med NMR. Framsteg görs kontinuerligt inom SAXS, och nya tekniker håller på att utvecklas för SAXS att användas tillsammans med, inte bara gratis till, andra strukturella tekniker. Följaktligen tror vi att efterfrågan på SAXS endast kommer att öka med tiden, särskilt i samband med NMR att karakterisera dynamiska system där funktioner definieras av flexibilitet.

Disclosures

Författarna har inga upplysningar att deklarera.

Acknowledgments

Detta projekt har fått stöd av NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta Innovation Program (RCP-12-002 C) och Alberta Prion Research Institute / Alberta utvecklar Bio lösningar (201600018) bidrag till M.O. TRP är en Kanada forskning stol i RNA & Protein biofysik (201704) och erkänner NSERC Discovery grant (RGPIN-2017-04003). TM är finansierad av NSERC Discovery bidraget till TRP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK 293 EBNA Cell Line In-Lab availability - Cell line used to overexpress protein(s)
Ni Sepharose High Performance histidine-tagged protein purification resin GE Healthcare 17524801 Affinity protein purification resin
Superdex 200 Increase 10/300 GE Healthcare 28990944 SEC Column
ÄKTA Pure FPLC GE Healthcare - FPLC System
Nanodrop Nanodrop - Spectrophotometer
Basic Reagents (NaCl, Tris-HCl etc.)
S-MAX3000 Rigaku - SAXS Pinhole Camera System
Zetasizer Nano-S Malvern Instruments Ltd - Dynamic Light Scattering instrument
0.1µm Filter Millipore JVWP04700 Used to Concentrate Sample Prior to DLS
Thrombin cleavage kit abcam ab207000 Thrombin cleavage to remove His tag
Strep-Tactin Sepharose Column IBA 2-1201-010 Strep-Tag Affinity Purification
D-desthiobiotin Sigma-Aldrich 533-48-2 Elution of Strep Tag Protein
Software
SAXGUI Rigaku - Data Collection for SAXS and data reduction
ATSAS Suit Franke et al., 2017 - SAXS Data Analysis Software program suite
PRIMUS Konarev et al., 2003 - Buffer Subtraction
GNOM Svergun, 1992 - Rg, Dmax and p(r) Calculation
DAMMIF Franke and Svergun, 2009 - Ab initio model calculation
DAMAVER Volkov and Svergun, 2003 - Averaged Solution Conformation calculations
MONSA Svergun, 1999 - Simultaneous model fitting for the complex
GASBOR Svergun et al., 2001 - Alternative Ab initio model calculations
DTS Software V6.20 Malvern Instruments Ltd - DLS supplied instrument software
PyMOL Schrodinger, LLC. - The PyMOL Molecular Graphics System V2.0
The Protein Data Bank Berman et al., 2000 - PDB ID: 1NPE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Advances in structure analysis using small-angle scattering in solution. Current Opinion in Structural Biology. 12, (5), 654-660 (2002).
  2. Patel, T. R., Chojnowski, G., Koul, A., McKenna, S. A., Bujnicki, J. M. Structural studies of RNA-protein complexes: A hybrid approach involving hydrodynamics, scattering, and computational methods. Methods. 118, 146-162 (2017).
  3. Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8, (4), 409-427 (2016).
  4. Uversky, V. N., Gillespie, J. R., Fink, A. L. Why are “natively unfolded” proteins unstructured under physiologic conditions? Proteins. 41, (3), 415-427 (2000).
  5. Uversky, V. N., Gillespie, J. R., Millett, I. S., Khodyakova, A. V., Vasiliev, A. M., Chernovskaya, T. V., Abramov, V. M. Natively Unfolded Human Prothymosin α Adopts Partially Folded Collapsed Conformation at Acidic pH. Biochemistry. 38, (45), 15009-15016 (1999).
  6. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Letters. 589, (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  7. Schneidman-Duhovny, D., Hammel, M., Tainer, J. A., Sali, A. FoXS, FoXSDock and MultiFoXS: Single-state and multi-state structural modeling of proteins and their complexes based on SAXS profiles. Nucleic Acids Research. 44, 424-429 (2016).
  8. Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL - a Program to Evaluate X-ray Solution Scattering of Biological Macromolecules from Atomic Coordinates. Journal of Applied Crystallography. 28, (6), 768-773 (1995).
  9. Pérez, J., Vachette, P. A Successful Combination: Coupling SE-HPLC with SAXS. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1009, 183-199 (2017).
  10. Patel, T. R., Bernards, C., Meier, M., McEleney, K., Winzor, D. J., Koch, M., Stetefeld, J. Structural elucidation of full-length nidogen and the laminin-nidogen complex in solution. Matrix Biology. 33, 60-67 (2014).
  11. Meier, M., Moya-Torres, A., Krahn, N. J., McDougall, M. D., Orriss, G. L., McRae, E. K. S. Structure and hydrodynamics of a DNA G-quadruplex with a cytosine bulge. Nucleic Acids Research. (2018).
  12. Franke, D., Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Panjkovich, A., Tuukkanen, A., Mertens, H. D. T. ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50, 1212-1225 (2017).
  13. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36, (5), 1277-1282 (2003).
  14. Tuukkanen, A. T., Svergun, D. I. Weak protein-ligand interactions studied by small-angle X-ray scattering. The FEBS Journal. 281, (8), 1974-1987 (2014).
  15. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496, (7446), 477-481 (2013).
  16. Koch, M. H., Vachette, P., Svergun, D. I. Small-angle scattering: a view on the properties, structures and structural changes of biological macromolecules in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 36, (2), 147-227 (2003).
  17. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40, (3), 191-285 (2007).
  18. Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Applications of small-angle X-ray scattering to biomacromolecular solutions. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45, (2), 429-437 (2013).
  19. Svergun, D. I. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25, (4), 495-503 (1992).
  20. Patel, T. R., Morris, G. A., Zwolanek, D., Keene, D. R., Li, J., Harding, S. E. Nano-structure of the laminin γ-1 short arm reveals an extended and curved multidomain assembly. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 29, (7), 565-572 (2010).
  21. Patel, T. R., Reuten, R., Xiong, S., Meier, M., Winzor, D. J., Koch, M., Stetefeld, J. Determination of a molecular shape for netrin-4 from hydrodynamic and small angle X-ray scattering measurements. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 31, (2), 135-140 (2012).
  22. Dzananovic, E., Patel, T. R., Deo, S., McEleney, K., Stetefeld, J., McKenna, S. A. Recognition of viral RNA stem-loops by the tandem double-stranded RNA binding domains of PKR. RNA. 19, (3), New York, N.Y. 333-344 (2013).
  23. Meier, M., Patel, T. R., Booy, E. P., Marushchak, O., Okun, N., Deo, S. Binding of G-quadruplexes to the N-terminal recognition domain of the RNA helicase associated with AU-rich element (RHAU). The Journal of Biological Chemistry. 288, (49), 35014-35027 (2013).
  24. Dzananovic, E., Patel, T. R., Chojnowski, G., Boniecki, M. J., Deo, S., McEleney, K. Solution conformation of adenovirus virus associated RNA-I and its interaction with PKR. Journal of Structural Biology. 185, (1), 48-57 (2014).
  25. Bacik, J. -P., Tavassoli, M., Patel, T. R., McKenna, S. A., Vocadlo, D. J., Khajehpour, M., Mark, B. L. Conformational itinerary of Pseudomonas aeruginosa 1,6-anhydro-N-acetylmuramic acid kinase during its catalytic cycle. The Journal of Biological Chemistry. 289, (7), 4504-4514 (2014).
  26. Deo, S., Patel, T. R., Dzananovic, E., Booy, E. P., Zeid, K., McEleney, K. Activation of 2’ 5’-oligoadenylate synthetase by stem loops at the 5’-end of the West Nile virus genome. PloS One. 9, (3), e92545 (2014).
  27. Vadlamani, G., Thomas, M. D., Patel, T. R., Donald, L. J., Reeve, T. M., Stetefeld, J., Mark, B. L. The β-lactamase gene regulator AmpR is a tetramer that recognizes and binds the D-Ala-D-Ala motif of its repressor UDP-N-acetylmuramic acid (MurNAc)-pentapeptide. The Journal of Biological Chemistry. 290, (5), 2630-2643 (2015).
  28. Deo, S., Patel, T. R., Chojnowski, G., Koul, A., Dzananovic, E., McEleney, K., McKenna, S. A. Characterization of the termini of the West Nile virus genome and their interactions with the small isoform of the 2’ 5’-oligoadenylate synthetase family. Journal of Structural Biology. 190, (2), 236-249 (2015).
  29. Ariyo, E. O., Booy, E. P., Patel, T. R., Dzananovic, E., McRae, E. K., Meier, M., McKenna, S. A. Biophysical Characterization of G-Quadruplex Recognition in the PITX1 mRNA by the Specificity Domain of the Helicase RHAU. PloS One. 10, (12), (2015).
  30. Hyde, E. I., Callow, P., Rajasekar, K. V., Timmins, P., Patel, T. R., Siligardi, G., Scott, D. J. Intrinsic disorder in the partitioning protein KorB persists after co-operative complex formation with operator DNA and KorA. The Biochemical Journal. 474, (18), 3121-3135 (2017).
  31. Dzananovic, E., Astha, null, Chojnowski, G., Deo, S., Booy, E. P., Padilla-Meier, P., McKenna, S. A. Impact of the structural integrity of the three-way junction of adenovirus VAI RNA on PKR inhibition. PloS One. 12, (10), (2017).
  32. Krahn, N., Meier, M., To, V., Booy, E. P., McEleney, K., O’Neil, J. D., Stetefeld, J. Nanoscale Assembly of High-Mobility Group AT-Hook 2 Protein with DNA Replication Fork. Biophysical Journal. 113, (12), 2609-2620 (2017).
  33. Patel, T. R., Besong, T. M. D., Meier, M., McEleney, K., Harding, S. E., Winzor, D. J., Stetefeld, J. Interaction studies of a protein and carbohydrate system using an integrated approach: a case study of the miniagrin-heparin system. European Biophysics Journal: EBJ. (2018).
  34. Svergun, D. I. Restoring low resolution structure of biological macromolecules from solution scattering using simulated annealing. Biophysical Journal. 76, (6), 2879-2886 (1999).
  35. Blanchet, C. E., Svergun, D. I. Small-Angle X-Ray Scattering on Biological Macromolecules and Nanocomposites in Solution. Annual Review of Physical Chemistry. 64, (1), 37-54 (2013).
  36. Volkov, V. V., Svergun, D. I. Uniqueness of ab initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 36, 860-864 (2003).
  37. Kozin, M. B., Svergun, D. I. Automated matching of high- and low-resolution structural models. Journal of Applied Crystallography. 34, (1), 33-41 (2001).
  38. Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42, (Pt 2), 342-346 (2009).
  39. Svergun, D. I., Petoukhov, M. V., Koch, M. H. J. Determination of Domain Structure of Proteins from X-Ray Solution Scattering. Biophysical Journal. 80, (6), 2946-2953 (2001).
  40. Baumgartner, R., Czisch, M., Mayer, U., Pöschl, E., Huber, R., Timpl, R., Holak, T. A. Structure of the nidogen binding LE module of the laminin gamma1 chain in solution. Journal of Molecular Biology. 257, (3), 658-668 (1996).
  41. Stetefeld, J., Mayer, U., Timpl, R., Huber, R. Crystal structure of three consecutive laminin-type epidermal growth factor-like (LE) modules of laminin gamma1 chain harboring the nidogen binding site. Journal of Molecular Biology. 257, (3), 644-657 (1996).
  42. Takagi, J., Yang, Y., Liu, J. -H., Wang, J. -H., Springer, T. A. Complex between nidogen and laminin fragments reveals a paradigmatic beta-propeller interface. Nature. 424, (6951), 969-974 (2003).
  43. Förster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J. Appl. Cryst. 43, 639-646 (2010).
  44. Hopkins, J. B., Gillilan, R. E., Skou, S. BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis. J. Appl. Cryst. 50, 1545-1553 (2017).
  45. Bernadó, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. (17), 5656-5664 (2007).
  46. Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2, (Pt 2), 207-217 (2015).
  47. Mertens, H. D. T., Svergun, D. I. Combining NMR and small angle X-ray scattering for the study of biomolecular structure and dynamics. Arch Biochem Biophys. 628, 33-41 (2017).
Strukturella studier av makromolekyler i lösningen med små Angle X-Ray Scattering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mrozowich, T., McLennan, S., Overduin, M., Patel, T. R. Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering. J. Vis. Exp. (141), e58538, doi:10.3791/58538 (2018).More

Mrozowich, T., McLennan, S., Overduin, M., Patel, T. R. Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering. J. Vis. Exp. (141), e58538, doi:10.3791/58538 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter