Här presenterar vi hur små Angle X-Ray Scattering (SAXS) kan utnyttjas för att få information på lågupplösta kuvert som representerar de makromolekylära strukturerna. När den används tillsammans med högupplösta strukturella tekniker såsom röntgenkristallografi och kärnmagnetisk resonans, kan SAXS ge detaljerade inblickar i flera domäner proteiner och makromolekylärt komplex i-lösning.
Protein-protein interaktioner mellan proteiner med flera klotformig domäner presentera tekniska utmaningar för att avgöra hur en sådan komplex form och hur domäner orienterade/placerad. Här beskrivs ett protokoll med potential för att klarlägga vilka specifika domäner medla interaktioner i flerkomponents systemet genom rättsverkan modellering. En metod för beräkning av makromolekyler och deras församlingar strukturer på lösning tillhandahålls som innebär att integrera data från små angle X-ray scattering (SAXS), kromatografi och atomär upplösning strukturer tillsammans i en hybrid strategi. Ett konkret exempel är komplex av fullängds nidogen-1, som monterar extracellulära matrix proteiner och bildar en utökad, böjda nanostruktur. En av dess klotformig domäner fäster laminin γ-1, som strukturerar basalmembranet. Detta ger en grund för att fastställa korrekta strukturer av flexibla flera domäner proteinkomplex och aktiveras av synkrotron källor tillsammans med robotteknik och storlek utslagning kromatografi automationssystem. Denna kombination tillåter snabb analys i vilken flera Oligomera tillstånd är skilda strax före SAXS datainsamling. Analysen ger information om radien av gyration, partikel dimension, molekylära form och interdomain ihopkoppling. Protokollet för att skapa 3D-modeller av komplex genom att montera högupplöst strukturer av proteinerna som komponent ges också.
Cellerna innehåller intrikata nätverk av proteiner som fungerar som molekylära maskiner att utföra cellulära funktioner såsom signalering kaskader och bibehålla strukturella integritet. De sätt på vilka dessa olika komponenter flytta och interagera i tredimensionella rymden ger upphov till specifika funktioner av makromolekyler. Vikten av Proteiners struktur, dynamik och interaktioner för att fastställa funktion har lämnat behovet av ständigt föränderliga och komplexa tekniker för att mäta dessa egenskaper. Av dessa, kärnmagnetisk resonans (NMR), röntgenkristallografi (XRC) och mer nyligen, Cryo-Electron Microscopy (CEM) ger högupplösta strukturell information. Dock XRC och CEM avkastning strukturer i en av många Biomolekylär stater och saknar information om dynamiken av proteinstruktur, medan 3D strukturbestämning av NMR är vanligtvis begränsad till mindre globulära proteiner. Ett sätt att övervinna dessa begränsningar är att utnyttja små vinkel X-Ray Scattering (SAXS) för att generera molekylär kuvert av stora, flera domäner eller komplexa system och kombinera de högupplösta styva makromolekylära strukturerna för att belysa den globala arkitektur och dynamiska funktioner.
SAXS producerar lågupplösta kuvert av makromolekylära komplex med en upplösning på cirka 10-20 Å 1, ge insikt inte bara in i strukturen, men också de dynamiska egenskaper som anläggningen visar. Även SAXS använder röntgenstrålning för att avslöja molekylära struktur, är det till skillnad från XRC däri slumpmässiga isotropiskt orienteringen av partiklar i lösningen inte leder till diffraktion, utan snarare att spridning, som inte kan ge atomär upplösning. Istället genereras en elektron ”kuvert” av makromolekyl som representerar ett genomsnitt av de konformationer som makromolekyl visar. Denna information kan användas i direkt montering av tidigare löst atomär upplösning strukturer för att härleda regioner av flexibilitet i ett enda protein eller delenhet organisation eller dynamik i ett större, flera protein komplex. SAXS data samlas på synkrotroner använder högenergetiska monokromatiska röntgenstrålar eller från interna källor, som erbjuder en svagare röntgen källa som kräver timmar i stället för sekunder av provet exponeringstid (figur 1). SAXS data samlas ofta från flera prover med en enda experiment och buffert, som kräver en längre tid att samla in en runda av användbara data om ett system. Prover bör därför vara stabil och icke-sammanläggning för minst ett par timmar baserat på verifierbar kvalitet kontrollmetoder som dynamiska ljusspridning (DLS) eller analytiska ultracentrifugen (AUC) analys för att få hög kvalitet SAXS data2 , 3. här ger vi en praktisk Beskrivning av SAXS, principerna bakom dess användning, förmåner, begränsningar och provberedning och fokus tungt på datainsamling och analys, tillsammans med att trycka kort på rättsverkan modellering med hjälp av den extracellulära matrix proteiner nidogen-1 och laminin γ-1 som experimentella exempel.
Principer, fördelar och begränsningar av SAXS:
Den vägledande principle(s) bakom SAXS är relativt enkel: en lösning med monodispersed utarbetandet av macromolecule(s) av intresse är placerad inom en kapillär och utsätts för en hög energi monokromatiska X-ray balk. Fotonerna orsaka elektronerna av det atomära-beskjuter börja oscillerande, vilket resulterar i en sfärisk våg som avges av samma energi och våglängd. Eftersom varje elektron kommer att svänga, en konstant bakgrund kommer att uppnås, och den resulterande elektrontätheten av makromolekyl är kontrast till bakgrunden. Den resulterande scattering intensiteten samlas som en funktion av scattering vinkel, 2Θ (figur 1).
Medan andra tekniker såsom XRC, NMR och CEM ger strukturell information på atomär nivå, det finns flera fördelar med SAXS som andra tekniker inte kan tillhandahålla. SAXS kan utföras i nästan alla buffert och kräver inte någon särskild provberedning. Detta är särskilt viktigt att studera beteende och struktur av makromolekyler under varierande förhållanden, såsom närvaron eller frånvaron av mono – eller divalenta katjoner eller förändringar i pH4,5. SAXS har förmågan att ge information om flexibla regioner en makromolekyl6, något andra börsnoterade tekniker kan kämpa med. Därför kan SAXS användas som en stark gratis teknik med stabil portionr av en makromolekyl som studerade med XRC, NRM eller CEM och den hela makromolekyl eller komplexa analyseras i låg upplösning med SAXS och tillsammans med hjälp av olika analysverktyg sådana som FoXSDock7 eller CRYSOL8. Eftersom SAXS är en lösning-teknik, används det ofta för att kontrollera om statiska strukturer såsom de som erhållits från XRC är konsekvent i lösning6. SAXS har också fördelen att vara en teknik som kräver en relativt liten mängd prov investeringar (vanligen 50-100 µL) och en relativt liten mängd experiment tid (30 min – 1 h).
Den största begränsningen av SAXS är sårbarhet att prov aggregering och/eller nedbrytningsprodukter, vilket kan leda till felaktiga strukturella förutsägelser. En aggregering, även så låg som 5%, kan skingra ljus i mycket höga belopp, vilket leder till en överskattning av maximal partikel dimension (Dmax) och tröghetsradie (Rg). Å andra kan prov nedbrytning leda till en underskattning av molekylära egenskaper. Detta säkerhetsproblem uppstår SAXS är en genomsnitt teknik, vilket innebär att prov homogenitet är avgörande för att uppnå tillförlitliga och reproducerbara resultat. Varje prov som ska analyseras av SAXS bör därför genomgå flera metoder för rening och homogenitet kontroller, såsom denaturering och infödda gelelektrofores, storlek utslagning kromatografi, dynamiskt ljus spridning, och analytisk ultracentrifugering. Ofta, körs SAXS linjer prover genom högpresterande vätskekromatografi som en sista kvalitetskontroll steg innan SAXS (S-SAXS)3,9. SAXS data bör samlas vid flera koncentrationer och den Rg av varje datamängd ska jämföras, säkerställa en nära likhet för att undvika interparticle interaktioner och aggregation, vilket resulterar i en överskattning av partikel dimensioner, vilket leder till felaktig dataanalys och modellering. Eftersom spridningen beror på både koncentration och storlek, kan mindre makromolekyler kräva en mer specifik optimering av koncentrationsintervallet. Detta beror på Ömsesidighet teorem, där stora storlekar scatter mot små vinklar och små storlekar mot stora vinklar. Detta yttrar i datainsamling, där jagO är proportionell mot R6, där R är radien partikel. En sista begränsning av SAXS är risken för strålskador till provet under exponering, vilket kan leda till snedvridning av data. Det är god praxis att jämföra prov kvalitet före och efter SAXS prov exponering att säkerställa att detta inte sker.
De kritiska steg SAXS data analys beskrivs i avsnittet protokollet av detta papper inkludera buffert subtraktion, Guinier analys, Kratky analys, data samgående och P(r) distribution. Rättsverkan pärla modellering är alltför omfattande för att täckas här i detalj och omfattas därför endast kortfattat.
På synkrotroner (e.g. DESY i Tyskland, DIAMOND i Storbritannien och ESRF i Frankrike), är det möjligt att samla in SAXS data för en mycket liten bråkdel (~ några mikroliter) av varje prov som fraktionerna som elueras från kolumnen s som är anslutna i linje (se bild 1 ). Elastiskt spridda SAXS data är radiellt i genomsnitt de paket som tillhandahålls av instrumenttillverkaren eller av synkrotron innan buffert subtraktion kan äga rum. Den resulterande 1D data representerar mängden spritt ljus (i jag(q)) på Y-axeln och scattering vinkel (q= 4πsinθ/λ, där λ är våglängden av incident X-strålar) och beskrivs i figur 1. Programmet PRIMUS/qt12 används för att direkt subtrahera någon bakgrund på grund av buffert och beskrivs i avsnitt 1.1. Andra program såsom; ScÅtter43 (nedladdning finns på www.bioisis.net) med en tutorial finns på https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeA, och bioXtas rå44 (tillgänglig på https:// bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html) kan användas som ett alternativ till ATSAS paketet.
Guinier analysen ger information om provet aggregering och homogenitet samt föreskriver makromolekyl av intresse utifrån SAXS data från låg s region14den radie av Gyration (Rg). En tomt är konstruerad med PRIMUS/qt för SAXS data som erhållits från varje koncentration, följt av kurva montering med den maximala räckvidden upp till 1,30 för q x Rg. En monodispersed provberedning bör ger en linjär Guinier tomt i denna region (figur 2D), medan aggregering resultat i en ickelinjär Guinier tomt15,16. Om Guinier analysen är linjär, kan graden av ”unfoldedness” av en makromolekyl sevärdheter observeras med Kratky tomten, vilket är användbart vid beslut om huruvida att utföra stel kropp modellering eller konstruera ensembler av lågupplösta modeller. Ett globulärt protein kommer att visas i en Kratky komplott för att ha en klockformad kurva, medan extended molekyler eller Övik peptider verkar platå eller även öka i större q intervallet och saknar bell-form (figur 2 c).
Bara att få den Rg från Guinier analys anser datapunkter från regionen låg q av 1 D spridningsdiagrammet (figur 2D), det är dock möjligt att använda nästan hela datamängden för att genomföra en indirekt Fourier-transformation att konvertera den ömsesidiga-space informationen av ln (I (q)) vs. (q) i en fördelningsfunktionen för verkliga rymden-avstånd (P(r)) som ger information på Dmax och Rg (Figur 2B) Form av P(r) tomten representerar brutto lösning konformation av makromolekyl intresse18,19. omvandlingen av ömsesidiga-space data till real-space data är ett kritiskt steg men en detaljerad beskrivning är inte inom ramen för denna uppsats. Därför hänvisa till en artikel av Svergun20 att förstå varje parameter.
När bufferten subtraheras data på enskilda koncentrationer som bearbetas genom Guinier analys med ett konsekvent värde för Rg, följt av undersöka sina fällbara mönster med Kratky analys, dessa data kan slås samman. Kopplade data presenteras för nidogen-1, laminin γ-1 och deras komplexa bearbetades enligt ovan och den resulterande P(r) tomter i figur 2B. Helst bör man också beräkna den par-avstånd fördelningsfunktionen P(r) för varje koncentration att avgöra om SAXS data samlas in för varje koncentration ger liknande Rg och Dmax värden. Om de Rg och Dmax förblir liknande över ett brett spektrum av koncentrationer, då användaren bör gå vidare. Det bör noteras att data beroende på signalen, kan trunkeras innan data samgående. Detta är ofta fallet om de koncentrationer och/eller molekylvikt av makromolekyler under utredning är låg.
Lågupplöst form analys med DAMMIN kan utföras i olika lägen (t.ex. snabb, långsam, Expert lägen, etc.). Snabb läge är en perfekt första steg att utvärdera om P(r) tomten ger bra kvalitet modeller. Normalt bör minst 10 modeller erhållas för varje P(r) komplott för att kontrollera om reproducerbara resultat, när det gäller den lågupplösta strukturen, erhålls, med en låg godhet fit parameter kallas χ (ett värde på 0,5-1,0 anses bra baserat på vårt omfattande arbete ), ett värde som beskriver ett avtal mellan experimentellt insamlade SAXS data och modell-härledda data. I publikationen syfte vi vanligtvis använda långsam eller Expert läge och beräkna minst 15 modeller. Utöver DAMMIN, en snabbare version av det, DAMMIF37, samt GASBOR38 finns också alternativ. Dessutom, för att studera protein-protein eller protein-nucleic acid komplex, är det möjligt att använda MONSA program35, vilket underlättar samtidig montering av enskilda SAXS data för makromolekyler såväl som deras komplex. För mer information om högupplösta modellberäkningar samt för RNA-protein interaktionsstudier, se en artikel nyligen av Patel et al3.
SAXS är teoretiskt enkel men utan tvekan en mycket kompletterande metod till andra strukturbiologi verktyg och resultat i lågupplöst strukturella uppgifter som kan användas på egen hand eller tillsammans med högupplösta tekniker för att belysa information om makromolekylära struktur och dynamik. Så länge en monodispersed beredning av makromolekyler och deras komplex kan erhållas, kan SAXS utnyttjas för att studera i-lösning struktur och interaktioner av någon typ av biologiska makromolekyl. När det gäller de komplexa som diskuteras här, det är anmärkningsvärt att mindre än 10% av den totala tillgängliga ytan kväve-1 och laminin γ-1 är begravd i detta komplex, medan resten av domänerna av både proteiner är fritt tillgängliga att interagera med andra proteiner på den extracellulära matrixen att upprätthålla dess strukturella stelhet (figur 3). Att få sådan information för en komplex med ~ 240kDa skulle vara mycket utmanande med andra strukturbiologi tekniker såsom röntgenkristallografi, NMR och Cryo-EM mikroskopi.
Avtäckning proteinstruktur via röntgenkristallografi eller NMR är en inneboende tidskrävande process. Denna flaskhals i strukturbestämning är ett område där SAXS visar sin styrka som en strukturell teknik; datainsamling för en enda SAXS experiment kan ta mindre än en timme och med hjälp av strömlinjeformad analysprogram, analys kan ske snabbt och effektivt. SAXS har potential att kraftigt öka genomströmningen av strukturella studier som en fristående teknik eftersom det ger en lågupplöst modell av makromolekylära struktur innan högupplösta data är tillgängliga. Ett hinder för andra strukturella tekniker är kravet för en mycket ren, koncentrerad prov för datainsamling, vilket kräver en hög nivå av proteinuttryck och stabilitet över en lång tidsperiod. Medan SAXS prover också måste vara ren och koncentrerad, provmängder är ungefär 100 µL att göra SAXS en relativt billig analysmetod som jämfört med andra strukturella tekniker. Dessutom blir SAXS tillsammans med storlek utslagning kromatografi allt vanligare som ger en ytterligare kvalitetskontroll steg. Nyligen har det varit stark framsteg i kombinationen av NMR och SAXS data med hjälp av den Ensemble optimering metod (EOM)45,46 för att belysa flexibla system. I en nyligen papper av Mertens och Svergun47beskriver författarna flera aktuella exempel på EOM SAXS i kombination med NMR, tillsammans med många andra exempel på SAXS data som används i samband med NMR. Framsteg görs kontinuerligt inom SAXS, och nya tekniker håller på att utvecklas för SAXS att användas tillsammans med, inte bara gratis till, andra strukturella tekniker. Följaktligen tror vi att efterfrågan på SAXS endast kommer att öka med tiden, särskilt i samband med NMR att karakterisera dynamiska system där funktioner definieras av flexibilitet.
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt har fått stöd av NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta Innovation Program (RCP-12-002 C) och Alberta Prion Research Institute / Alberta utvecklar Bio lösningar (201600018) bidrag till M.O. TRP är en Kanada forskning stol i RNA & Protein biofysik (201704) och erkänner NSERC Discovery grant (RGPIN-2017-04003). TM är finansierad av NSERC Discovery bidraget till TRP.
HEK 293 EBNA Cell Line | In-Lab availability | – | Cell line used to overexpress protein(s) |
Ni Sepharose High Performance histidine-tagged protein purification resin | GE Healthcare | 17524801 | Affinity protein purification resin |
Superdex 200 Increase 10/300 | GE Healthcare | 28990944 | SEC Column |
ÄKTA Pure FPLC | GE Healthcare | – | FPLC System |
Nanodrop | Nanodrop | – | Spectrophotometer |
Basic Reagents (NaCl, Tris-HCl etc.) | |||
S-MAX3000 | Rigaku | – | SAXS Pinhole Camera System |
Zetasizer Nano-S | Malvern Instruments Ltd | – | Dynamic Light Scattering instrument |
0.1µm Filter | Millipore | JVWP04700 | Used to Concentrate Sample Prior to DLS |
Thrombin cleavage kit | abcam | ab207000 | Thrombin cleavage to remove His tag |
Strep-Tactin Sepharose Column | IBA | 2-1201-010 | Strep-Tag Affinity Purification |
D-desthiobiotin | Sigma-Aldrich | 533-48-2 | Elution of Strep Tag Protein |
Software | |||
SAXGUI | Rigaku | – | Data Collection for SAXS and data reduction |
ATSAS Suit | Franke et al., 2017 | – | SAXS Data Analysis Software program suite |
PRIMUS | Konarev et al., 2003 | – | Buffer Subtraction |
GNOM | Svergun, 1992 | – | Rg, Dmax and p(r) Calculation |
DAMMIF | Franke and Svergun, 2009 | – | Ab initio model calculation |
DAMAVER | Volkov and Svergun, 2003 | – | Averaged Solution Conformation calculations |
MONSA | Svergun, 1999 | – | Simultaneous model fitting for the complex |
GASBOR | Svergun et al., 2001 | – | Alternative Ab initio model calculations |
DTS Software V6.20 | Malvern Instruments Ltd | – | DLS supplied instrument software |
PyMOL | Schrodinger, LLC. | – | The PyMOL Molecular Graphics System V2.0 |
The Protein Data Bank | Berman et al., 2000 | – | PDB ID: 1NPE |