Summary

Estrazione della lignina con alto contenuto di β-O-4 da etanolo lieve estrazione ed il relativo effetto sul rendimento depolimerizzazione

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire l’estrazione di etanolo di lignina da diverse fonti di biomassa. L’effetto delle condizioni di estrazione sul rendimento di lignina e contenuto di β-O-4 sono presentati. Depolimerizzazione selettiva viene eseguita sulle lignine ottenute per ottenere prodotti di alta monomero aromatico.

Abstract

Strategie di valorizzazione di lignina sono un fattore chiave per il raggiungimento di bioraffinerie più economicamente competitive basate sulla biomassa lignocellulosica. La maggior parte delle procedure emergenti elegante per ottenere prodotti aromatici specifici si basano sul substrato di lignina avendo un alto contenuto del sollevatore di β-O-4 facilmente liberabili come presenti nella struttura nativa lignina. Questo fornisce un miss-match con le lignine tecniche tipiche che sono altamente degradate e quindi sono a basso contenuto di β-O-4 collegamenti. Di conseguenza, le rese di estrazione e la qualità della lignina ottenuta sono della massima importanza per accedere a nuovi percorsi di valorizzazione di lignina. In questo manoscritto, un semplice protocollo è presentato per ottenere le lignine con alto contenuto di β-O-4 mediante estrazione con etanolo relativamente mite che possa essere applicati alle fonti differenti ligno-cellulosica. Inoltre, le procedure di analisi per determinare la qualità delle lignine sono presentate insieme ad un protocollo di depolimerizzazione che produce specifiche fenolici 2-arylmethyl-1,3-dioxolanes, che può essere utilizzato per valutare le lignine ottenute. I risultati presentati dimostrano il legame tra qualità di lignina e potenziale per le lignine essere depolimerizzato in specifiche sostanze chimiche aromatiche monomerici. Nel complesso, l’estrazione e la depolimerizzazione dimostra un trade-off tra la resa di estrazione della lignina e la conservazione della struttura nativa aril-etere e così il potenziale della lignina per essere utilizzato come substrato per la produzione di prodotti chimici per applicazioni di valore superiore.

Introduction

Per l’industria chimica a diventare sostenibile, materie prime rinnovabili come la biomassa lignocellulosica dovrebbero essere utilizzati come alternativa alla corrente dominante fossili quelli1. Tuttavia, per rendere economicamente conveniente l’uso di tali materie prime, le applicazioni ad alto valore dovrebbero essere cercate per tutto il suo contenuto. Coltura da biomassa lignocellulosica può contenere circa 30% in peso della lignina che è un biopolimero aromatico per cui attualmente soltanto alcune applicazioni sono state sviluppate oltre all’utilizzo come combustibile di basso-valore2. Pertanto, la metodologia verso componenti aromatiche potenzialmente aumentato-valore è di maggiore interesse per garantire il successo delle bioraffinerie futuri.

La ricerca recente ha fortemente incentrato sullo sviluppo di nuove metodologie per il taglio selettivo del sollevatore più abbondante di β-O-4 (Figura 1a) in lignina ottenere specifici monomeri aromatico, tipicamente fenolici,3,4 ,5,6. Ad esempio, l’applicazione di acidi tra 80 ° C a 180 ° C è molto efficace nel fendendo il sollevatore di β-O-4 formando aldeide e chetone frammenti7,8. I nostri gruppi e altri hanno recentemente dimostrato che acidolysis combinato con le metodologie per stabilizzare e frammenti reattivi trappola è estremamente potente per ottenere monomeri fenolici con specifici motivi chimici9,10 , 11 , 12. di questi, in particolare dell’intrappolamento dell’acetale di aldeidi reattive con alcoli per ottenere fenolici 2-arylmethyl-1,3-dioxolanes (acetali) dimostrato potente a causa della sua relativa applicazione semplice e la conservazione della natura altamente funzionalizzata della lignina monomeri (Figura 1b)13,14. Questi acetali sono ottenuti dalla depolimerizzazione in un rapporto che riguarda la distribuzione della H, G e S monomeri presentano nel feedstock di lignina del padre.

Acido catalizzata depolimerizzazione, come molte delle metodologie più eleganti sviluppato, sono relativamente lievi e non unirà più forti legami C-C che si verificano in lignina15. Tuttavia, legami C-C diventano particolarmente abbondante quando vengono applicate condizioni di frazionamento lignocellulosa duro a causa della condensazione del vapore reattive frammenti rilasciati dal clivaggio di16,più deboli legami di C-O17. La perdita di contenuto di β-O-4 dalla biomassa metodo di lavorazione è chiaramente dimostrata da analisi di una gamma di tecniche lignine, che ci ha mostrate solo conservare fino a 6 β-O-4 collegamenti per 100 unità aromatiche18, mentre in ligno-cellulosica questi numeri vanno da 45 a 90 collegamenti per 100 unità aromatiche a seconda della fonte16. Passando alle condizioni di estrazione più miti, lignine sono ottenibili con le distribuzioni di sollevatore che meglio riflettono la naturale della lignina. Tuttavia, ciò richiede un compromesso tra l’efficienza di estrazione e la qualità del materiale ottenuto lignina17. Anche questo ha la precedenza in organosolv estrazione della lignina, che è un metodo popolare per frazionare la lignina. Molte varianti di questo esistere di processo, con i metodi che impiegano diverse temperature, contenuto acido, tempi di estrazione e solventi. Qui, la severità di estrazione ha un impatto diretto sulla struttura della lignina ottenuti e quindi la sua idoneità per ulteriore valorizzazione19,20,21. Ad esempio, organosolv lignina prodotta dal processo di Alcell base di etanolo, operato per 5 anni a scala di dimostrazione, era relativamente bassa quantità di legami β-O-4 lasciato come e ‘ stato operato a relativamente alta temperatura per garantire delignification efficiente in al fine di ottenere i carboidrati di alta qualità per la produzione di bioetanolo. Tuttavia, biobased solventi con scarso impatto ambientale come l’etanolo sono comodo e così i metodi di estrazione che si traducono in lignine di valore superiore sono di interesse. Solventi alcolici sono di particolare interesse come oltre ad essere il mezzo di estrazione che essi incorporano anche nella struttura della lignina, ad esempio, β’ – O – 4 (Figura 1a)22, che in parte “protegge” la struttura da indesiderati fenditura. Un metodo adatto potenzialmente sarebbe in primo luogo ottenere lignina con un alto contenuto di β-O-4 e in un passaggio sequenza per rimuovere il resto della lignina per accedere cellulosa di alto valore.

In questo manoscritto, descriviamo una procedura altamente riproducibile e dritto in avanti per l’estrazione della lignina β-O-4 alta mediante estrazione con etanolo mite. A seconda della fonte di biomassa, questo può portare a efficienza di estrazione relativamente alto e rendimento. Sono disponibili procedure per la caratterizzazione della lignina ottenuta nonché come “deprotect” l’eterificato β’ – O – 420. Inoltre, una procedura di valutazione è presentata per il potenziale di questi lignine nelle procedure di depolimerizzazione selettiva che si basano sulla fenditura selettiva dei legami β-O-4. Questa valutazione viene eseguita utilizzando la depolimerizzazione catalizzata triflato di ferro (III) in presenza di glicole etilenico per ottenere fenolici 2-arylmethyl-1,3-dioxolanes23 che dimostra il legame tra β-O-4 contenuto nel materiale di lignina e il monomero produce21. I risultati mostrano l’equilibrio tra efficienza di estrazione alta lignina e il potenziale della lignina ottenuto per essere depolimerizzata ai monomeri aromatici specifici.

Protocol

1. pretrattamento delle materie prime in noce prima dell’estrazione di lignina Produzione di gusci di noce di taglio Nutrire i gusci di noce a una fresa di martello alla frattura i gusci. Dotare la taglierina di martello con un setaccio 5 mm all’uscita. Raccogliere i gusci di noce fratturato in un becher di vetro 1L. Nutrire le conchiglie fratturate a una fresa di martello micro per ottenere gusci. Dotare la taglierina micro martello con un setaccio di 2 mm all’uscita. Raccogliere i gusci di noce in un becher di vetro 1L. Estrazione degli acidi grassi da gusci di noce Mettere 150 g dei gusci di noce tagliato in un pallone da 500 mL. Aggiungere 200 mL di toluene e una barra di agitazione per il pallone. Collegare il pallone un refrigerante a ricadere. Calore la miscela a temperatura di riflusso (111 ˚ c) con un bagno di olio per 2 h con vigorosa agitazione. Interrompere il riscaldamento dopo 2 h e lasciate raffreddare a temperatura ambiente rimuovendolo dal bagno d’olio. Rimuovere il toluene per filtrazione (diametro 185 mm, diametro dei pori 10 µm). Scartare il filtrato di toluene. Rimuovere il toluene residui riscaldando i gusci di noce durante la notte in un forno sottovuoto a 80 ˚ c e 50 mbar. Fresatura di gusci di noce pre-estratti Posto 7 ZrO2 rettifica sfere con un diametro di 20 mm in un 250ml ciotola di macinazione è costituito da ZrO2. Riempire la ciotola con 40 g di particelle di noce. Aggiungere 60 mL di isopropanolo nella ciotola di macinazione. La smerigliatura di gusci di noce con un laminatoio di sfera rotante. Macinare in 4 cicli di 2 min rettifica a 27 x g, seguita da una pausa di 4 min. Mantenere la temperatura della vasca sotto 80 ˚ c in qualsiasi momento. Eseguire non più di 3 lotti e lasciare raffreddare la ciotola verso il basso in seguito. Raccogliere il macinato finemente gusci di noce in un pallone da 500 mL. Rimuovere l’isopropanolo evaporazione rotativa a 40 ˚ c e 125 mbar. Secca i gusci di noce durante la notte in un forno sottovuoto a 50 ˚ c e 50 mbar. Passare al setaccio il macinato finemente gusci di noce attraverso un setaccio di 1 mm. Terra le particelle che sono troppo grandi, nuovamente con il laminatoio di sfera rotante. 2. preparazione delle materie prime legno Taglio delle plance di legno Posizionare le assi di legno sotto un trapano, che è dotato di una punta piatta legno velocità. Raccogliere i trucioli di legno in un bicchiere di vetro. Posizionare i trucioli di legno in un macinino da caffè di tagliarli in pezzi più piccoli. Estrazione degli acidi grassi dal legno Eseguire l’estrazione degli acidi grassi dal legno proprio allo stesso modo come descritto per gusci di noce nel punto 1.2.Nota: Nessun fresatura del legno è eseguita nel laminatoio di sfera, come le condizioni descritte al passaggio 1.3 non hanno provocato una riduzione delle dimensioni delle particelle. 3. estrazione di alta β-O-4 Ethanosolv lignina Estrazione dell’etanolo lieve (metodo A) Mettere 25 g di materia prima in un pallone da 500 mL. Aggiungere una miscela di etanolo/acqua 80: 20 (200 mL), 4 mL di soluzione di HCl 37% (0,24 M) e una barra magnetica di agitazione per il pallone. Collegare il pallone un refrigerante a ricadere. Calore alla temperatura di atreflux miscela con bagno d’olio per 5 h con vigorosa agitazione. Lasciar raffreddare a temperatura ambiente rimuovendolo dal bagno d’olio. Filtrare la miscela (diametro 185 mm, diametro dei pori 10 µm) e lavare il residuo con 4 volte 25 mL di etanolo. Il work-up e l’isolamento della lignina Raccogliere il liquore in un pallone da 500 mL. Concentrare il liquore mediante evaporazione rotativa a 40 ˚ c e 150 mbar. Sciogliere il solido ottenuto in 30 mL di acetone. Se il solido non si scioglie completamente, utilizzare un bagno ad ultrasuoni. Precipitare la lignina aggiungendo la miscela a 600 mL di acqua. In caso di nessuna precipitazione, aggiungere una piccola quantità di saturi acquosa Na2così4 soluzione a flocculare la lignina. Raccogliere la lignina per filtrazione (diametro 185 mm, diametro dei pori 10 µm). Lavare la lignina con 25 mL di acqua 4 volte. Scartare il filtrato se nessuna analisi della frazione di emicellulosa è necessaria. Se il filtrato è molto torbido, aggiungerlo a un tubo di centrifugazione e raccogliere la frazione di fondo (solido) mediante centrifugazione. La lignina all’aria lasciare asciugare durante la notte. Asciugare la lignina ulteriormente in un forno sottovuoto (durante la notte a 50 ˚ c e 50 mbar). Determinare il rendimento dopo la lignina è asciugata durante la notte in un forno sottovuoto. Determinare l’efficienza di estrazione di lignina dividendo con il contenuto di lignina totale come determinato dal metodo Klason24. Estrazione di più alta temperatura dell’etanolo (metodo B) Mettere 15 g di materia prima in un’autoclave di 250 mL. Aggiungere una miscela di etanolo/acqua 80: 20 (120 mL), 2,4 mL di HCl (0,24 M) e una barra di agitazione magnetica. Calore la miscela a 120 ˚ c per 5 h con una velocità dell’agitatore di 5,2 x g. raffreddare la miscela in seguito in un bagno di ghiaccio. Filtrare la miscela (diametro 185 mm, diametro dei pori 10 µm) e lavare il residuo 4 volte con 15 mL di etanolo. Eseguire esattamente come descritto nel passo 3.2 ulteriore work-up e l’isolamento. Estrazione dell’etanolo più grande scala più alta temperatura di guscio di noce (metodo C *) Mettere 90 g delle coperture della terra in noce finemente in autoclave ad alta pressione a 1 L. Aggiungere una miscela di etanolo/acqua 80: 20 (750 mL) e 6,25 mL di H2SO4 (0,12 M). Calore la miscela a 120 ˚ c per 5 h con una velocità dell’agitatore di 35,8 x g. raffreddare la miscela a temperatura ambiente attivando i reattori, sistema di raffreddamento dopo il tempo di reazione di 5h. Filtrare la miscela (diametro 185 mm, diametro dei pori 10 µm) e lavare il residuo 4 volte con 75 mL di etanolo.Nota: Utilizzando più filtri consente di risparmiare un sacco di tempo. Raccogliere i liquori in 2 lotti uguali. Eseguire il work-up e isolamento come descritto come in passo 3.2 con pari al doppio dei solventi per entrambi i batch. Esperimenti di controllo di passo 3.1. (Metodo A *) e fase 3.3. (Metodo B *) (opzionale) Mettere l’esatto alcuni materiali come descritto al punto 3.1.1 ma sostituire la soluzione di HCl con 1,67 mL di H2SO4 (0.12M). Il resto del passaggio 3.1-3.2 è identico al Metodo A. Mettere l’esatto alcuni materiali come descritto al punto 3.3.1 ma sostituire la soluzione di HCl con 1,0 mL di H2SO4 (0.12M). Il resto del passo 3.3 è identico al Metodo B. 4. de-eterificazione della lignina (opzionale) Sciogliere 1000 mg di lignina in un 24 mL di miscela di 1,4-diossano/acqua di 1:1 in un pallone da 100 mL. Aggiungere 1 mL di una soluzione di HCl 37% alla miscela. Aggiungere una barra di agitazione e collegare un condensatore a riflusso per il pallone. Calore alla miscela di 100 ˚ c con un bagno di olio per 5 h con vigorosa agitazione. Lasciar raffreddare a temperatura ambiente rimuovendolo dal bagno d’olio. Aggiungere la miscela a 160 mL di acqua per far precipitare la lignina. Raccogliere la lignina per filtrazione (diametro 185 mm, diametro dei pori 10 µm) e lavare la lignina con 25 mL di acqua 2 volte. La lignina all’aria lasciare asciugare durante la notte. Asciugare la lignina ulteriormente in un forno sottovuoto (durante la notte a 50 ˚ c e 50 mbar). 5. analisi della lignina Analisi a risonanza magnetica nucleare di bidimensionale (2D-NMR) Sciogliere 60 mg di lignina secco in 0,7 mL di d6-acetone. Aggiungere poche gocce di D2O se la lignina non si scioglie completamente. Mettere il composto in un tubo di NMR e prendere un protone 2D spettri di eteronucleari singolo quantum coerenza (HSQC) con uno spettrometro NMR con i seguenti parametri: (11, -1), (160, -10), nt = 4, ni = 51220. Analizzare gli spettri HSQC ottenuti. Regolare gli spettri di correzioni di fase manuale su entrambi gli assi fino a quando tutti i segnali sono positivi, come questo è soprattutto importante lungo l’asse orizzontale (f2). Non eseguire nessuna correzione della linea di base. Le posizioni di tutti i collegamenti vengono fornite al punto 5.1.3 e 5.1.6. Integrare i segnali della regione aromatico che corrispondono alle tre diverse unità aromatiche (protone numerazione secondo la Figura 4). Questi segnali sono in [(Proton range) la regione (gamma carbonio)]:S2/6: [(6.48-6.90)(104-109)]S’2/6: [(7.17-7.50)(105-109)]Scondensato: [(6.35-6.65)(106-109)]G2: [(6.78-7.14)(111.5-116)]G5: [(6.48-7.06)(115-120.5)]G6: [(6.65-6.96)(120.5-124.5)]H2/6: [(7.05-7.29)(128.5-133)]Nota: H3/5 si sovrappone con il segnale di5 G, e si presume che H2/6 ha la stessa intensità H3/5. Il segnale per condensato G si sovrappone con G5. Se nessuna (o scarsa) G2 e G6 segnali sono presenti, questo indica che si è verificato piena condensazione di G. Calcolare la quantità di unità aromatiche con la formula:Aromatico totale = (((S2/6 + S’2/6) / 2) + Scondensata) + ((G2 + G5 + G6- H2/6) / 3) + (H2/6 / 2) Calcolare la percentuale di unità G, H e S con le seguenti formule:Rapporto S = (((S2/6 + S’2/6) / 2) + Scondensed): totale aromatico x 100%Rapporto G = ((G2+ G5+ G6- H2/6) / 3): totale aromatico x 100%Rapporto H = (H2/6 / 2): totale aromatico x 100% Integrare i segnali nei segnali alifatici regione che corrispondono alla β-O-4, legami β-β e β-5 e chetoni Hibbert. Queste sono in [(proton range) la regione (gamma carbonio)]:Β-O-4α [(4.76-5.10)(73-77.5)]Β ‘ – O – 4α [(4.44-4.84)(81.5-86)]4-O-ββ e β’ – O – 4β [(4.03-4.48)(85-90.5)]4-O-βγ e β’ – O – 4γ [(3.10-4.00)(58.5-62)]Β-5α [(5.42-5.63)(88-92)]Β-5β [(3.36-3.56)(53-54.5)]Β-5γ [(3.50-4.00)(62-64.5)]Β-βα [(4.59-4.77)(86.5-89.5)]Β-ββ [(2.98-3.20)(55.5-59)]Β-βγ [(3.75-3.96)(72.5-76)] e [(4.10-4.31)(72.5-76)]HKγ [(4.20-4.30)(66-68)]Nota: I β-protoni del β-O-4 e β’ si sovrappongono – O – 4 collegamenti. I motivi strutturali di questi collegamenti sono riportati nella Figura 1. Il numero totale di collegamenti per ogni 100 unità di C9 è tutti basato sul segnale del protone α dei legami. Calcolare il numero totale di collegamenti con le seguenti formule:Β-O-4 collegamenti = (β-O-4α + β’ – O – 4α) / totale aromatico x 100Legami β-5 # = β-5α / totale aromatico x 100Collegamenti di β-β = β-βα / totale aromatico x 100 Analisi del gel permeazione Cromatografia (GPC) Sciogliere 10 mg di lignina secco in 1 mL di tetraidrofurano (THF) (con una goccia di toluene come standard interno). Filtrare la miscela attraverso un filtro da 0,45 µm a siringa in una fiala di autocampionatore con un ingresso di volume ridotto di 0,3 mL. Chiudere la fiala di autocampionatore con un tappo. Iniettare 20 µ l del campione in un THF GPC. Elaborare i dati ottenuti. Correggere il segnale ottenuto per il segnale di riferimento (toluene). Selezionare il volume di eluizione per l’intervallo corretto (~ 200-10000 Da). Il software per calcolare la distribuzione di massa. 6. depolimerizzazione di lignine a fenolici 2-Arylmethyl-1,3-Dioxolanes (acetali) Mettere 50 mg di lignina secco in un flaconcino di forno a microonde da 20 mL come il recipiente di reazione con un agitatore magnetico. Aggiungere 0,85 mL di 1,4-diossano, 50 µ l di glicole etilenico in 1,4-diossano (0,54 mL/mL) e 50 µ l di ha (standard interno) a 1,4-diossano (26 mg/mL). Chiudere il recipiente di reazione e riscaldare la soluzione a 140 ° C mescolando a 3,8 x g. Quando il recipiente di reazione raggiunge i 140 ° C, aggiungere 50 µ l di Fe (III) OTf3 a 1,4-diossano (0,1 g/mL). Mescolare il reattore per 15 min. Raffreddare il reattore a temperatura ambiente e rimuovere il liquido di depolimerizzazione come descritto al punto 7.1. 7. lavoro up e analisi di miscele di depolimerizzazione Filtrare il liquido sopra Celite (permeabilità: 2,60-6-50 darcy; dimensione delle particelle: 150 mesh Tyler; setaccio conservare (140 M U.S.): 2.0-25.0%) e raccogliere in una provetta da centrifuga da 2 mL. Concentrare il liquida durante la notte a 35 ° C in un concentratore a vuoto rotazionale. Estrarre il petrolio/solido finale con la seguente procedura: Sospeso e si gonfiano il residuo in 0,15 mL di diclorometano (DCM) mescolando vasto (Vortex), 15 min di sonicazione e 30 min in automatico ruota. Centrifugare i campioni per 10 s utilizzando una centrifuga da tavolo minispin per garantire che il liquido sia nella parte inferiore del tubo (velocità di centrifugazione: 671 x g). Aggiungere 0,75 mL di toluene e mix estesamente (mediante sonicazione vortice e 10 min). Centrifugare i campioni per 10 s utilizzando una centrifuga da tavolo minispin (velocità di centrifugazione: 671 x g) per garantire che il liquido sia nella parte inferiore del tubo. Separare il liquido organico luce dal residuo oleoso solido o spesso e filtrare questo liquido sopra una spina di Celite e raccogliere in un flaconcino di vetro.Nota: Questa procedura per sospensione/lavaggio viene ripetuta tre volte, e nell’ultima estrazione, 0,5 mL di toluene viene utilizzato. Concentrare le fasi organiche combinate mediante evaporazione rotativa (40 ˚ c, 20 mbar). Sciogliere il residuo oleoso in 1 mL di DCM per analisi di gas cromatografia fiamma ionizzazione rivelatore (GC-FID). Eseguire GC-FID utilizzando un GC equipaggiati con un FID rivelatore e uso elio come gas di trasporto. Impostazioni standard: 1 µ l iniezione, una razione di Spalato di 50: 1, un flusso di elio di 0,95 mL/min Equip GC apparato con una colonna HP5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) e gestito con un profilo di temperatura che inizia con un’isoterma di 60 ° C 5 min. Follow-up di una rampa di 10 ° C/min per 20 minuti a 260 ° C. Mantenere questa temperatura per 20 min. Integrare i picchi negli spettri manualmente. I tempi di ritenzione dei picchi sono come segue: ha (21,4 min), H-acetale (19,5 min), G-acetale (20,8 min), S-acetale (23,4 min). Utilizzare i valori ottenuti nel passaggio 7,8 per eseguire la quantificazione. Eseguire la quantificazione dell’acetale di G, che si basa su una curva di calibrazione con un standard composto isolato utilizzando uno standard interno (ha).Nota: Curva di taratura: (R2= 0,9991)Rendimento G-acetale:Basato su precedenti risultati9,21,23 che un fattore di risposta è stato stimato per acetalica H e S come 2.19 e 1.82, rispettivamente.

Representative Results

In Figura 2, la materia prima ottenuta dopo pretrattamento sono mostrati (colonna sinistra). Tutte le materie prime è stata ottenuta come piccoli chip presente oltre al legno di faggio, che è stata acquisita come trucioli di granulometria adatta per l’estrazione. Le lignine ottenuti dopo lo spettacolo di estrazione una vasta gamma di colori e dimensioni delle particelle. Le lignine ottenute dai trattamenti lieve (metodo A e la seconda colonna Figura 2) sono in genere acquisite come piccoli fiocchi e di colore rosso/rosa. Quando le condizioni più severe sono applicate (metodi B e C *), le lignine ottenute hanno un colore marrone/giallo brunastro (terza e quarta colonna Figura 2). Il rendimento è aumentato per tutte le estrazioni effettuate in condizioni più severe (metodi B e C*) rispetto a condizioni più miti (schema di reazione in Figura 1, risultati in tabella 1). Questo effetto è stato molto più profondo per noce (10,2% di aumento), faggio (aumento dell’8,5%) e legno di cedro (aumento del 5,1%) rispetto al legno di pino (solo aumento dello 0,5%). Base al contenuto di lignina della biomassa prima dell’estrazione (40,3% per noce, 28,6% per Pino25, 18,8% per faggio25 e 35,1% per cedar25), l’efficienza di estrazione di lignina in legno di faggio è particolarmente elevata (pari al 73,9%), mentre per il altre fonti più bassa efficienza di estrazione è stata ottenuta. Metodi A * e B *, esperimenti di controllo con acido solforico per i metodi A e B, ha mostrato che alcune chiare differenze nella resa di estrazione. Estrazione delicata di gusci di noce con acido solforico (metodo A *) ha dato solo un rendimento molto basso del 2,6%, che è nettamente inferiore rispetto all’estrazione con acido cloridrico (metodo A) (2,6% e 5,0%). Tuttavia, con le più severe condizioni di estrazione, l’estrazione con acido solforico (metodo B *) Mostra un rendimento più elevato rispetto all’acido cloridrico (metodo B) (19,3% e 15,2%), ma dovrebbe essere notato che sono presenti nel prodotto ottenuto mediante estrazione tracce di zucchero con acido solforico. Dall’analisi NMR delle lignine differenti (esempio mostrato nella Figura 4), sono stati determinati il rapporto H/G/S e la quantità di collegamenti (tabella 1). A causa della sovrapposizione del β e γ-protoni di β-O-4 e il β’ – O – 4 sollevatore, la quantità di collegamenti è quantificato utilizzando il α-protoni. Inoltre, il G5/6 e sovrapposizione di segnali di H3/5 , ma questi può essere corretto regolando i rapporti di conseguenza usando i segnali da2/6 H. Inoltre, un segnale corrispondente al γ-protoni i chetoni Hibbert e un segnale per apparecchi di S ossidati, che probabilmente sono causati da gruppi terminali di lignina, sono identificati. I rapporti ottenuti da NMR indicano che in generale le estrazioni con metodo B fornisce la lignina con maggiore contenuto di S rispetto a quelli con il metodo A nel caso che il materiale nativo contiene unità di S. Inoltre, le estrazioni con metodo B forniscono lignina con una quantità inferiore di collegamenti di β-O-4 totale rispetto al metodo A, indicando aumentata degradazione all’aumento della temperatura. Un’eccezione è la lignina noce ottenuta da metodi metodi A e B per il quale l’importo del totale legami β-O-4 era molto simile. Il numero dei legami β-β e β-5 diminuire quando vengono applicate condizioni più severe, anche se in misura minore. Inoltre, NMR ha rivelato che tutte le lignine ottenuto dopo l’estrazione dell’etanolo hanno mostrato un grado di modificazione strutturale del legame β-O-4. Questi hanno almeno ~ 50% sostituzione presso il gruppo α-OH, conseguente il β α-etossilati ‘ – O – 4 sollevatore. L’estrazione di lignina Mostra alta riproducibilità, che è stata dimostrata effettuando l’estrazione delicata di gusci di noce (metodo A) 4 volte. In particolare, la deviazione del numero totale di legami β-O-4 è incredibilmente piccola. Quando l’estrazione è stata eseguita in condizioni più severe (metodi B e C *), la percentuale di α-etossilazione aumentato. Il HSQC spettri della lignina faggio Estratto alle condizioni più severe (metodo B), un segnale per S condensato è visibile, che si sposa perfettamente con la significativa diminuzione della quantità di legami β-O-4. L’estrazione di noce eseguito su larga scala (metodo C *) spettacoli una diminuzione significativa per tutti i collegamenti e un segnale per S condensato è visibile negli spettri HSQC. Il rendimento relativamente elevato per l’estrazione del cedro a condizioni miti (metodo A) è causato dalla presenza di una notevole quantità di acido grasso. Esperimenti di controllo con l’acido solforico ha dato buona idea dell’effetto dell’acido sulla composizione della lignina ottenuta. Con condizioni di estrazione delicata (methodA *), un purissimo lignina è stata ottenuta che era simile in composizione rispetto ad altre estrazioni mite (methodA). La quantità leggermente inferiore di legami β-O-4 può essere attribuita a una meno efficiente incorporazione di etanolo il quadro di lignina, risultante in un numero inferiore di β’ – O – 4 collegamenti. Alle più severe condizioni di estrazione (metodo B *), le differenze con la lignina ottenuta è molto più profondo rispetto con la lignina ottenuta da gusci di noce estratte in presenza di acido cloridrico (metodo B). Il numero totale dei legami β-O-4 Mostra una forte diminuzione (35 e 74, rispettivamente) e la lignina ottenuta con acido solforico Mostra una quantità elevata di condensazione nella regione aromatica (48%), che è stata determinata mediante l’integrazione dei segnali corrispondenti il S condensato e Gcondensata (punto 5.1.3). Questa elevata quantità di condensa può essere completamente attribuita ad acido solforico, come il prodotto ottenuto dall’estrazione stessa con acido cloridrico non mostrato formazione di condensa nella regione aromatica. La composizione del prodotto ottenuto a estrazione a scala più grande duro (metodo C *) non mostra nessuna grande differenza con il prodotto ottenuto in una scala più piccola (metodo B *). L’unica grande differenza è la minor quantità di condensa nella regione aromatica nell’estrazione su larga scala (9%) e, successivamente, una maggiore quantità di legami β-O-4. Questa differenza potrebbe essere causata dalla differenza nel profilo di riscaldamento tra le autoclavi differenti. Le lignine sono stati inoltre analizzate da GPC (Figura 5) per fornire una conoscenza del peso molecolare (tabella 2). Questi rivelano che, quando vengono applicate più severe condizioni di estrazione (metodo B), sia il peso molecolare medio ponderale (Mw) e la polidispersità stanno aumentando per tutte le fonti. Il peso molecolare medio numerico, (Mn), tra le condizioni di estrazione sono paragonabili per ciascuna origine. Nel complesso, questi risultati mostrano che più severe condizioni di estrazione hanno un duplice effetto, e frammenti più grandi vengono estratti oltre a ulteriore ripartizione di tali frammenti. Per alcune applicazioni, la formazione di β’ – O – 4 sollevatore è indesiderato, ad esempio, quando l’applicazione di metodi di depolimerizzazione che si basano sull’ossidazione delle benzilica (α) dell’idrossile gruppo26,27,28. La trasformazione del β’ – O – 4 sollevatore della lignina ethanosolv a regolari collegamenti di β-O-4 era precedentemente segnalati20 ed è stato effettuato con un batch di lignina ottenuto da gusci di noce che è paragonabile alla lignina ottenuta da gusci di noce riportati in questo carta (Figura 6). La lignina è composta da 30 nativi β-O-4 collegamenti e 39 etossilato α β’ – O – 4 collegamenti (collegamenti 34 e 38, rispettivamente per la lignina in questa carta). De-eterificazione convertito quasi tutti i legami α-etossilati alla struttura nativa come la lignina ottenuta consisteva di 57 legami β-O-4 e solo 3 α-etossilati β’ – O – 4 collegamenti, mostrando una piccola perdita del numero totale di unità di β-O-4. La massa della lignina era 72% della lignina originale, che è principalmente causato dalla perdita del gruppo etilico. Per dimostrare il potenziale della lignina per la produzione di monomeri aromatici mediante depolimerizzazione mite, acidolysis Aall con Fe(OTf)3 in presenza di glicole etilenico sono stati eseguiti (Figura 7). Questa reazione produce tre diversi fenolici 2-arylmethyl-1,3-dioxolanes (acetali) che riguardano la H, unità G e S presenti in lignina. La tabella 3 Mostra la resa degli acetali S, G e H e i rendimenti totali sono mostrati in Figura 8. È visibile che il metodo di estrazione di lignina ha un effetto importante essendo il rendimento degli acetali. Rese più basse si ottengono per lignina estratta utilizzando condizioni più severe (metodo B). Ciò è probabilmente dovuto una più modificata (percentuale maggiore di α-etossilazione) condensato struttura come descritto nel paragrafo precedente. L’importanza delle unità β-O-4 emerge fornendo correlazioni a rendimento di monomero in depolimerizzazione, come presentato nel protocollo (Figura 9). Una chiara tendenza è visibile considerando il totale contenuto di β-O-4 e i legami β-O-4 non esterificato, dove un alto contenuto di β-O-4 provoca generalmente più alta resa di fenolici 2-arylmethyl-1,3-dioxolanes (acetali) che è in linea con i risultati precedenti21 . Quando si considera l’eterificato β’ – O – 4 collegamenti, la tendenza è anche chiara, mostrando che la resa di depolimerizzazione non è correlata al numero di β’ – O – 4 collegamenti. Condizioni di reazione, i legami β-O-4 eterificati possono essere de-eterificati ma questo ulteriore passaggio comporta la perdita di materiale, come descritto in precedenza. Nel complesso, correggendo la resa di depolimerizzazione di monomero per la resa di estrazione di lignina, i seguenti risultati possono essere ottenuti (tabella 4). Questi mostrano che confrontando metodi A e B, in genere una maggiore quantità di acetale può essere ottenuto mediante estrazione più severe fornire rendimenti più elevati di lignina complessiva seguiti da una depolimerizzazione (meno selettivo). Tuttavia, i risultati per Pineta mostrano anche che questo è dipenda la fonte di biomassa dal momento che l’aumento della severità di estrazione non fornisce un aumento significativo del rendimento. Conservazione della struttura β-O-4 è preferito per questo tipo di legno dare rendimenti più elevati nel complesso fenolico 2-phenylmethyl-1,3-diossolano (acetali). Figura 1 . Strutture chimiche dei prodotti ottenuti. (a) comuni motivi strutturali come presenti nella struttura di lignina. (b) acido catalizzata depolimerizzazione di lignina combinato con l’intrappolamento dell’acetale di ottenere fenolici 2-arylmethyl-1,3-dioxolanes (acetali). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2 . Ottenuta la lignina da diverse materie prime. Immagine di quattro materie prime differenti lignocellulosa dopo pretrattamento (passaggi 1 e 2) e le lignine ottenute dopo l’estrazione di organosolv alle diverse condizioni (metodo un-passo 3.1, metodo B-passo 3.3 e metodo C *-punto 3.4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3 . Schema di reazione per l’estrazione di ethanosolv. Panoramica dei legami ottenuti: β-O-4 (R’ = H), β’ – O – 4 (R’ = Et), β-β e β-5. Condizioni: (A) 80 ˚ c, 0,24 M HCl (punto 3.1), (B) 120 ˚ c, 0,24 M HCl (punto 3.3), (C *) 120 ˚ c, 0,12 M H2così4 (punto 3.4) e il controllo esperimento A * e B * (punto 3.5). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4 . Analisi HSQC della lignina. Identificazione di tutti i collegamenti di lignina misurata con 2D-HSQC della lignina ottenuto da gusci di noce con trattamento delicato (punto 3.1). I segnali per HKγ e S’2/6 vengono ingranditi per renderli visibili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5 . Peso molecolare di lignina. Grafici GPC delle lignine ottenute suddivisi per fonte (un = noce, b = pino legno, c = legno di faggio e d = legno di cedro). Le righe corrispondono ai diversi campioni come determinato dalla tabella 2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6 . De-eterificazione di lignina. Schema di reazione della de-eterificazione della lignina ethanosolv ottenuto da gusci di noce (passaggio 4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.  Figura 7 . Lignina depolimerizzazione di acetali. Schema di reazione per depolimerizzazione della lignina per fenolico 2-arylmethyl-1,3-dioxolanes (acetali). Unità H: R1 = R2 = H; Unità G: R1 = OMe, R2 = H; Unità S: R1 = R2 = OMe (passaggio 6). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 8 . Acetale resa per origine. Rendimenti di fenolici 2-arylmethyl-1,3-dioxolanes (acetali) ottenuti dalla depolimerizzazione della lignina da fonti diverse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 9 . Influenza dei legami β-O-4 sulla resa dell’acetale. Rese di fenolici 2-arylmethyl-1,3-dioxolanes (acetali) ottenute dalla depolimerizzazione di lignina rispetto al totale β-O-4 (blu), non esterificato β-O-4 (arancione) ed eterificato β-O-4 (grigio) contenuto nel feedstock di lignina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Fonte Condizioni Rendimento (%) Estrazione di efficienza (%)1 Rapporto S/G/H Totale β-O-4 Β-O-4 Β ‘ – O – 4 Β-Β Β-5 Noce A 5,0 ± 0,7 12.4 45/46/9 75 ± 2,5 36 ± 2.6 39 ± 3.1 11 ± 0,7 5 ± 1,5 Noce A * 2.6 6.5 8/45/47 53 32 21 9 4 Noce B 15,2 37,7 59/37/4 74 20 54 9 6 In noce2 B * 19,3 47,9 75/25/0 35 5 30 7 3 In noce2 C * 16,2 40.2 65/33/2 45 10 35 8 3 Pino A 3.5 12,2 0 / > 99 / < 1 59 22 37 0 14 Pino B 4.0 14,0 0 / > 99 / < 1 46 7 39 0 8 Faggio A 5.4 28,7 63/37/0 82 43 39 12 5 Faggio3 B 13,9 73,9 83/17/0 45 11 35 9 2 Cedro A 6.4 18,2 0 / > 99 / < 1 64 28 36 0 6 Cedro B 11.5 32,8 0 / > 99 / < 1 41 7 34 0 7 Tabella 1. Risultati estrazione Ethanosolv. Ottenuto rendimenti, aromatico distribuzione e collegamenti per le diverse estrazioni eseguite sulla biomassa. * L’acido solforico è utilizzato come acido. 1 Rendimento della lignina (wt%)/Lignin contenuto in materie prime come determinato dalla determinazione di lignina Klason. 2 Emicellulosa e S-condensato presente nel prodotto. 3il 32% delle S-unità sono condensati. Fonte Condizioni Mn (g/mol) Mw (g/mol) Ð Noce A 1096 1805 1.65 Noce B 1174 2934 2.50 Noce C * 1248 2930 2.35 Pino A 1331 3071 2.31 Pino B 1319 3596 2.73 Faggio A 1645 3743 2.28 Faggio B 1368 4303 3.14 Cedro A 860 1626 1,89 Cedro B 1188 3292 2,77 Tabella 2: peso molecolare delle lignine ottenute. Fonte Condizioni Rendimento (%) Rapporto S/G/H Totale β-O-4 Acetale S (wt %) Acetale G (wt %) Acetale H (wt %) Rendimento totale dell’acetale (wt %) Noce A 5.0 45/46/9 72 4.5 5.9 2.1 12.5 Noce B 15,2 59/37/4 74 3.6 4.7 1.0 9.3 Noce C * 16,2 65/33/2 45 3.8 3.9 0.6 8.3 Pino A 3.5 0 / > 99 / < 1 59 0 9.9 0.3 10.2 Pino B 4.0 0 / > 99 / < 1 46 0 1.1 0 1.1 Faggio A 5.4 63/37/0 82 7.7 6.7 0 14,4 Faggio B 13,9 83/17/0 45 3.6 3.4 0 7.0 Cedro A 6.4 0 / > 99 / < 1 64 0 8.1 0.1 8.2 Cedro B 11.5 0 / > 99 / < 1 41 0 4.7 0 4.7 Tabella 3: acetale rendimenti di depolimerizzazione di lignina. Rendimenti di fenolici 2-arylmethyl-1,3-dioxolones (acetali) ottenuti dalla depolimerizzazione della lignina da fonti diverse. Condizioni: lignina 50mg, 60 wt % glicole etilenico, 10 wt % Fe(OTf)3, solvente: 1,4-diossano, 140 ° C (1 mL di volume totale), 15 minuti (passaggio 7). Fonte Condizioni Resa di estrazione di lignina (%) Β-O-4 Β ‘ – O – 4 Totale β-O-4 Rendimento totale dell’acetale (wt %) Rendimento complessivo dell’acetale corretto per lignina estrazione resa (wt %)1 Noce A 5.0 34 38 72 12.5 0,63 Noce B 15,2 20 54 74 9.3 1.41 Noce C * 16,2 10 35 45 8.2 1.33 Pino A 3.5 22 37 59 10.2 0.36 Pino B 4.0 7 39 46 1.1 0,04 Faggio A 5.4 43 39 82 14,4 0.78 Faggio B 13,9 11 35 45 6.9 0,96 Cedro A 6.4 28 36 64 8.2 0,52 Cedro B 11.5 7 34 41 4.7 0.54 Tabella 4: nel complesso la resa dell’acetale rettificato con resa di estrazione. Rese di fenolici 2-arylmethyl-1.3-dioxolanes (acetali) ottenute dalla depolimerizzazione della lignina da diverse fonti corretto per resa di estrazione di lignina. 1 Calcolo: 100 *(lignin yield/100) * (totale dell’acetale resa/100). Condizioni: lignina 50mg, 60 wt % glicole etilenico, 10 wt % Fe(OTf)3, solvente: 1,4-diossano, 140 ° C, 15 min (reazione tramite il passaggio 6) & il work-up tramite step 7.

Discussion

I risultati dalle estrazioni alle diverse condizioni e dalle fonti di biomassa diversi rivelano come le condizioni ottimali per l’estrazione della lignina con un contenuto relativamente elevato di β-O-4 collegamenti possono variare a seconda della fonte. Ad esempio, estrazione di noce a condizioni più severe (metodo B) fornisce un triplice aumento della resa con una ritenzione nei pressi della quantità di unità di β-O-4, mentre per faggio e cedro, il rendimento aumenta ma è accompagnata da un calo significativo nella quantità di β-O-4 unità. D’altra parte, per Pino, le più severe condizioni di estrazione offrono molto poco beneficio nel rendimento e anche portano a una lignina con una quantità molto bassa di β-O-4 unità. Ciò significa che in genere qualche forma di ottimizzazione deve essere coinvolti per ottenere il giusto equilibrio tra la lignina resa e qualità sotto forma di conservazione della quantità di β-O-4 unità nel materiale ottenuti lignina.

L’aumento grande nella Mw del materiale lignina ottenuto da più severe condizioni di estrazione dimostra che in queste condizioni frammenti più grandi possono essere estratti fornire rendimenti più elevati. Tuttavia, a queste condizioni, ulteriore frammentazione si verifica, fornendo materiale di peso molecolare inferiore supplementare e aumentando così la polidispersione può essere visto chiaramente nei grafici GPC di noce (Figura 5a) e cedro (Figura 5D) in la forma del segnale di ~ 500 Da.

HSQC NMR è un importante strumento informativo per fornire dati comparativi sulla qualità dei diverse lignine. Dovrebbe essere notato che in questa procedura che viene eseguito un esperimento HSQC standard, questo è grande per l’ottenimento di dati comparativi ma non è necessariamente quantitativo dovuto le differenze nei tempi di rilassamento. L’elevata quantità di collegamenti visualizzati per alcuni lignine nella tabella 1 sono sopravvalutati. Quantitativa HSQC esperimenti forniscono risultati migliori ma costano significativamente più tempo NMR, anche se esistono alternative29. Nella nostra esperienza, i numeri nella tabella 1 dovrebbero essere diviso per un fattore di un 1.3 per meglio riflettere la quantità effettiva di β-O-4 unità per 100 unità aromatiche.

Come accennato in precedenza, i risultati riferiti sottolineano come trovare condizioni ottimali può variare a seconda della fonte al fine di ottenere i rendimenti massimi monomero. Per esempio, quando la noce è utilizzato come materiale di partenza, i totali complessivo acetali producono aumenti circa due volte se le condizioni più severe (metodo B) sono impiegate per l’estrazione di lignina. Tuttavia, questo è principalmente dovuto la grande differenza di resa di estrazione di lignina, senza incidere sul contenuto di β-O-4. Diversamente, quando viene utilizzato il pino più delicate condizioni di estrazione (metodo A) sono preferibili. Infatti, risultati di estrazione di lignina in rendimenti molto simili in due casi, ma più severe condizioni causano un calo della β-O-4 unità (soprattutto non esterificato legami β-O-4) che può essere il motivo per tale un rendimento basso monomero, come indicato nel paragrafo precedente. Una perdita significativa di non esterificato legami β-O-4 può essere osservata anche nei casi di faggio e cedro, se vengono applicate condizioni (metodo B) per l’estrazione che eventualmente porta ad una minore resa di monomeri. Tuttavia, la resa dell’acetale non differisce molto a seconda delle condizioni di estrazione. Infatti, un aumento approssimativo di due volte nella resa di estrazione di lignina è osservato per entrambe le fonti di biomassa passaggio da metodi A B che compensa la diminuzione di circa due volte nella resa di monomero.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il lavoro è stato finanziato dall’Unione europea (Marie Curie ITN ‘SuBiCat’ PITN-GA-2013-607044, PJD, KB e JGdV), oltre al sostegno finanziario dal Consiglio europeo della ricerca, ERC a partire Grant 2015 (CatASus) 638076 (annunci e KB) e il programma di ricerca talenti Schema (Vidi) con numero di progetto 723.015.005 (KB), che è finanziata in parte dell’organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO).

Materials

Materials
Iron (III) triflate Sigma Aldrich 708801-1G purity: 90%
Octadecane Sigma Aldrich 0652-100G purity: 99%
Celite Alfa Aesar H33152.0B
Silica Gel SiliCycle R12030B-1KG P60 40-63 μm
Dichloromethane Macron Fine Chemicals 6779-25
Walnut shells
Pine wood
Cedar wood
Beech wood
Ethanol JT Baker Chemicals 00832000001 Ethanol absolute
Isopropanol Acros Organics 149320025 99.5+% extra pure
Acetone Macron Fine Chemicals 2440-06
Tetrahydrofuran Boom B.V. 164240025 stabilized with BHT
Toluene Macron Fine Chemicals 8608-02
Water Demi water from the internal supply
1,4-Dioxane Acros Organics 408820010 99+% extra pure
Hydrochloric acid Acros Organics 124620026 37% solution in water
Sulfuric acid Boom B.V. 760519081000 95-97%
Acetone-d6 Acros Organics 325320500 99.8 atom% D
Deuterium oxide Sigma Aldrich 151882-100G 99.9 atom% D
Filters Munktell 400303185 185 mm diameter, 10 μm pore size
Magnetic stirring bars VWR 442-4525
Syringe filter Sartorius 17559-Q 0.45 μm filter
Autosampler vial (2 mL) Brown 151123
Reduced volume inlet (0.3 mL) Brown 150820
Autosampler caps (11 mm) Brown 151216
Autosampler vial crimper
Oil bath
Syringes (1 mL) Henke Sass Wolf 4010-200V0
Heating block-4 positions IKA
Micro tubes 2 ml Sarstedt 72691
Crimp seals-20 mm Brown Chromatography Supplies 151287 with Silicone/PTFE septa
Equipment
Rotary Ball Mill Fritsch 06.2000.00 Laboratory Planetary Mono Mill PULVERISETTE 6
Hammer mill Brabender
Micro Hammer mill Brabender
Vacuum oven Heraeus Heraeus Vacutherm
Reflux setup and other glassware CBN Suppliers B.V. Reflux condensor, Roundbottom flask, Beaker glass and funnels
Rotary evaporator IKA
250 mL high pressure autoclave Berghof
1 L high pressure autoclave Medimex
Ultrasonic bath Emerson type Branson 3210
NMR instrument Bruker Ascend 600
THF-GPC Hewlett Packard 1100 series
Magnetic stirring plate SalmenKipp SK861492220263 type x-1250
Coffee grinder Profi Cook PC-KSW1021
Drilling machine Solid type TB 13 S
GC-FID Shimadzu
BUCHI Reveleris PREP purification system  Buchi
BUCHI C18 column  Buchi 150 mm × 21.2 mm × 10 μm
20 ml microwave vials ???
Univapo 150 ECH rotational vacuum concentrator UniEquip
Eppendorf minispin tabletop centrifuge  Eppendorf
SB2 rotator Stuart
Vortex Wilten
Processing Software
WinGPC Unichrom
MestReNova

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Cite This Article
Zijlstra, D. S., de Santi, A., Oldenburger, B., de Vries, J., Barta, K., Deuss, P. J. Extraction of Lignin with High β-O-4 Content by Mild Ethanol Extraction and Its Effect on the Depolymerization Yield. J. Vis. Exp. (143), e58575, doi:10.3791/58575 (2019).

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