Denne metoden for første gang beskriver pålitelig eksperimentelle prosedyrer for effektiv induserbart metanol-fri rekombinante proteiner produksjon i Pichia pastoris (Komagataella phaffii), ansette karbon kilde regulert arrangører P DCog PDF småskala eksperimenter mens dyrking parametere kan bli overvåket online, og en konstant glyserol feed brukes.
Metanol er en veletablert karbon kilde og induser for effektiv protein produksjon ansette Pichia pastoris (P. pastoris) som vert på mikro-, lab og industriell skala. Men dens toksisitet og brannfare er det et ønske om å unngå metanol samtidig opprettholde høy produktiviteten til P. pastoris. Småskala bioreactor nærområdet (0,5-5 L volum) brukes vanligvis til å evaluere en belastning og egenskapene protein produksjon siden Mikroskala dyrking i dypt bra plater kan neppe kontrollert eller bruker dyrt utstyr. Videre ble tradisjonelle protokoller for dyrking og induksjon av P. pastoris etablert for grunnleggende uttrykk eller metanol induksjon og så langt ingen pålitelig protokollene ble beskrevet skjermen P. pastoris uttrykk stammer med derepressible arrangører i (kontrollert og overvåket) parallelle nærområdet. For å forenkle slike første lokalt for å karakterisere og sammenligne nye protein produksjon stammer, etablerte vi en enkel riste flasken dyrking system for metanol ytringsfrihet som simulerer bioreactor betingelser inkludert en konstant langsom glyserol feed og online overvåking, og dermed kommer nærmere den virkelige forholdene i bioreactors sammenlignet med mest brukte småskala satsvis i nærområdet. Undertrykt arrangører PDC og PDF ble brukt for å drive rekombinant protein uttrykk i P. pastoris, karbon kilde. Polymer plater med innebygd karbon kilde, slippe en konstant mengde glyserol, sikret en fôr rente levere den nødvendige energien for å opprettholde arrangørene aktive samtidig biomasse generasjon lav.
Forbedring i ytelse og pålitelig dyrking forholdene på stor skala for rekombinante proteiner produksjon av mikroorganismer som bakterier eller gjær er en av viktigste behovene til dagens bioteknologi1 og den kommersielle suksessen av industrielle programmer. Dueto enkel dyrking prosedyrer og media, høy avkastning og godt preget verktøy2 Pichia pastoris (Komagataella phaffii) er en mye brukt ikke-konvensjonelle gjær for rekombinante proteiner produksjon. Flere nyskapende verktøy utvikles stadig for denne arten, som nye uttrykk vektorer inkludert nye arrangører som alternativer til den brukte PAOX1, regionen arrangøren av alkohol oksidase 1 gen3, 4,5. En 500 bp lang DNA sekvens oppstrøms hurtigtasten katt1 (CTA1) genet ble identifisert som formidler regionen, som gir en ny metanol-fri og allsidig strategi i P. pastoris. Hurtigtasten katt1 genet er bare catalase genet av P. pastoris protein ligger i peroxisomes. Catalase spiller en viktig rolle i detoksifisering av reaktive oksygen arter, som er som oppstår, f.eks., fra metanol oksidasjon i peroxisomal MUT veien eller under beta oksidering av fettsyrer6,7. Uttrykk for hurtigtasten katt1 genet er undertrykt i prescence glukose eller glyserol i dyrking medium og derepressed på uttømming av disse karbon kilder8. Videre kan uttrykk for catalase genet indusert med metanol og remarkebly også med oljesyre, tilsynelatende blir bare genet av P. pastoris MUT veien som kan bli indusert med oljesyre selv når lignende uttrykk nivåer som med metanol induksjon9.
500 bp fragmentet av denne P. pastoris hurtigtasten katt1 promoter, som kalles PDC (noen ganger også FORKORTEDE Phurtigtasten katt1-500), har allerede blitt testet for produksjon av intracellulært uttrykt og utskilles proteiner og det viste seg for å være en attraktivt alternativ til to klassiske P. pastoris arrangører-sterk konstituerende PGAP og metanol induserbart PAOX1, som ble utviklet mer enn 20 år siden. PDC klarte å nå 21% (CalB) og 35% (HRP) volumetriske aktiviteter sammenlignet PGAPET i sukker rik medium. På metanol induksjon, PDC bare svare ikke raskere enn PAOX1, men også tydelig kunne utkonkurrere det av en 2,8 fold høyere siste titer CalB9.
Foruten PDC, hadde en orthologous selskapet (PDF) identifisert viser en lignende regulering profil. Det er imidlertid betydelig sterkere enn PDC under derepressed samt under metanol-indusert forhold (manuskriptet forberedelse)3.
I tilfeller hvor sterk konstituerende PGAP mislyktes på grunn av fysiologisk problematisk eller cytotoksiske proteiner10,11representerer PDC og PDF et ideelt alternativ. Mikro skala eksperimenter, uttrykket drevet av disse arrangører starter etter uttømming av første karbon kilde (f.eks., glukose eller glyserol), som muliggjør biomasse produksjon uten å belaste cellene med overuttrykte rekombinant protein helt fra begynnelsen. Mens begge disse arrangører er fortsatt induserbart av metanol, aktivering av derepression gjør ytterligere bruk av den preinduction fasen i forhold til uttrykkene ansette PAOX1. Videre kan PDC og PDF brukes for metanol-fri protein produksjon, som er ønskelig mål for store industriprosesser12.
Utviklingen av gjeldende produksjon stammer og uttrykk konstruksjoner må flere trinn i utviklingen sendes for å snevre inn fra mange transformants til den foretrukne kandidaten for oppskalering. Screenings utføres vanligvis i høy gjennomstrømning i flere bra plater (mikro skala: mindre enn 0,5 mL) for å fange en rekke kloner så stor som mulig. Etterfølgende re screening og re-re-screening er det neste trinnet, etterfulgt av riste flasken (liten skala: 50-250 mL) eller (mikro-) bioreactor screenings12. Men er det ønskelig å ha en metode, som ligner mest mellom ulike skalaer fra hundrevis av microlitres i dyptgående brønn plater til flere ml i riste flasker til senere skalaen opp av metanol-fri produksjon i godt kontrollerte bioreactors. Selv om rist kolber kan gi allerede lik volumer som små bioreaktorer, finnes det flere begrensninger, som er svært relevante for storskala protein produksjon som konstant mating, lufting og online-overvåking13 av vekst og oksygentilførsel. Optisk overvåking ansette tilpasset riste flasker og risting enheter gir en kostnadseffektiv alternativ til mer avansert utstyr for parallell dyrking samtidig som konstant online informasjon om store kultur parameterne som biomasse og oppløst oksygen konsentrasjon. Langsom frigjøring av karbon kilde fra polymer operatører kan brukes for å sikre en konstant og kontrollert feed uten å stole på komplekse tekniske løsninger og enheter, simulere flere lignende forhold av bioreaktorer enn tidligere brukt enkel full utarming av karbon kilde9,10, begrensende hvor energi for pågående protein uttrykk blir.
Følgende beskriver en liten til middels skala metanol-fri kontrollerbar protein uttrykk i P. pastoris basert på den nye arrangørene PDC og PDF. Induksjon av derepression innebærer to faser. Den første korte fasen av biomasse akkumulasjon uten produksjon av protein av interesse, med en karbon kilde som represses arrangørene og en fase av målet protein produksjon, der en karbon kilde leveres liten, men konstant konsentrasjoner opprettholde selskapet derepressed. Avlytting viktigste dyrking parametere brukes i hele dyrking perioden. Målet var å gi en metanol gratis, pålitelig og skalerbar dyrking system for P. pastoris.
Denne metoden presenterer en protokoll som er pålitelig for effektiv metanol uavhengig induserbart uttrykket av P. pastoris som et alternativ til klassisk metanol indusert protein uttrykk drevet av PAOX112. De repressible arrangører, som PDC, PDF eller beskrevet tidligere mutert PAOX1 varianter17, bygge molekylær grunnlaget for dette nye protein produksjonen konseptet. Vist representant resultatene understreker nytten og gjennomførbarhet av rekombinant protein uttrykk i P. pastoris av de undertrykte arrangører og småskala screening med enkel avlytting. På den ene siden, kan skadelig og giftige metanol som vanligvis brukes for induksjon av AOX1 arrangøren fjernes fra dyrking. På den annen side, vekst og produksjonsfasen protein er montert9 i motsetning konstituerende protein uttrykk, f.eks., med brukte PGAP. Dette er spesielt nyttig når cellene skal uttrykke giftig eller skadelige proteiner som viser en byrde for dem.
Muligheten til å starte i nærområdet med forskjellige karbon kilde konsentrasjoner kan beslutningen om hvor mye biomasse man ønsker å få før produksjonsfasen protein starter. Når du velger en lavere karbon kilde konsentrasjon i bunken, reduseres oksygen overføring begrensninger på grunn av for høy celle tettheter mens derimot høyere celle tettheter kan også resultere i høyere protein titers. Ved å overvåke kultur utviklingen biomasse generasjon og Oksygenkonsentrasjoner, kan det optimale tidspunktet for matet-batch innvielsen bestemmes lett som det er vist i figur 1.
Online overvåking av parameterne dyrking, bør et passende målesystem brukes. Biomasse måleinstrument (f.eksSFR Vario) er en enkel og økonomisk online målesystem for kultur overvåking i riste flasker. Optoelektronisk leseren bestemmer cellevekst i flasken via spredte lys gjenkjenning og leser ut signalet av oksygen sensor integrert i flasken. Optikk for biomasse måling består av en LED som avgir et lys signal, som er spredt av partikler (celler) i kultur buljong og oppdaget med en photodiode. Optiske sensorer avgir fluorescens når opphisset med lys av en bestemt bølgelengde. Avhengig av analytt molekyler stede endres fluorescens signalet, som er oppdaget av leseren optikk og oversatt til konsentrasjon verdier. Men må en celle tetthet måling kalibrering opprettes på forhånd, siden målesystemet ikke er måle faktiske OD600 verdier. Oksygen uptake rate kan beregnes fra skråningen av oksygen kurven med reader-programmet, og kroppstemperatur samt rpm registreres kontinuerlig sammen med de andre parameterne. For å aktivere overvåking med dette systemet, må riste kolber tidligere være utstyrt med passende sensorer for de ønskede parameterne.
Tillegg av fire slow-release polymer plater gir en konstant mengde glyserol til kultur kjøttkraft, biomasse akkumulering er nesten stoppet og rekombinante proteiner produksjon fortsetter. Fastsettelse av feed plate tillegg tidspunktet er ikke en avgjørende skritt i dette eksperimentet, men det anses at en tidlig feed start før den eksplosive vekst fasen kan være hemme selskapet aktiveringen som uttrykket begynner på karbon kilde uttømming. I tillegg kan totalen mate tid på grunn av polymer kapasitetsbegrensninger reduseres, mens forsinke feed når cellene har nådd den stasjonære fasen kan føre til sultne og nedbrytning av allerede produsert protein. Beløpet av mate plater brukes i denne protokollen identifiserte eksperimentelt for optimal karbon kilde versjon å holde selskapet de undertrykte mens du holder biomasse generasjon lav (data ikke vist). På denne måten i nærområdet kan være utført lett over 160-180 h uten innblanding.
Main søknader av denne nye protokollen blir i uttrykket klone screening, enzym utvikling og oppdagelsen, karakterisering og utvikling av nye arrangører ansette en metanol-fri dyrking protokoll i godt overvåket forhold. I prinsippet skal den samme protokollen gjelde for blandet-feed strategier ansette metanol og begrenset fermentative karbon kilde feeder som beskrevet av Panula-Perälä et al. i 201418.
The authors have nothing to disclose.
ROBOX har mottatt finansiering fra europeiske Union (EU) prosjektet ROBOX (grant avtalen n ° 635734) under EUs horisonten 2020 program forskning og innovasjon handlinger H2020-LEIT BIO-2014-1. Synspunkter og meninger uttrykt her er bare de av forfatteren/forfatterne, og nødvendigvis ikke de av EU forskning byrået. Den europeiske unionen er ikke ansvarlig for bruk som kan gjøres til informasjonen heri.
Doktoravhandlinger J. Fischer er co-finansiert av en bevilgning for “Industrienahe avhandling” østerrikske finansiering byrået FFG.
Vi takker Gernot John (PreSens GmbH) for nyttig diskusjoner og verdifulle innspill for manuskriptet utkastet.
Bacto Yeast Extract | BD Biosciences | 212720 | |
Baffled Flask 250 mL | DWK Life Science | 212833655 | |
BBL Phytone Peptone | BD Biosciences | 298147 | |
BioPhotometer | Eppendorf AG | 5500-200-10 | |
Certoclav-EL | CertoClav GmbH | 9.842 014 | |
Difco Yeast nitrogen base w/o amino acids | BD Biosciences | 291920 | |
Feed discs glycerol | Adolf Kuhner AG | 315060 | |
Glucose-monohydrate | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6887 | |
Glycerol ≥98 % | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3783 | |
K2HPO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6875 | |
KH2PO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904 | |
Multitron Standard | Infors AG | 444-4226 | |
SFR Vario v2 | PreSens GmbH | 200001689 |