Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

التعبير المستقلة الميثانول بسطورس بيشيا تستخدم تكنولوجيات إزالة القمع

doi: 10.3791/58589 Published: January 23, 2019

Summary

يصف هذا الأسلوب للمرة الأولى إجراءات تجريبية موثوقة لكفاءة إنتاج البروتين خالية من الميثانول المؤتلف إيندوسيبلي في بيشيا بسطورس (كوماجاتايلا فافي)، توظيف المروجين المصدر ينظم الكربون ف DCوفمدافع في تجارب صغيرة الحجم بينما زراعة يمكن رصدها المعلمات على الإنترنت، ويتم تطبيقها في تغذية والغليسيرول مستمر.

Abstract

والميثانول هو مصدر الكربون الراسخة ومحفِّز لإنتاج البروتين كفاءة توظيف بسطورس بيشيا (P. بسطورس) كمضيف على نطاق المشاريع المتناهية الصغر، ومختبر والصناعية. ومع ذلك، بسبب سميتها والقابلية للاشتعال، هناك رغبة في تجنب الميثانول مع الحفاظ على إنتاجية عالية بسطورس P.. يأتي مفاعل حيوي صغيرة الحجم (0.5-5 حجم العمل L) تستخدم عادة لتقييم سلالة وخصائصها إنتاج البروتين نظراً لزراعة microscale في لوحات عميقة جيدا يمكن التحكم بالكاد، أو تعتمد على معدات غالية الثمن. وعلاوة على ذلك، البروتوكولات التقليدية لزراعة وتحريض بسطورس P. أنشئت لتحريض التعبير أو الميثانول التأسيسية وحتى الآن، ووصفت أية بروتوكولات موثوقة للشاشة بسطورس P. التعبير سلالات مع المروجين ديريبريسيبلي في الزراعات موازية (الخاضعة للرقابة والمراقبة). لتبسيط هذه الزراعات الأولى لوصف ومقارنة سلالات جديدة من إنتاج البروتين، ونحن أنشأت نظاما زراعة قارورة هزة بسيطة الميثانول حرية التعبير التي تحاكي ظروف مفاعل حيوي بما في ذلك والغليسيرول بطء مستمر تغذية والرصد على الإنترنت، وبذلك يقترب الظروف الحقيقية في المفاعلات الحيوية مقارنة بمعظمها التطبيقية صغيرة الحجم الدفعي الزراعات. إلى محرك التعبير البروتين المؤتلف في P. بسطورس، مصدر الكربون قمع المروجين وطبقت فالعاصمة و فمدافع . أقراص البوليمر مع مصدر الكربون مضمن، الإفراج عن كمية ثابتة من الجلسرين، أكد معدل تغذية إيصال الطاقة اللازمة للإبقاء على المروجين النشطة مع الحفاظ على انخفاض توليد طاقة الكتلة الأحيائية.

Introduction

التحسن في الإنتاجية وظروف زراعة موثوق بها على نطاق واسع لإنتاج البروتين المؤتلف من الكائنات المجهرية مثل البكتيريا أو الخميرة أحد أهم الاحتياجات من التكنولوجيا الحيوية اليوم1 والنجاح التجاري للصناعة التطبيقات. داتو زراعة بسيطة الإجراءات ووسائل الإعلام، عالية الغلة وأدوات جيدة تتسم2 بيشيا بسطورس (كوماجاتايلا فافي) خميرة غير تقليدية مستخدمة على نطاق واسع لإنتاج البروتين المؤتلف. تطوير أدوات مبتكرة إضافية باستمرار لهذه الأنواع، مثل ناقلات التعبير الجديد بما في ذلك المروجين جديدة كبدائل لتستخدم على نطاق واسع فAOX1، منطقة المروج من الكحول أوكسيديز 1 الجينات3، 4،5. واعتبرت 500 bp طويلة تسلسل الحمض النووي المنبع الجينات CAT1 (CTA1) منطقة المروج، الذي يتيح لاستراتيجية جديدة لتعبير خالية من الميثانول وتنوعاً في باستوريس ص. الجين CAT1 مورثة الكاتالاز فقط من بسطورس P. والبروتين الموجود في بيروكسيسوميس. الكاتلاز دوراً هاما في إزالة السموم الأنواع الأكسجين التفاعلية، والتي تنشأ، على سبيل المثال-، من أكسدة الميثانول في مسار موت بيروكسيسومال أو أثناء أكسدة الأحماض الدهنية6،7بيتا. هو التعبير عن الجين CAT1 مكبوتة في prescence للسكر أو الجلسرين في الأجلين المتوسط وزراعة وديريبريسيد عند استنفاد هذه مصادر الكربون8. وعلاوة على ذلك، يمكن فعل التعبير عن الجين كاتالاز مع الميثانول وريماركيبلي أيضا مع حمض الأولييك، على ما يبدو أن الجينات فقط موت بسطورس P. المسار الذي يمكن أن يتسبب بحمض الأولييك حتى تصل إلى مستويات مماثلة من التعبير مع والميثانول التعريفي9.

الجزء bp 500 من هذا بسطورس P. CAT1 المروج، وهو ما يسمى فالعاصمة (في بعض الأحيان أيضا مختصر فCAT1-500)، قد تمت تجربته بالفعل لإنتاج البروتينات إينتراسيلولارلي المعلنة ويفرزها وأنه ثبت أن بديل جذاب لاثنين الكلاسيكية المروجين بسطورس ص – ف التأسيسي قويةالفجوة والميثانول إيندوسيبلي فAOX1، التي وضعت منذ أكثر من 20 عاماً. فالعاصمة كان قادراً على الوصول إلى 21% (كالب) و 35% (HRP) أنشطة الحجمي فالفجوة في السكر المتوسط غنية بالمقارنة. بناء على تحريض الميثانول، فالعاصمة لم تستجب سوى أسرع فAOX1، ولكن يمكن أن يتفوق أيضا بوضوح أنه قبل عيار 2.8 إضعاف نهائية أعلى من كالب9.

قد حددت مروج أورثولوجوس (فمدافع) إلى جانب فالعاصمة، نستعرض لمحة لائحة مماثلة. ومع ذلك، أنها أقوى بكثير مما فالعاصمة تحت ديريبريسيد وكذلك ظل المستحثة الميثانول الظروف (مخطوطة في إعداد)3.

في الحالات حيث ف التأسيسي قويةالفجوة فشلت بسبب البروتينات فسيولوجيا إشكالية أو السامة للخلايا10،11، فالعاصمة وفمدافع تمثل بديلاً مثاليا. في تجارب على المستوى الجزئي، يبدأ التعبير مدفوعا بمروجي هذه بعد نضوب مصدر الكربون الأولى (على سبيل المثال-، السكر أو الجلسرين)، مما يسهل إنتاج الكتلة الحيوية دون إثقال الخلايا مع overexpression من البروتين المؤتلف من البداية. في حين أن كلا من مروجي هذه لا تزال إيندوسيبلي من الميثانول، التنشيط بواسطة ديريبريشن يجعل استخدام إضافية تستهدف المرحلة مقارنة لتعبيرات تستخدم فAOX1- وعلاوة على ذلك، فالعاصمة وفمدافع يمكن استخدامها لإنتاج البروتين خالية من الميثانول، وهدف مرغوب فيه للعمليات الصناعية الكبيرة12.

لتطوير سلالات الإنتاج المطبقة وثوابت التعبير، قد عدة خطوات في التنمية لتمريرها من أجل تضييق من إعداد كبيرة من ترانسفورمانتس للمرشح المفضل للارتقاء. عروض تتم عادة في الإنتاجية العالية في لوحات متعددة جيدا (الحجم الصغير: أقل من 0.5 مل) من أجل اعتقال مجموعة من الحيوانات المستنسخة كبيرة بقدر الإمكان. إعادة الفرز اللاحقة وريريسكرينينج هو الخطوة التالية, متبوعاً بقارورة اهتزاز (صغيرة الحجم: 50-250 مل) أو عروض مفاعل حيوي (الصغرى)12. ومع ذلك، مرغوب فيه أن يكون أسلوب، الذي أكثر مماثلة بين جداول مختلفة من مئات ميكروليتريس في لوحات الآبار العميقة حتى مل عدة في قوارير يهز حتى الارتقاء لاحقاً بإنتاج الميثانول الحرة في التي تسيطر عليها جيدا المفاعلات الحيوية. على الرغم من أن يهز قوارير يمكن أن توفر كميات مماثلة سبق كالمفاعلات الحيوية الصغيرة، وهناك العديد من القيود، هامة للغاية لإنتاج البروتين كبير الحجم مثل التغذية المستمرة والتهوية والإنترنت رصد13 من النمو و إمدادات الأكسجين. استخدام الرصد البصري تكييف قوارير اهتزاز وتوفر أجهزة الهز بديلاً فعالاً من حيث التكلفة لمعدات أكثر تطورا لزراعة موازية مع الاستمرار في توفير المعلومات على الإنترنت المستمر حول معلمات الثقافة الرئيسية مثل الكتلة الأحيائية وتركيز الأكسجين المذاب. بطء الإفراج عن مصدر الكربون من الناقلين البوليمر يمكن تطبيقها لتأمين تغذية مستمرة والتي تسيطر عليها دون الاعتماد على الحلول التقنية المعقدة والأجهزة، ومحاكاة ظروف مماثلة أكثر من المفاعلات الحيوية من كامل بسيطة المطبقة سابقا حيث تصبح الطاقة للتعبير البروتين الجارية الحد من استنزاف الكربون مصدر9،10،.

الأسلوب التالي يصف صغيرة المتوسطة الحجم في التعبير البروتين خالية من الميثانول يمكن السيطرة عليها يستند النظام في بسطورس P. المروجين جديدة فالعاصمة وفدف. التعريفي ديريبريشن ينطوي على مرحلتين. مرحلة قصيرة أول من تراكم الكتلة الحيوية دون إنتاج البروتين الفائدة، تستخدم مصدر الكربون التي تقمع المروجين ومرحلة ثانية من إنتاج البروتين المستهدف، حيث يتم توفير مصدر الكربون في تجمعات صغيرة ولكن ثابتة الحفاظ على المروج ديريبريسيد. يتم تطبيق الرصد عبر الإنترنت من أهم زراعة المعلمات أثناء فترة زراعة كله. والهدف توفير من الميثانول الحرة، ونظام موثوق بها وقابلة زراعة بسطورس ص.

Protocol

1-إعداد وسائط الإعلام

  1. إعداد الوسائط الحد الأدنى مخزنة (BMG مع الجلسرين، BMD مع سكر العنب كمصدر للكربون) (1 لتر)
    1. اﻷوتوكﻻف 650 مل ماء المقطر في زجاجة زجاج ملولبة 1 لتر. بعد تهدئة، إكمال المتوسطة بإضافة 100 مل 10 يعقم x YNB (134 غرام/لتر الخميرة النيتروجين قاعدة ث/س الأحماض الأمينية)، 200 مل من العازلة فوسفات البوتاسيوم (م 1، الرقم الهيدروجيني 6)، 30-100 مل 10% w/v السكر أو الجلسرين (حسب المبلغ المطلوب من الكتلة الحيوية الذي تم إنشاؤه أثناء الدفعة)، 2 مل العقيمة 500 × الحل البيوتين (10 ملغ/مل) وتعبئة ما يصل إلى 1 لتر مع تعقيم ماء مقطر.
      ملاحظة: جميع المكونات يجب أن يعقم في قوارير منفصلة. البيوتين ودمرت عندما يعقم، ولذلك يجب أن يكون عامل التصفية للتعقيم مع 0.2 ميكرون غشاء فلاتر.
  2. الوسائط الغنية مخزنة (بيبج) (1 لتر)
    1. اﻷوتوكﻻف 700 مل ماء المقطر مع 1% w/v الخميرة استخراج و 2% w/v ببتون في زجاجة 1 لتر سداده ملولبة. وبعد تهدئة، إضافة 30-100 مل والغليسيرول 10% w/v يعقم كل على حدة، 200 مل من المخزن المؤقت لفوسفات البوتاسيوم (1 م، الرقم الهيدروجيني 6) وملء يصل إلى 1 لتر بالماء المقطر المعقم.

2-اهتزاز إعداد قوارير

  1. إضافة 5 مل ماء المقطر في 250 مل حيرة يهز قوارير وتغطية ذلك مع اثنين من طبقات من القماش القطن وإصلاحه في المكان مع الأربطة المطاطية. تغطية القماش مع قطعة من رقائق الألومنيوم.
  2. اﻷوتوكﻻف قوارير في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للتعقيم الكامل.
  3. إزالة المياه المتبقية من قارورة والكوة 50 مل من وسائط الإعلام معدّة مسبقاً لكل قارورة.

3-بين عشية وضحاها ثقافة التطعيم

  1. بدء ثقافة بين عشية وضحاها (قدو) مع مستعمرة جديدة واحدة من سلالة التعبير المطلوب في 5 مل YPD (استخراج الخميرة 1% w/v، 2% w/v ببتون، الجلوكوز 2% w/v) في أنبوب الطرد مركزي 50 مل مع ترك الغطاء مفتوحاً قليلاً للسماح بالتهوية المناسبة.
  2. وليكن تنمو طوال الليل في 28 درجة مئوية، ورطوبة 80%، في شاكر 100-130 لفة في الدقيقة (قطره 2.5 سم الهز).

4-قياس الإعداد وزراعة الثقافة الرئيسية

  1. لإعداد نظام الرصد عبر الإنترنت، اتبع إرشادات الشركة المصنعة لمعايرة الأجهزة المناسبة.
  2. ضع جهاز كمبيوتر، حيث تم تثبيت البرنامج المناسب للرصد في نطاق اتصال Bluetooth إلى محطات القياس. بدء تشغيل البرنامج لتوصيل الأجهزة عن طريق البلوتوث.
    1. تشغيل اتصال Bluetooth على جهاز قياس الكتلة الحيوية بالضغط على الزر الفضي على الجبهة.
    2. في البرنامج، انقر فوق أجهزة ثم العثور على الأجهزة.
      ملاحظة: يجب أن تظهر قائمة في إطار خط مهمة الأجهزة. إذا لم يفعلوا ذلك، فإنه من المستحسن للتحقق إذا كان يتوجب البطاريات والكمبيوتر في متناول اليد لاتصال Bluetooth.
    3. سحب وإسقاط الأجهزة التي تم العثور عليها إلى الساحات على الجانب الأيمن من الشاشة صينية القياس.
    4. انقر فوق الاتصال.
      ملاحظة: عند الاتصال بنجاح، تظهر شاشة تحكم.
    5. لبدء اختبار تشغيل لاتصال Bluetooth، انقر فوق القياس.
    6. قم بإعداد التجربة.
      1. انقر فوق بدء القياس، اسم التجربة وتمكين كافة المعلمات المطلوبة لرصد.
        ملاحظة: التراخيص اللازمة لكل من المعلمات قياس ممكن.
      2. تعيين الفاصل الزمني إلى دقيقة 3.
        ملاحظة: الفاصل الزمني يحدد كيفية غالباً ما تؤخذ نقاط القياس وكل نقطة قياس ينتج عنه قيمة بعد ذلك. قياس كل دقيقة دقيقة جداً، ولكن الكثير من البيانات يتم إنشاؤها مما يجعله أكثر شاقة لتقييم.
      3. تعيين نقاط قياس متوسط إلى 11.
        ملاحظة: هذا الإعداد يحدد كم عدد نقاط القياس تؤخذ فعلا كل 3 دقائق. ولذلك، الإخراج هو قيمة متوسط نقاط قياس 11 أكثر من 11 ثانية.
      4. قم بإدخال أسماء للعينات.
      5. تخطي الشاشة التالية، حسب الزاوية الفعل معايرة قبل (الخطوة 4.1).
        ملاحظة: ينصح اختبار تشغيل لاتصال Bluetooth قبل تطعيم الثقافات الرئيسية لضمان اتصالات مستقرة والموقع المناسب للكمبيوتر متصلاً. أيضا، والبطاريات قد يوجه إليه الاتهام.
  3. قياس كثافة الخلية قدو (الخطوة 3.1) المخفف في زراعة وسائط الإعلام (01:20) في جهاز المطياف الضوئي في 600 الطول الموجي نانومتر. تلقيح 50 مل الوسط (أوصى بالكربون مصدر التركيز 0.3-1%, ممكن وسائل الإعلام المختلفة كما هو موضح في الخطوة 1.) مع قدو ل التطوير التنظيمي600 0.05 باستخدام الحساب التالي.
    Equation 1
  4. طرأت في قوارير الكشف ويهز في 28 درجة مئوية، 130 لفة في الدقيقة و 80% من الرطوبة.
    ملاحظة: من المهم جداً لإعطاء الثقافة 5 دقائق من الهز قبل البدء القياس تجنب الخلايا الشائكة إلى أسفل قارورة وتسفر عن قيم خاطئة.
  5. انقر فوق بدء القياس في البرنامج.
  6. أخذ عينات 0.2 مل لخلية قياس كثافة ح 4 بعد التطعيم وعندما يحصل على مصدر الكربون المنضب (التصميم الموضحة في الخطوة 4، 7) في تريبليكاتيس. تمييع العينات على نحو ملائم في زراعة وسائط الإعلام (القياس الأولى 1:5، الثانية القياس 01:20) وقياس الامتصاص في 600 الطول الموجي نانومتر في جهاز المطياف الضوئي. قبل إزالة في قوارير وحتى قبل وقف شاكر، دائماً وقفه القياس في البرنامج.
    ملاحظة: كاشفات محسوب لتسجيل المعلمات تحت شروط محددة بالهز وسوف تخضع لقياسات هراء عند تسجيل الثقافات لا يزال. أيضا، تأكد دائماً الانتظار 5 دقائق من الهز قبل بدء القياس مرة أخرى. قياسات الكثافة الخلية ضرورية نظراً لأن الجهاز هو إيصال القيم العادلة للكتلة الأحيائية وكثافة الخلية ليست حقيقية. دالة معايرة بين القيم600 OD (قيم) س والقيم التي تم الحصول عليها من قبل نظام قياس أون لاين (قيم y) يمكن أن يتحقق عن طريق قياس عدة تيميبوينتس سبيكتروفوتوميتريكالي. القيم لا في الخطي ولكن في علاقة لوغاريتمية وفقا لمعايرة الدالة التالية:
    Equation 2
    ص: OD600 القيم التي تم الحصول عليها عن طريق جهاز المطياف الضوئي
    x: القيم التي تم الحصول عليها بنظام قياس أون لاين
    ك: المنحدر
    d: تقاطع محور
    المنحدر وتقاطع المحور ثم يمكن استخدامها لتحويل أي قيمة إلى قيمة600 OD المقابلة. في Excel واحد رسم القيم600 OD سبيكتروفوتوميتريكالي التي تم الحصول عليها مقابل القيم من النظام على شبكة الإنترنت من تيميبوينت نفسه. إضافة خط اتجاه لوغاريتمي والمعادلة المقابلة سيعطي المعايرة الدالة المبينة أعلاه.
  7. زراعة حتى مصدر الكربون هو المنضب تقريبا (حوالي 12-20 ح). لهذا الغرض، اسمحوا الثقافات تنمو حتى أنه يمكن أن ينظر إليه في الرسومات التخطيطية للبرمجيات أن تركيز الأكسجين يقترب من الصفر والخلايا في مرحلة النمو الأسى.
    ملاحظة: هذا هو الحال بالنسبة لتركيزات مصدر الكربون المستخدمة في هذا البروتوكول. يمكن تحديد تيميبوينت نضوب مصدر الكربون مع نظام الرصد على شبكة الإنترنت كما هو مبين القبض في الشكل 1 في قسم النتائج الممثل، عند مستوى الأكسجين تقترب من الصفر والخلايا في النمو الأسى المرحلة.

5-البروتين التعبير بالقمع دي

  1. عند الوصول إلى تيميبوينت هو موضح في "الخطوة 4، 6"، تبدأ تغذية الثقافات بإضافة أربعة أقراص تغذية كل قارورة تحت ظروف معقمة.
    ملاحظة: في ظل الظروف الموصوفة، سراح أربعة أقراص تغذية والغليسيرول والغليسيرول 2 ملغ/ساعة حسب الشركة المصنعة.
  2. الاستمرار في زراعة ح 60-90 مع أخذ عينات كل 24 ساعة لرصد تعبير البروتين بمقايسة الاختيار (مثلاً.، برادفورد المقايسة15، فحوصات16 أو نشاط الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) وخلية قياسات الكثافة.

6-الثقافة الحصاد

  1. بعد ح 60-90 من زراعة، ملء الثقافات في أنابيب الطرد المركزي 50 مل للحصاد بالطرد المركزي في 4,000 س ز، 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: المادة طافية (للبروتينات يفرز) أو الخلايا (لتعبير البروتين داخل الخلايا) يمكن أن تحصد بالطرد المركزي في 4,000 س ز، 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وكذلك تحليلات يمكن القيام به.
  2. تصدير بيانات القياس على الإنترنت كملف جدول بيانات من البرنامج لمزيد من التحليل.
  3. ملء 5-10 مل ماء المقطر إلى جميع قوارير والاوتوكلاف لإلغاء تنشيط الخلايا المتبقية.

Representative Results

كما هو موضح في المقطع بروتوكول، البرنامج السجلات المعلمات زراعة هامة عبر زراعة كله. ويبين الشكل 1 التصور لتطوير طاقة الكتلة الأحيائية وتركيز الأكسجين أثناء زراعة بدأت مع 0.5% (الشكل 1A) أو 0.3% (الشكل 1B) مصدر الكربون في المجموعة متبوعاً بإضافة الجلسرين آر الأقراص. نظام المراقبة على الإنترنت مفيدة بشكل خاص للزراعات إزالة القمع تيميبوينت نضوب مصدر الكربون بعد الدفعة يمكن تحديده بالضبط. كما يتبين في الشكل 1، تتناقص سرعة تركيز الأكسجين في الأجل المتوسط وتقترب من الصفر، خاصة بالنسبة الجلسرين 0.5% في الدفعة (الشكل 1A) في حين الكتلة الأحيائية يتزايد أضعافاً مضاعفة في هذه المرحلة. هنا، الخلايا في مرحلة النمو الأسى وبغية تحقيق الاستخدام الأمثل للإفراج عن مصدر الكربون، قبل وقت قصير من الثقافة تصل إلى مرحلة ثابتة، ينبغي إضافة أقراص تغذية كما يرد في البروتوكول. إضافة أقراص تغذية قبل تركيز الأكسجين تصل إلى الصفر مهم للتعبير البروتين إزالة القمع لمنع الخلايا من الحد من الأكسجين. تركيزات والغليسيرول أقل التقليل من تأثير قصير الأجل الأكسجين القيود كما يتبين في الشكل 1B وينصح بذلك للتعبير مكبوتة إزالة البروتين.

في ما يلي نتائج اثنين زراعة مختلف التجارب – تستخدم في وصف بروتوكول ونظام الرصد هو مبين في الشكل 1 – يرد. في التجربة الأولى، سلالة بسطورس P. المنتجة أوكسيديز الجلوكوز من النيجر الرشاشيات (النيجر) أ () تحت سيطرة فالعاصمة وفي الثانية سلالة بسطورس P. إنتاج هرمون النمو البشري تحت سيطرة فمدافع يرد.

في هذه التجربة، تم التحقيق فيها الجلوكوز أوكسيديز الإنتاج تحت سيطرة فالعاصمة . ولذلك، كانت مقارنة الاستراتيجيات المختلفة زراعة: والغليسيرول النبض، والغليسيرول مستمر تغذية من خلال إضافة أقراص تغذية وزراعة دون أية تغذية أو النبض. تم الزراعة في مخزنة الوسائط الحد الأدنى 50 مل مع جلوكوز 0.5% كمصدر للكربون الوحيد في قوارير يهز 250 مل (الجدول 1).

عند زراعة 160 ح، تم الحصول على أعلى تركيزات الكتلة الأحيائية، وعندما كان استراتيجية تغذية باستخدام دفعة جلوكوز لإنتاج الكتلة الحيوية (ح 38) والجلسرين النبض (0.25% w/v والغليسيرول بعد ح 38، ح 61، وزراعة ح 86) يعمل (0.21 جرام/لتر المجموع الافرازية البروتين، 8.4 U/mL). على الرغم من أن تم الحصول على تخفيض تركيز الكتلة الحيوية والمبلغ الإجمالي للبروتين يفرز إضعاف، عندما أضيفت الأقراص تغذية بعد دفعة الجلوكوز ح 38، كان النشاط الحجمي حتى 1 يو/مليلتر أعلى مقارنة الزراعة باستخدام النبض والغليسيرول . وهذا يشير إلى أن كمية كبيرة من البروتين يفرز لا يساهم في النشاط الحجمي في المادة طافية وقد يفرز بشكل غير نشط. ولذلك، على ما يبدو أعلى تركيزات والغليسيرول من البقول والغليسيرول صالح تشكيل الكتلة الحيوية بدلاً من إنتاج البروتين الهدف وإطلاق سراح والغليسيرول منخفضة ثابتة أدت إلى زيادة إنتاجية محددة أكثر من شقين.

تم تجربة أخرى تستخدم أسلوب التعبير مكبوتة الشطب بالإعراب عن هرمون النمو البشري (hGH) تحت سيطرة فمدافع. [ستبلى] أدمجت في البناء جينوم سلالة بسطورس P. BSYBG11. هنا، 50 مل بيبج، مخزنة المتوسطة الغنية، في 250 مل واستخدمت قوارير يهز حيرة مع والغليسيرول 0.3% (w/v) كمصدر للكربون في الدفعة. عند استنفاد والغليسيرول، مكفولة تعبير البروتين مع والغليسيرول مستمر تغذية بإضافة 4 آر أقراص كل قارورة ومقارنة الجلسرين لا آر (الشكل 2).

ويبين الشكل 2 مقارنة بين التعبير هرمون النمو والتنمية الكتلة الحيوية من نفس السلالة المزروعة مع أو بدون ثابت والغليسيرول آر. واستخدمت ساندويتش المقايسة أليسا مع الجسم المضاد الثانوي تنصهر لبرنامج الصحة الإنجابية وأجرى الكشف مع 3,3′، 5، 5 '--تيتراميثيلبينزيديني (TMB) كالركيزة. خاصة بالنسبة لهذا البروتين، يبدو أن القضية أن دون أي تغذية، الخلايا ابدأ أن يتحلل البروتين المنتجة بعد ما يقرب من 30 ح (المربعات الزرقاء الخفيفة)، بينما يمكن أن يكون هذا التدهور بالتغذية، منعت (مثلثات زرقاء داكنة) وحتى لا تزال زيادة تركيز البروتين في الكتلة الأحيائية بعد ح 150 من زراعة. كما سبقت ملاحظته هانسينولا polymorpha14، تظهر هذه النتيجة كيف يمكن التحول من دفعة، كما يتم استخدامه عادة في مقياس اهتزاز قارورة، إلى الوضع الدفعي بنك الاحتياطي الفيدرالي لتحسين الزراعات بسطورس ص .

Figure 1
رقم 1: التصور أون لاين سجلت المعلمات خلال الزراعات اثنين بتركيزات مختلفة والغليسيرول في الدفعة. كانت بدأت الزراعات مع 0.5% w/v (A) و 0.3% w/v (ب) والغليسيرول دفعة واحدة تليها مرحلة إزالة القمع حيث تم تغذية الخلايا عن طريق تطبيق 4 أقراص تغذية كل قارورة (الإفراج عن معدل 0.5 ملغ/ساعة/القرص وفقا للشركة المصنعة). إظهار خطوط متقطعة تركيز الأكسجين في المتوسط، بينما تظهر خطوط مستمرة كثافة الخلية (OD600). وتظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري لستة وإنشاء نسخ متماثلة (2 البيولوجية، التقنية الثلاثة كل). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: مقارنة بين التعبير هرمون النمو البشري (hGH) في الوضع الدفعي وتغذية--دفعة- تتم الإشارة إلى محتوى هرمون النمو باستيعاب القيم في 405 نانومتر أليسا فيها جسم 2nd انصهار برنامج الصحة الإنجابية واستخدمت TMB كركيزة للكشف عن. يظهر هي النتائج لثقافات مختلفة اثنين: الضوء الأزرق عرض الخط والساحات كانت كثافة الخلية وتركيز هرمون النمو تطبيع بكثافة خلية ثقافة دون أي تغذية بعد الدفعة، مقارنة بثقافة، حيث والغليسيرول آر أقراص تطبيق (خطوط زرقاء داكنة ومثلثات). وتظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري لستة وإنشاء نسخ متماثلة (2 البيولوجية، التقنية الثلاثة كل). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

فDC-جوكس في وقت زراعة ح 160 OD600 المجلد النشاط [U/mL] المبلغ الإجمالي للبروتين يفرز [مغ/مل] النشاط الحجمي لكل خلية الكثافة
يعني التنمية المستدامة يعني التنمية المستدامة يعني التنمية المستدامة يعني
دفعة % BMD1 + والغليسيرول النبض 74.6 2 8.4 2.4 0.21 0.01 0.11
دفعة % BMD1 + والغليسيرول مستمر تغذية 32.5 0.3 9.4 0.7 0.09 0.01 0.29
دفعة % BMD1 18.8 0.6 3.7 0.7 0.01 0 0.2

الجدول 1: نتائج الميثانول التعبير جوكس مستقلة تحت سيطرة المروج مكبوتة دي فالعاصمة .

Discussion

ويعرض هذا الأسلوب بروتوكول موثوقة الميثانول كفاءة التعبير إيندوسيبلي المستقلة قبل بسطورس P. كبديل للتعبير البروتين الميثانول الكلاسيكية التي يسببها يقودها فAOX112. بناء المروجين دي ريبريسيبلي، مثل فالعاصمة، فمدافع أو سبق وصفها تحور فAOX1 المتغيرات17، الأساس الجزيئي لهذا المفهوم الجديد لإنتاج البروتين. أظهرت نتائج الممثل يؤكد فائدة والطابع العملي للتعبير البروتين المؤتلف في بسطورس P. المروجين مكبوتة الشطب والفرز الصغيرة مع رصد بسيطة على الإنترنت. من ناحية، يمكن القضاء على الميثانول السامة والضارة التي تستخدم عادة لاستحثاث المروج AOX1 من الزراعة. من ناحية أخرى، هي مرحلة إنتاج البروتين والنمو أونكوبليد9 على النقيض من البروتين التأسيسي التعبير، على سبيل المثال-، مع استخداماً فالفجوة. وهذا مفيد بوجه خاص عندما ينبغي أن تعبر عن الخلايا البروتينات السامة أو الضارة التي تعرض عبئا عليهم.

يتيح إمكانية البدء الزراعات بتركيزات مختلفة من الكربون مصدر قرار الكتلة الحيوية كم يود المرء أن كسب قبل مرحلة إنتاج البروتين يبدأ. عند اختيار تركيز مصدر الكربون أقل في المجموعة، يمكن تخفيض القيود نقل الأكسجين بسبب كثافة الخلية مرتفعة جداً رغم كثافة الخلية أعلى من ناحية أخرى يمكن أن يؤدي أيضا إلى أعلى بروتين التتر. نقطة الوقت الأمثل لبدء دفعة بنك الاحتياطي الفيدرالي برصد تطور الثقافة من حيث توليد طاقة الكتلة الأحيائية وتركيزات الأكسجين، يمكن أن تتقرر بسهولة كما هو مبين في الشكل 1.

للرصد على الإنترنت لمعلمات زراعة هذه، ينبغي أن تطبق نظام قياس مناسبة. الكتلة الحيوية (مثلاً، فاريو فرنك سويسري) جهاز قياس بسيطة وزعزعة نظام القياس الاقتصادي على شبكة الإنترنت لرصد الثقافة في قوارير. القارئ البصرية الإلكترونية يحدد نمو الخلايا في قارورة عبر الكشف عن الضوء المتناثرة ويقرأ إشارة من الأكسجين الاستشعار المتكاملة في قارورة. البصريات لقياس الكتلة تتكون من مصباح LED التي تنبعث إشارة خفيفة، وهي متناثرة في جزيئات (الخلايا) في المرق الثقافة واكتشاف مع الضوئي. أجهزة الاستشعار البصرية تنبعث منها الأسفار عندما متحمس مع ضوء من طول موجه معينة. اعتماداً على حجم الجزيئات أكثر الحالية، يتغير هذا إشارة الأسفار، التي يتم الكشف عنها بواسطة البصريات القارئ وترجمتها إلى قيم تركيز. ومع ذلك، قد معايرة قياس كثافة خلية تكون المنشأة مسبقاً، نظراً لنظام القياس هو قياس لا OD600 القيم الفعلية. ويمكن حساب معدل امتصاص الأكسجين من انحدار منحنى الأكسجين مع برنامج قارئ، ويتم تسجيل درجة الحرارة، فضلا عن دورة في الدقيقة بشكل مستمر جنبا إلى جنب مع معلمات أخرى. لتمكين مراقبة مع هذا النظام، أن قوارير يهز سابقا تكون مزودة بأجهزة استشعار مناسبة للمعلمات المطلوبة.

بإضافة البوليمر بطيئة--الإفراج عن أربعة أقراص توفير كمية ثابتة من الجلسرين إلى مرق الثقافة، هو تراكم الكتلة الحيوية توقفت تقريبا، واستمر إنتاج البروتين المؤتلف. تحديد النقطة الزمنية إضافة تغذية القرص ليس خطوة حاسمة في هذه التجربة، بل أنه ينبغي النظر في تثبيط بدء تغذية سابق لأوانه قبل مرحلة النمو الأسى يمكن تفعيل مروج التعبير يبدأ عند نضوب مصدر الكربون. بالإضافة إلى ذلك، قد خفضت مجموع الوقت نظراً لمحدودية القدرات البوليمر التغذية، بينما يؤخر في التغذية بعد الخلايا وقد وصلت إلى مرحلة ثابتة يمكن أن تؤدي إلى تجويع وتدهور إنتاجها بالفعل البروتين. وكان تحديد مقدار تغذية الأقراص المستخدمة في هذا البروتوكول تجريبيا للإفراج عن مصدر الكربون الأمثل للحفاظ على المروج الشطب للقمع أثناء الضغط على الكتلة الأحيائية جيل منخفضة (البيانات لا تظهر). وبهذه الطريقة، يمكن أن تكون الزراعات يؤديها بسهولة أكثر من 160-180 ح دون أي تدخل.

التطبيقات الرئيسية لهذا البروتوكول الجديد سيكون في استنساخ تعبير الفرز والتطور الإنزيم والاكتشاف، وتوصيف والهندسة من المروجين جديدة تستخدم بروتوكول زراعة خالية من الميثانول في ظروف المراقبة جيدا. من حيث المبدأ، ينبغي أن يكون البروتوكول نفسه ينطبق على استراتيجيات تغذية مختلطة يستخدم الميثانول ويغذي مصدر الكربون معفن محدودة مثل وصف بانولا-Perälä وآخرون. في18من عام 2014.

Disclosures

على الرغم من أن البروتوكول قدم تنطبق بصورة عامة لزراعة وتحريض تحت ظروف ديريبريسيد، يعلن الاتحاد الأوروبي بيسي مصلحة في تسويق المروجين ديريبريسيد الجديدة المستخدمة في هذه الدراسة.

Acknowledgments

روبكس يتلقى التمويل من مشروع "الاتحاد الأوروبي" (EU) روبكس (منحة اتفاق n ° 635734) تحت أفق 2020 برنامج البحوث والابتكار في الاتحاد الأوروبي إجراءات "أفق 2020"-ليت بيو-2014-1. وجهات النظر والآراء التي أعرب عنها هنا هي فقط تلك التي المؤلف، ولا تعكس بالضرورة آراء الوكالة بحوث الاتحاد الأوروبي. أن الاتحاد الأوروبي ليس مسؤولاً عن أي استخدام قد أدلى بالمعلومات الواردة في هذه الوثيقة.

ويشترك في تمويل أطروحة دكتوراه ج. فيشر بمنحه ل "إيندوستريناهي أطروحة" وكالة "التمويل النمساوية" فج.

ونحن نشكر جيرنوت جون (بريسنس GmbH) لإجراء مناقشات مفيدة ومدخلات قيمة لمشروع المخطوطات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Yeast Extract BD Biosciences 212720
Baffled Flask 250 mL DWK Life Science 212833655
BBL Phytone Peptone BD Biosciences 298147
BioPhotometer Eppendorf AG 5500-200-10
Certoclav-EL CertoClav GmbH 9.842 014
Difco Yeast nitrogen base w/o amino acids BD Biosciences 291920
Feed discs glycerol Adolf Kuhner AG 315060
Glucose-monohydrate Carl Roth GmbH + Co. KG 6887
Glycerol ≥98 % Carl Roth GmbH + Co. KG 3783
K2HPO4 Carl Roth GmbH + Co. KG 6875
KH2PO4 Carl Roth GmbH + Co. KG 3904
Multitron Standard  Infors AG 444-4226
SFR Vario v2 PreSens GmbH 200001689

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bill, R. M. Playing catch-up with escherichia coli: Using yeast to increase success rates in recombinant protein production experiments. Frontiers in Microbiology. 5, (MAR), 1-5 (2005).
  2. Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. Recombinant Protein Expression in Pichia pastoris). Molecular Biotechnology. 16, 23-52 (2000).
  3. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
  4. Vogl, T., Kickenweiz, T., Sturmberger, L., Glieder, A. Bidirectional Promoter. US patent. 20150011407 (2005).
  5. Vogl, T., Glieder, A. Regulation of Pichia pastoris promoters and its consequences for protein production. New Biotechnology. 30, (4), 385-404 (2013).
  6. Rußmayer, H., et al. Systems-level organization of yeast methylotrophic lifestyle. BMC Biology. 13, (1), 80 (2015).
  7. Sakai, Y., Yurimoto, H., Matsuo, H., Kato, N. Regulation of peroxisomal proteins and organelle proliferation by multiple carbon sources in the methylotrophic yeast, Candida boidinii. Yeast. 14, (13), 1175-1187 (1998).
  8. Hartner, F. S., Glieder, A. Regulation of methanol utilisation pathway genes in yeasts. Microbial Cell Factories. 5, 39 (2006).
  9. Vogl, T., et al. A Toolbox of Diverse Promoters Related to Methanol Utilization: Functionally Verified Parts for Heterologous Pathway Expression in Pichia pastoris. ACS Synthetic Biology. 5, (2), 172-186 (2016).
  10. Mellitzer, A., Weis, R., Glieder, A., Flicker, K. Expression of lignocellulolytic enzymes in Pichia pastoris. Microbial Cell Factories. 11, (1), 61 (2012).
  11. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22, (4), 249-270 (2005).
  12. Weis, R., Luiten, R., Skranc, W., Schwab, H., Wubbolts, M., Glieder, A. Reliable high-throughput screening with Pichia pastoris by limiting yeast cell death phenomena. FEMS Yeast Research. 5, (2), 179-189 (2004).
  13. Ukkonen, K. Improvement of Recombinant Protein Production in Shaken Cultures. Acta University Oulu C 480 (2014).
  14. Jeude, M., et al. Fed-batch mode in shake flasks by slow-release technique. Biotechnology and Bioengineering. 95, 433-445 (2006).
  15. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  16. Smith, B. J. SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Methods in molecular biology. 1, 41-55 (1984).
  17. Hartner, F. S., et al. Promoter Library Designed for Fine-Tuned Gene Expression in Pichia Pastoris. Nucleic Acids Research. 36, (12), e76 (2008).
  18. Panula-Perälä, J., Vasala, A., Karhunen, J., Ojamo, H., Neubauer, P., Mursula, A. Small-scale slow glucose feed cultivation of Pichia pastoris without repression of AOX1 promoter: towards high throughput cultivations. Bioprocess and Biosystems Engineering. 37, (7), 1261-1269 (2014).
التعبير المستقلة الميثانول <em>بسطورس بيشيا</em> تستخدم تكنولوجيات إزالة القمع
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fischer, J. E., Hatzl, A. M., Weninger, A., Schmid, C., Glieder, A. Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies. J. Vis. Exp. (143), e58589, doi:10.3791/58589 (2019).More

Fischer, J. E., Hatzl, A. M., Weninger, A., Schmid, C., Glieder, A. Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies. J. Vis. Exp. (143), e58589, doi:10.3791/58589 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter