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Bioengineering

多夏巴氏杆菌自主表达采用除抑制技术

doi: 10.3791/58589 Published: January 23, 2019

Summary

该方法首次介绍了在毕赤酵母 (komagataella phaffii)高效诱导无甲醇重组蛋白生产的可靠实验程序, 并采用了碳源调节启动子 p dc和 pdf 在小规模试验中, 在可在线监测培养参数的同时, 可采用恒定的甘油饲料。

Abstract

甲醇是一种成熟的碳源, 是利用毕赤酵母(p. pastoris) 作为微、实验室和工业规模的宿主的高效蛋白质生产的诱导剂。然而, 由于甲醇的毒性和易燃性, 人们希望在保持高生产率的同时避免甲醇的生产。小型生物反应器的栽培 (0.5-5l 工作体积) 通常用于评价菌株及其蛋白质生产特性, 因为深井板的微规模栽培很难控制或依赖昂贵的设备。此外, 还建立了传统的牧草培养和诱导方案, 用于本构表达或甲醇诱导, 目前还没有描述出筛选牧草表达的可靠协议。在平行栽培中具有无可抑制启动子的菌株。为了简化这种初始培养, 以表征和比较新的蛋白质生产菌株, 我们建立了一个简单的奶瓶培养系统, 用于甲醇自由表达, 模拟生物反应器条件, 包括持续缓慢的甘油饲料与在线监测相比, 生物反应器的实际情况更接近于小批量生产。为促进巴氏重组蛋白的表达, 采用碳源抑制启动子p dc pdf 。嵌入碳源的聚合物圆盘, 释放出恒定数量的甘油, 保证了饲料速率, 为保持启动子的活性提供了必要的能量, 同时保持了生物量的低产生。

Introduction

细菌或酵母等微生物生产重组蛋白的产量提高和大规模可靠栽培条件是当今生物技术1的主要需求之一, 也是工业的商业成功应用。双原简单的栽培工艺和培养基, 高产和良好的特点工具 2 毕赤酵母 (komagataella phaffii)是一种广泛使用的非常规酵母重组蛋白生产。还为这一物种不断开发其他创新工具, 如新的表达载体, 包括新的启动子, 作为广泛使用的paox1的替代品, 酒精氧化酶1基因3的启动子区域, 4,5在 cat1 (cta1) 基因的上游, 一个 500 bp 长的 dna 序列被确定为启动子区域, 这使得一种新的无甲烷和多功能表达策略在p.pastoris。cat1基因是巴氏唯一的过氧化氢酶基因, 蛋白质位于过氧化物酶体中。过氧化氢酶在活性氧的解毒过程中起着重要作用,活性氧是由过氧化物率 mut 途径中的甲醇氧化或脂肪酸 6,7的β氧化而产生的。在培养基中葡萄糖或甘油的出现中抑制了 cat1 基因的表达, 并在这些碳源枯竭时抑制了 8. 此外, 过氧化氢酶基因的表达可以诱导甲醇和再加工油酸, 似乎是唯一的基因, 可以诱导与油的 pic mut 途径, 甚至达到类似的表达水平甲醇感应9

这个p. pastoris cat1启动子的 500 bp 片段, 被称为p dc (有时也缩写 pcat1-500), 已经被测试为生产内部表达和分泌的蛋白质, 它被证明是一个有吸引力的替代两个经典的p.巴斯普促进剂-强本构 p gap 和甲醇诱导 paox1,这是20多年前开发的。与富糖培养基中的 pgap相比, pdc的体积活性达到 21% (calb) 和 35% (hrp)。在甲醇诱导时, pdc的响应速度不仅快于 paox1, 而且最终滴度明显优于 p aox1.

除了 pdc外, 还发现了一个具有类似调节特征的正交启动子 (pdf)。然而, 它明显强于 p 直流在脱色下, 以及在甲醇诱导的条件下 (手稿在准备)3

在强的本构 pgap失败的情况下, 由于生理上有问题或细胞毒性的蛋白质10,11, pdc和 pdf代表了一个理想的选择。在微观规模的实验中, 这些启动子驱动的表达式始于初始碳源 (葡萄糖或甘油) 耗尽后, 这有助于生物质的生产, 而不会给细胞带来过度表达的负担。重组蛋白从一开始就开始。虽然这两个启动子仍然是由甲醇诱导, 但与使用 paox1 的表达式相比, 通过去抑制激活使诱导前阶段有更多的用途。此外, pdc和 pdf可用于无甲醇蛋白生产, 这是大型工业工艺12的理想目标。

为了开发适用的生产应变和表达式构造, 必须通过几个步骤来实现开发, 以便从大量的转换缩小到扩展的首选转换。屏幕通常在多井板 (微尺度: 小于 0.5 ml) 中的高吞吐量下执行, 以便捕获尽可能大的克隆范围。随后的重新筛选和重新筛选是下一步, 其次是摇瓶 (小规模: 50-250 毫升) 或 (微) 生物反应器筛选12。然而, 它是理想的方法, 这是最相似的不同的尺度之间从数百微升在深井板到几毫升的摇瓶, 以后来扩大的无甲醇生产在良好的控制生物 反应器。虽然摇瓶可以提供已经类似的体积作为小型生物反应器, 有几个限制, 这是高度相关的大规模蛋白质生产, 如不断喂养, 曝气和在线监测13的生长和供氧。采用适应摇瓶和摇瓶装置的光学监测为平行种植提供了更先进的设备, 同时仍提供有关主要文化参数的持续在线信息, 如生物质和溶解氧浓度。聚合物载体的碳源缓慢释放可用于确保恒定和可控进料, 而无需依赖复杂的技术解决方案和设备, 模拟比以前应用的简单充分生物反应器更相似的条件碳源9,10的消耗, 其中持续蛋白质表达的能量变得有限。

本文介绍了一种基于新的促进pdc和 pdf 的中、小型无甲烷可控蛋白表达系统.通过去镇压诱导涉及两个阶段。在没有产生感兴趣的蛋白质的情况下积累生物量的第一个短阶段, 使用抑制启动子的碳源和目标蛋白质生产的第二阶段, 其中碳源的浓度很小, 但不变保持启动子的压力。在整个栽培过程中, 对最关键的栽培参数进行了在线监测。目标是为p. pastoris提供一个免费、可靠和可扩展的甲醇栽培系统。

Protocol

1. 媒体准备

  1. 缓冲最小介质 (bmg 与甘油, bmd 与葡萄糖作为碳源) 准备 (1 l)
    1. 高压灭菌器650毫升的蒸馏水在1升螺帽玻璃瓶中。冷却后, 加入100毫升的蒸压 10x ynb (134 gl 酵母氮基)、200毫升磷酸钾缓冲液 (1 m, ph 6)、30-100 毫升的 10% wv 或甘油 (取决于所需产生的生物量量), 从而完成培养基。在批量生产过程中), 2 毫升的无菌 500 x 生物素 (10 mg/ml) 溶液, 并在1升与无菌蒸馏水填充。
      注意: 所有原料必须用单独的烧瓶高压灭菌。生物素在高压灭菌时被破坏, 因此必须用0.2μm 膜过滤器进行过滤。
  2. 缓冲富媒体 (bbpg) (1 升)
    1. 1升螺旋瓶盖中的蒸馏水700毫升, 含1% 的 wv 酵母提取物和2% 的聚酮。冷却后, 加入30-100 毫升的单独蒸压 10% wv 甘油, 200 毫升磷酸钾缓冲液 (1 m, ph 值 6), 并在1升中加入无菌蒸馏水。

2. 摇瓶准备

  1. 在250毫升的令人困惑的摇瓶中加入5毫升的蒸馏水, 用两层棉布覆盖, 并用橡皮筋固定在适当的地方。用一块铝箔把布盖上。
  2. 在121°c 下对烧瓶进行高压灭菌 20分钟, 以便进行完全灭菌。
  3. 从烧瓶中取出残留的水, 并将先前准备好的介质的500毫升取出到每个烧瓶中。

3. 隔夜文化接种

  1. 在50毫升离心管中, 用所需表达株的单个新鲜菌落 (1% w/v 酵母提取物, 2% wpptone, 2% wppv 葡萄糖) 开始隔夜培养 (onc), 同时使盖子稍微开放, 以便进行适当的曝气。
  2. 让它在28°c、80% 湿度的情况下在100-130 转/分 (2.5 厘米晃动直径2.5 厘米的晃动直径) 的振动台中夜间生长。

4. 计量设置与主要文化培育

  1. 要设置在线监控系统, 请按照制造商的说明对设备进行适当校准。
  2. 放置计算机, 其中安装了相应的监视软件, 以便蓝牙连接到测量站。启动软件, 通过蓝牙连接设备。
    1. 按下前面的银色按钮, 打开生物量测量设备上的蓝牙连接。
    2. 在软件中, 单击 "设备" , 然后单击 "查找设备"
      注意: 设备应显示为任务行下方窗口中的列表。如果没有, 建议检查电池是否已充电, 并且计算机是否可以连接蓝牙连接。
    3. 将找到的设备拖放到屏幕测量纸盒右侧的正方形。
    4. 单击 "连接"
      注意: 连接成功时, 将显示一个控制屏幕。
    5. 要开始蓝牙连接的测试运行, 请单击 "测量"
    6. 设置实验。
      1. 单击"开始测量", 命名实验并启用监视所需的所有参数。
        注意: 每个可能的测量参数都需要许可证。
      2. 间隔设置为3分钟。
        注意: 间隔决定测量点的拍摄频率, 并且每个测量点之后产生一个值。测量每分钟是非常准确的, 但大量的数据产生, 这使得它更费力地进行评估。
      3. 将平均测量点设置为11。
        注意: 此设置确定每3分钟实际拍摄多少个测量点。因此, 输出是11个测量点超过11秒的平均值。
      4. 输入示例的名称。
      5. 跳过下一个屏幕, 因为角度之前已经校准过 (步骤 4.1)。
        注意: 建议在接种主培养器之前对蓝牙连接进行测试运行, 以确保连接的计算机的稳定连接和适当位置。另外, 电池还必须充电。
  3. 在600纳米波长的分光光度计中测量在培养介质 (1:20) 中稀释的 onc (步骤 3.1) 的细胞密度。通过使用以下计算, 将50毫升的介质 (建议碳源浓度 0.3-1%, 不同的介质可能与 onc 一起接种到0.05 中的 od 600.
    Equation 1
  4. 将烧瓶放入检测器中, 在28°c、130转/分和80% 湿度下摇晃。
    注意: 在开始测量之前给培养物5分钟的晃动是非常重要的, 以避免细胞粘在烧瓶底部并产生错误的值。
  5. 单击软件中的"开始测量"
  6. 接种4小时后, 当碳源耗尽 (步骤4.7 中描述的测定) 时, 以 0.2 ml 样品进行细胞密度测量。在培养基中适当稀释样品 (第一次测量 1: 5, 第二次测量 1:20), 并在分光光度计中测量600纳米波长的吸收。在卸下烧瓶之前, 甚至在停止振动台之前, 请始终暂停软件中的测量。
    注: 探测器经过校准, 以便在规定的晃动条件下记录参数, 并在记录静止培养物时屈服于无稽之谈测量。此外, 请确保始终等待5分钟的晃动, 然后再开始测量。细胞密度测量是必不可少的, 因为探测器提供的是生物量的一致值, 而不是真正的细胞密度。通过测量多个时间点分光光度法, 可以实现 od 600 值 (x 值) 与在线测量系统获得的值 (y 值) 之间的校准功能。根据以下校准函数, 这些值不是线性的, 而是对数关系中的值:
    Equation 2
    y: 通过分光光度计获得的 od600
    x: 通过在线测量系统获得的值
    k: 坡度
    d: 轴截距
    然后, 斜率和轴截距可用于将任何值转换为相应的 od600值。在 excel 中, 可以根据来自同一时间点的在线系统的值绘制分光光度法获得的 od600值。对数趋势线的加入和相应的方程将给出上述校准函数。
  7. 培养到碳源接近耗尽 (应用 12-20)。为此目的, 让培养物生长, 直到从软件图中可以看到氧气浓度接近于零, 细胞处于指数增长阶段。
    注: 本协议中使用的碳源浓度就是这种情况。碳源耗尽的时间点可以用在线监测系统来确定, 如 "代表性结果" 部分的图 1所示, 当氧气水平接近零时, 细胞处于指数级增长状态时相。

5. 去抑制蛋白的表达

  1. 当达到步骤4.6 中描述的时间点时, 在无菌条件下, 通过在每个烧瓶中添加四个进料盘, 开始为培养物提供食物。
    注: 在所述条件下, 四个甘油饲料盘释放 2 mgh 甘油根据制造商。
  2. 继续进行60-90小时的培养, 每24小时采集一次样本, 通过选择的检测方法 (例如, bradford 检测15、sds page page 16 或活性检测 ) 和细胞密度测量来监测蛋白质表达。

6. 文化收获

  1. 在 60 ~ 90小时的培养后, 用50毫升的离心管将培养物灌满, 以 4, 000 x 克、4°c 的离心离心服进行10分钟的收获。
    注: 上清液 (用于分泌蛋白) 或细胞 (用于细胞内蛋白表达) 可通过离心在 4, 000 x g, 4°c 下收获 10分钟, 并可进行进一步的分析。
  2. 将在线测量数据导出为电子表格文件, 从软件中进行进一步分析。
  3. 将5-10 毫升的蒸馏水灌满所有烧瓶和高压灭菌器, 使剩余的细胞失活。

Representative Results

如协议部分所述, 软件记录了整个栽培过程中的重要栽培参数。图 1显示了在种植过程中生物量发展和氧气浓度的可视化, 种植开始时, 批次中的碳源为 0.5% (图1B) 或 0.3% (图 1b), 然后添加甘油饲料盘。在线监测系统对于去压抑的耕作特别有用, 因为在批次准确确定碳源枯竭的时间点之后, 可以准确地确定碳源枯竭的时间点。如图 1所示, 介质中的氧气浓度正在迅速下降并接近零, 特别是在批次中0.5% 的甘油 (图 1a) 中, 而此时生物量呈指数级增长。在这里, 细胞处于指数增长阶段, 为了最佳利用碳源释放, 在培养达到固定阶段前不久, 应按照协议中的描述添加进料盘。在氧浓度达到零之前添加进料盘, 对抑制蛋白质表达有重要意义, 可以防止细胞缺氧。较低的甘油浓度降低了短期氧气限制的影响, 因为它可以在图 1 b 中看到, 因此建议用于去抑制蛋白的表达。

下面介绍了两个不同的种植实验的结果--使用所描述的协议和图1所示的监控系统。在第一个实验中, 在 pdc的控制下,一种从黑曲霉 ( a. niger) 中产生葡萄糖氧化酶的 p. 基巴氏菌株, 在第二个实验中, 一种产生人类生长激素的 p. 基巴氏菌株在 pdf的控制下显示。

本实验研究了p直流控制下葡萄糖氧化酶的产生情况。因此, 比较了不同的栽培策略: 甘油脉动, 通过添加饲料盘不断的甘油饲料和没有任何饲料或脉冲的培养。该培养是在50毫升缓冲的最小介质中进行的, 在250毫升摇瓶中, 以0.5% 的葡萄糖为唯一碳源 (表 1)。

在160小时的种植时, 获得了最高的生物量浓度, 使用葡萄糖批次进行生物量生产 (38小时) 和甘油脉冲 (培养基为 0.21 w? v 甘油, 在38小时、61 h 和86小时栽培后) 采用了喂养策略 (0.21 g\ l 总分泌量为 0.21 g\ l蛋白质, 8.4 u/ml)。虽然生物量浓度和分泌蛋白总量减少了 2倍, 但在38h 葡萄糖批次后添加饲料盘时, 体积活性甚至比使用甘油脉冲的培养高出 1 uml.这表明大量的分泌蛋白不会导致上清液中的体积活动, 并可能以不活跃的形式分泌。因此, 较高的甘油脉冲的甘油浓度似乎有利于生物质的形成, 而不是目标蛋白的生产和不断低的甘油释放导致了两倍以上的具体生产力。

另一个采用去抑制表达法的实验是在pdf的控制下表达人生长激素 (hgh)。该结构稳定地整合到p. pastoris 菌株 bsybg11 的基因组中。在这里, 50 毫升的 bypg, 缓冲丰富的介质, 在250毫升的困惑的摇瓶使用 0.3% (w/v) 甘油作为碳源的批次。在甘油耗尽时, 每瓶添加4个饲料盘, 与无甘油饲料相比, 确保了持续甘油饲料的蛋白质表达 (图 2)。

图 2显示了 hgh 表达与同一菌株的生物量发育的比较, 该菌株有和没有恒定的甘油饲料。采用夹层 elisa 与 hp 融合的二级抗体相结合, 并以3、3'、5、5 '-四甲基苯胺 (tmb) 为底物进行了检测。特别是对于这种蛋白质, 它似乎是这样的情况下, 没有任何喂养, 细胞开始降解产生的蛋白质大约30小时后 (浅蓝色方块), 而通过喂养, 这种降解是可以防止的 (深蓝色三角形), 甚至经过15小时的培养, 每生物量的蛋白质浓度仍在增加。正如已经观察到的 husenula 多态性14, 这个结果显示了如何切换从批次, 像它通常用于摇瓶规模, 到饲料批处理模式可以优化p.草的培育。

Figure 1
图 1: 在该批次中具有不同甘油浓度的两个耕作过程中在线记录的参数的可视化.在该批次中, 以0.5% 的 w/v (a) 和0.3% 的 w/v (b) 甘油开始培养, 然后是通过每瓶应用4个进料盘喂养细胞的去抑制阶段 (根据制造商的说法, 释放率为 0.5 mg h果/。虚线显示介质中的氧浓度, 而连续线显示细胞密度 (od600)。误差条显示6个副本的标准偏差 (2个生物, 3个技术值)。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 人类生长激素 (hgh) 在批处理和饲料批次模式下表达的比较.hgh 含量由 405 nm 的吸收值通过 elisa 表示, 其中第2抗体为 hrp 融合, tmb 作为检测的底物。显示两种不同培养物的结果: 浅蓝色线和正方形显示细胞密度和 hgh 浓度, 由培养物的细胞密度归一化, 而不是在批次后没有任何饲料, 与一种培养物相比, 甘油饲料盘是(深蓝色线条和三角形)。误差条显示6个副本的标准偏差 (2个生物, 3个技术值)。请点击这里查看此图的较大版本.

下午160 小时的 p dc-gox od600 活动 [u/ml] 分泌蛋白的总量 [mg/ml] 每个细胞密度的体积活动
意味 着 Sd 意味 着 Sd 意味 着 Sd 意味 着
bmd1% 批次 + 甘油脉冲 74。6 2 8。8 2。4 0.21 0.01 0.11
bmd1% 批次 + 恒定甘油进料 32。5 0。3 9。8 0。7 0.09 0.01 0.29
bmd1% 批次 18。8 0。6 3。7 0。7 0.01 0 0。2

表 1: 在减压启动子控制下甲醇独立 gox 表达的结果 P直流.

Discussion

该方法为 p . pastoris 的高效甲醇独立诱导表达提供了一种可靠的协议, 以替代paox112 驱动的经典甲醇诱导蛋白表达。去可抑制启动子, 如 pdc, pdf或前面描述的突变paox1 变种 17, 建立了这个新的蛋白质生产概念的分子基础。有代表性的结果表明, 通过去抑制启动子和小规模筛选, 并进行简单的在线监测, 在p.越碎中表达重组蛋白的有效性和实用性。一方面, 通常用于诱导aox1 启动子的有害和有毒甲醇可以从培养中消除。另一方面, 生长和蛋白质生产阶段与本构蛋白表达相比, 与常用的pgap不同. 当细胞表达有毒或有害的蛋白质, 为它们带来负担时, 这一点尤其有益。

在蛋白质生产阶段开始之前, 以不同碳源浓度开始种植的可能性使人们能够决定希望获得多少生物质。在批次中选择较低的碳源浓度时, 由于细胞密度过高而产生的氧转移限制可以降低, 而另一方面, 较高的细胞密度也会导致较高的蛋白质滴度。通过从生物质生成和氧浓度的角度监测培养发育情况, 可以很容易地确定 fed-batch 启动的最佳时间点, 如图 1所示。

对于这些种植参数的在线监测, 应采用适当的测量系统。生物量测量装置 (sfr vario) 是一种简单而经济的在线测量系统, 用于摇瓶中的培养监测。光电读取器通过散射光检测来确定烧瓶中的细胞生长, 并读出集成在烧瓶中的氧传感器的信号。生物量测量的光学元件由发光信号组成, 发光信号由培养液中的颗粒 (细胞) 散射, 并用光电二极管检测。光学传感器在被某波长的光激发时发出荧光。根据存在的分析物分子的数量, 这种荧光信号会发生变化, 这是由读取器光学检测并转化为浓度值。但是, 必须事先建立电池密度测量校准, 因为测量系统没有测量实际的 od600值。利用读卡器软件可以从氧曲线的斜率计算氧的吸收率, 温度和转速与其他参数一起连续记录。为了能够使用此系统进行监视, 摇瓶必须事先配备相应的传感器以满足所需的参数。

通过加入四个缓释聚合物圆盘, 为培养液提供恒定数量的甘油, 生物量积累几乎停止, 重组蛋白的生产继续进行。在这个实验中, 饲料盘加成时间点的确定并不是一个关键的步骤, 但应该考虑到, 在指数增长阶段之前, 过早的进给开始可能会随着表达的开始而抑制启动子的激活。碳源耗尽。此外, 由于聚合物容量限制, 总喂养时间可能会减少, 而在细胞到达固定阶段后推迟喂养可能会导致饥饿和已经产生的蛋白质降解。实验确定了该协议中使用的进料盘的数量, 以获得最佳的碳源释放, 从而在保持生物量生成较低的同时保持启动子的抑制 (数据未显示)。通过这种方式, 可以轻松地进行160至180分钟以上的耕种, 无需任何干预。

这一新协议的主要应用将是表达克隆筛选, 酶进化和发现, 定性和工程的新促进剂使用无甲烷培养协议在良好的监测条件下。原则上, 同样的协议应适用于采用甲醇和有限发酵碳源饲料的混合进料策略, 如 panula-perälää等人所述。在 2014年18

Disclosures

虽然所提出的协议一般适用于在无压条件下的培养和诱导, 但 bisy e. u. 声明对本研究中使用的新的按下促进剂的商业化感兴趣。

Acknowledgments

robox 在欧盟 "地平线 2020" 方案研究和创新行动 h2020-leit bio-1 下获得了欧盟 (欧盟) 项目 robox (授权协议 n.635734) 的资助。本文所表达的观点和意见只是作者的观点和意见, 不一定反映欧洲联盟研究机构的观点和意见。欧洲联盟对可能对此处包含的信息进行的任何使用概不负责。

j. fischer 的博士论文由奥地利资助机构 ffg 的 "工业论文" 资助。

我们感谢 gernot john (presens gmbh) 对手稿草稿的有益讨论和宝贵投入。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Yeast Extract BD Biosciences 212720
Baffled Flask 250 mL DWK Life Science 212833655
BBL Phytone Peptone BD Biosciences 298147
BioPhotometer Eppendorf AG 5500-200-10
Certoclav-EL CertoClav GmbH 9.842 014
Difco Yeast nitrogen base w/o amino acids BD Biosciences 291920
Feed discs glycerol Adolf Kuhner AG 315060
Glucose-monohydrate Carl Roth GmbH + Co. KG 6887
Glycerol ≥98 % Carl Roth GmbH + Co. KG 3783
K2HPO4 Carl Roth GmbH + Co. KG 6875
KH2PO4 Carl Roth GmbH + Co. KG 3904
Multitron Standard  Infors AG 444-4226
SFR Vario v2 PreSens GmbH 200001689

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References

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<em>多夏巴氏杆菌</em>自主表达采用除抑制技术
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Fischer, J. E., Hatzl, A. M., Weninger, A., Schmid, C., Glieder, A. Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies. J. Vis. Exp. (143), e58589, doi:10.3791/58589 (2019).More

Fischer, J. E., Hatzl, A. M., Weninger, A., Schmid, C., Glieder, A. Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies. J. Vis. Exp. (143), e58589, doi:10.3791/58589 (2019).

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