Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Metanol oberoende uttryck av Pichia Pastoris sysselsätter de förtryck teknik

doi: 10.3791/58589 Published: January 23, 2019

Summary

Denna metod för första gången beskriver tillförlitlig experimentella rutiner för effektiv inducerbara metanol-fri rekombinant proteinproduktion i Pichia pastoris (Komagataella phaffii), sysselsätter kol källa reglerade initiativtagarna P DCoch PDF i liten skala experiment samtidigt odling kan parametrar övervakas online, och ett konstant glycerol foder används.

Abstract

Metanol är en väletablerad kolkälla och inducerare för effektiv proteinproduktion sysselsätter Pichia pastoris (P. pastoris) som värd på mikro-, lab och industriell skala. Dock på grund av dess toxicitet och brännbarhet finns det en önskan att undvika metanol bibehållen P. pastorishöga produktivitet. Liten skala bioreaktor odlingar (0,5-5 L arbetar volym) är vanligen används för att utvärdera en stam och dess protein produktion egenskaper eftersom hur provtagningsutrustningen skall odling i djupt plattor knappast kan styras eller förlitar sig på dyr utrustning. Dessutom fastställdes traditionella protokoll för odling och induktion av P. pastoris för konstitutiva uttryck eller metanol induktion och hittills inga tillförlitliga protokoll beskrevs att skärmen P. pastoris uttryck stammar med derepressible initiativtagare i (kontrollerade och övervakade) parallella odlingar. För att förenkla sådana inledande odlingar för att karakterisera och jämföra nya protein produktion stammar, etablerat vi ett enkla skaka kolven odling system för metanol yttrandefrihet som simulerar bioreaktor villkor inklusive en konstant långsam glycerol foder och online-övervakning, därmed kommer närmare till de verkliga förhållandena i bioreaktorer jämfört med mestadels tillämpad småskaliga batch odlingar. För att driva rekombinant proteinuttryck i P. pastoris, kolkälla förträngde initiativtagare PDC och PDF tillämpades. Polymer skivor med inbäddade kolkälla, släppa en konstant mängd glycerol, försäkrade en matningshastighet leverera nödvändig energi för att upprätthålla initiativtagarna aktiva samtidigt hålla den biomassa generationen låg.

Introduction

Förbättring av avkastning och pålitlig odling villkor i stor skala för rekombinant proteinproduktion av mikroorganismer såsom bakterier eller jäst är en av stora dagens bioteknik1 och kommersiell framgång för industriella behov applikationer. Dueto enkel odling förfaranden och medier, hög avkastning och väl karakteriserade verktyg2 Pichia pastoris (Komagataella phaffii) är en allmänt Använd icke-konventionell jäst för produktion av rekombinanta proteiner. Ytterligare innovativa verktyg utvecklas ständigt för denna art, liksom nya uttryck vektorer inklusive nya initiativtagare som alternativ till den utbredda PAOX1, promotor regionen av alkohol oxidas 1 gen3, 4,5. En 500 bp lång DNA-sekvens uppströms av CAT1 (CTA1) genen identifierades som promotor regionen, vilket gör att en ny strategi för metanol-fri och mångsidig uttryck i P. pastoris. CAT1 genen är den enda katalas-gen av P. pastoris och proteinet är beläget i peroxisomes. Katalas spelar en viktig roll i avgiftning av reaktiva syreradikaler, som uppstår, t.ex., från metanol oxidation i peroxisomal MUT väg eller under beta oxidation av fettsyror6,7. Uttrycket av genen CAT1 är förtryckta i prescence i glukos eller glycerol i odling medium och varaktigt blockeras vid utarmning av dessa kol källor8. Dessutom kan uttrycket av genen katalas induceras med metanol och remarkebly också med oljesyra, till synes vara den enda gen av P. pastoris MUT-vägen som kan induceras med oljesyra som även når liknande uttryck nivåer som med metanol induktion9.

Den 500 bp fragmentet av detta P. pastoris CAT1 arrangören, som kallas PDC (ibland även förkortat PCAT1-500), har redan testats för produktion av intracellulärt uttryckt och utsöndrade proteiner och det visade sig vara en attraktivt alternativ till två klassiska P. pastoris initiativtagare – stark konstituerande PGAP och metanol inducerbara PAOX1, som framkallades mer än 20 år sedan. PDC kunde nå 21% (CalB) och 35% (HRP) volymetrisk verksamhet jämfört med PGAP i socker rik medium. Vid metanol induktion, PDC svarade inte bara snabbare än de P-AOX1, men kunde också tydligt överträffa det med en 2,8 gånger högre slutliga titer för CalB9.

Förutom PDC, hade en orthologous arrangören (PDF) identifierats uppvisar en liknande förordning profil. Det är dock betydligt starkare än PDC under varaktigt blockeras samt under metanol-inducerad villkorar (manuskript i förberedelse)3.

I fall där stark konstituerande PGAP misslyckades på grund av fysiologiskt problematiska eller cytotoxiska proteiner10,11, utgör PDC och PDF ett perfekt alternativ. I mikroskala experiment, ett uttryck som drivs av dessa initiativtagare startar efter utarmning av den inledande kolkälla (t.ex., glukos eller glycerol), vilket underlättar produktionen av biomassa utan att belasta cellerna med överuttryck av rekombinanta proteinet rätt från början. Medan båda dessa initiativtagare är fortfarande inducerbara av metanol, aktivering av derepression gör ytterligare användning av den preinduction fasen jämfört med de uttryck som sysselsätter PAOX1. Dessutom kan den PDC och PDF användas för produktion av metanol-fri proteiner, som är ett önskvärt mål för stora industriella processer12.

För utvecklingen av tillämpliga produktion stammar och uttryck konstruktioner har flera steg i utvecklingen som ska skickas för att begränsa från ett stort antal transformants att de föredrog kandidaten för skala upp. Filmvisningar är vanligtvis utförs i hög genomströmning i plattor med flera (mikroskala: mindre än 0,5 mL) för att fånga en rad kloner så stor som möjligt. Efterföljande nytt screening och re-re-screening är nästa steg, följt av skaka kolven (liten skala: 50-250 mL) eller (mikro-) bioreaktor filmvisningar12. Det är dock önskvärt att ha en metod, som är mest likt mellan de olika skalorna från hundratals mikroliter i djupa brunnar upp till flera milliliter i skaka kolvarna upp till senare skala upp metanol-fri produktion i välkontrollerade bioreaktorer. Även om skaka kolvarna kan ge redan liknande volymer som små bioreaktorer, det finns flera begränsningar, som är mycket relevanta för storskalig produktion av proteiner som konstant utfodring, luftning och online-övervakning13 i tillväxt och syretillförsel. Optisk övervakning anställa anpassat skaka kolvarna och skakningar enheter ger ett kostnadseffektivt alternativ till mer sofistikerade utrustning för parallell odling samtidigt som konstant online information om större kultur parametrar såsom biomassa och koncentrationen upplöst syrgas. Långsam frisättning av kolkälla från polymer bärare kan användas för att säkra en konstant och kontrollerad matning utan förlitar sig på komplexa tekniska lösningar och enheter, simulera mer liknande användningsvillkor i bioreaktorer än det tidigare tillämpade enkel fullt utarmning av kol källa9,10, begränsande där energi för pågående proteinuttryck blir.

Följande metod beskriver en liten till medelstor skala metanol-fritt controllable proteinuttryck systemet i P. pastoris baserat på nya initiativtagarna PDC och PDF. Induktion av derepression omfattar två faser. En första kort stavelse arrangerar gradvis av biomassa ackumulering utan produktionen av proteinet av intresse, använda en kolkälla som förtrycker initiativtagarna och en andra fas av mål proteinproduktion, där en kolkälla levereras i liten men konstant koncentrationer att upprätthålla arrangören varaktigt blockeras. Online-övervakning av mest kritiska odling parametrar tillämpas under hela odlingen. Målet var att ge en metanol gratis, tillförlitlig och skalbar odling system för P. pastoris.

Protocol

1. Media förberedelse

  1. Buffrad minimal media (BMG med glycerol, BMD med dextros som kolkälla) förberedelse (1 L)
    1. Autoklav 650 mL destillerat vatten i en 1 L skruvlock glasflaska. Efter nedkylning, slutföra mediet genom att tillsätta 100 mL Ånghärdad 10 x YNB (134 g/L jäst kväve bas utan aminosyror), 200 mL kalium fosfatbuffert (1 M, pH 6), 30-100 mL 10% w/v glukos eller glycerol (beroende på önskad genererade biomassa under partiet), 2 mL steril 500 x lösning för Biotin (10 mg/mL) och fyll upp till 1 L med sterilt destillerat vatten.
      Obs: Alla ingredienser måste vara autoklaveras i separata behållare. Biotin förstörs när autoklaveras, och därför måste vara filter steriliseras med 0.2 µm membranfilter.
  2. Buffrad rik media (BYPG) (1 L)
    1. Autoklav 700 mL destillerat vatten med 1% w/v jäst extrakt och 2% w/v pepton i en 1 L skruvlock flaska. Efter nedkylning, tillsätt 30-100 mL separat Ånghärdad 10% w/v glycerol, 200 mL kalium fosfatbuffert (1 M, pH 6) och fyll upp till 1 L med sterilt destillerat vatten.

2. skaka kolvarna förberedelse

  1. Tillsätt 5 mL destillerat vatten i 250 mL förbryllad skaka kolvarna, täcka den med två lager av bomullstyg och fixa det på plats med gummiband. Täcka duken med en bit aluminiumfolie.
  2. Autoklav kolvar vid 121 ° C i 20 min för fullständig sterilisering.
  3. Ta bort restvatten från kolven och alikvotens 50 mL tidigare förberedda media till varje kolv.

3. övernattning kultur inympning

  1. Starta en övernattning kultur (ONC) med en enda färsk koloni av önskat uttryck stammen i 5 mL i en 50 mL centrifugrör YPD (1% w/v jästextrakt, 2% w/v pepton, 2% w/v glukos) samtidigt som den lämnar locket lite öppen och tillåter ordentlig luftning.
  2. Låt den växa över natten vid 28 ° C, 80% luftfuktighet, i en shaker vid 100-130 rpm (skakande 2,5 cm i diameter).

4. mätning Setup och huvudsakliga kultur odling

  1. För att ställa in online övervakningssystemet, följ tillverkarens instruktioner för lämpligt kalibrering av enheterna.
  2. Placera en dator, där lämplig programvara för övervakning installeras i intervallet för en Bluetooth-anslutning till mätstationerna. Starta programvaran för att ansluta enheterna via Bluetooth.
    1. Aktivera Bluetooth-anslutningen på biomassa mätapparaten genom att trycka på knappen silver på framsidan.
    2. Klicka på enheter och sedan Hitta enheteri programvaran.
      Obs: Enheterna ska visas som en lista i fönstret under raden uppgift. Om de inte gör det, är det lämpligt att kontrollera om batterierna är laddade och datorn är inom räckhåll för en Bluetooth-anslutning.
    3. Dra och släpp de Funna enheterna att kvadraterna på höger sida av skärmen Mätning fack.
    4. Klicka på Anslut.
      Obs: När anslutningen var framgångsrik, en kontroll skärm visas.
    5. Starta en provkörning för Bluetooth-anslutningen, klicka på mätning.
    6. Ställa in experimentet.
      1. Klicka på Starta mätning, namn experimentet och aktivera alla parametrar som behövs för att övervaka.
        Obs: Licenser behövs för alla de möjliga uppmätta parametrarna.
      2. Ange intervall till 3 min.
        Obs: Intervallet bestämmer hur ofta mätpunkter tas och varje mätpunkt resulterar i ett värde efteråt. Mäta varje minut är mycket exakt, men massor av data genereras vilket gör det mer arbetskrävande att utvärdera.
      3. Ange Medelvärde mätpunkter till 11.
        Obs: Den här inställningen bestämmer hur många mätpunkter är faktiskt tagna varje 3 min. Därför utdata är medelvärdet av 11 mätpunkter över 11 s.
      4. Ange namnen för prover.
      5. Hoppa över nästa skärm så vinkeln kalibrerades innan (steg 4.1).
        Obs: En provkörning för Bluetooth-anslutningen innan vaccinera de huvudsakliga kulturerna rekommenderas att säkerställa stabila anslutningar och lämplig plats för den anslutna datorn. Dessutom har batterierna laddas.
  3. Mäta cell densiteten av de ONC (steg 3.1) utspätt i odling medier (1:20) i en spektrofotometer vid 600 nm våglängd. Inokulera 50 mL av medium (rekommenderas källa kolhalten 0,3-1%, olika medier möjligt enligt beskrivningen i steg 1.) med ONC till en OD600 0,05 med hjälp av följande beräkning.
    Equation 1
  4. Placera kolvarna i detektorerna och skaka vid 28 ° C, 130 rpm och 80% luftfuktighet.
    Obs: Det är mycket viktigt att ge kulturen 5 min i skakar innan start mätningen till undvika celler fastnar längst ned i kolven och ger fel värden.
  5. Klicka på Starta mätning i programvaran.
  6. Ta 0,2 mL prov för cell densiteten mätning 4 h efter inympningen och när kolkälla blir utarmat (bestämning beskrivs i steg 4.7) i exemplar. Späd ut proverna på lämpligt sätt i odling media (första mätning 1:5, andra mätning 1:20) och mäta upptaget på 600 nm våglängd i en spektrofotometer. Innan du tar bort kolvar och även innan du stoppar shaker, alltid pausa mätningen i programvaran.
    Obs: Detektorerna är kalibrerade för inspelning parametrar definierade skakningar villkor och kommer att ge till nonsens mätningar när inspelning fortfarande kulturer. Se också till att alltid vänta 5 min i skakar innan mätningen igen. Cell densiteten mätningar är viktiga eftersom detektorn levererar bara värden för biomassa och inte riktiga cell densiteten. En kalibreringsfunktion mellan600 OD-värdena (x-värden) och de värden som erhålls av online mätsystemet (y-värden) kan uppnås genom att mäta flera tidpunkter spektrofotometriskt. Värdena är inte i en linjär utan i ett logaritmiskt förhållande enligt följande kalibreringsfunktion:
    Equation 2
    y: OD600 värden erhålls genom spektrofotometer
    x: värden erhålls genom online mätsystem
    k: lutning
    d: axis avlyssna
    Lutning och skärningspunkt med axis kan sedan användas för att konvertera alla värden till motsvarande OD600 värde. I Excel kan man rita spektrofotometriskt erhållna OD600 -värdena mot värden från online-systemet från den samma tidpunkt. Tillägg av en logaritmisk trendlinje och den motsvarande ekvationen ger kalibreringsfunktionen visas ovan.
  7. Odla tills kolkälla är nästan utarmat (ca 12-20 h). För detta ändamål, låt kulturerna som växa tills det kan ses i programvara diagram att syrekoncentrationen närmar sig noll och cellerna är i exponentiella tillväxtfasen.
    Obs: Detta är fallet för kol källa koncentrationer används i detta protokoll. Tidpunkt för kol källa utarmning kan bestämmas med online övervakningssystemet som det visas exemplarily i figur 1 i avsnittet representativa resultat när syrenivån närmar sig noll och cellerna i den exponentiella tillväxten fas.

5. protein uttryck av de förtryck

  1. När den tidpunkt som beskrivs i steg 4,6 uppnås, börja mata kulturerna genom tillsats av fyra foder skivor per kolv under sterila förhållanden.
    Obs: De beskrivna villkor, fyra glycerol foder skivor släppa 2 mg/h glycerol enligt tillverkaren.
  2. Fortsätt odling för 60-90 h medan du tar prover varje 24 h att övervaka proteinuttryck med test av val (t.ex., Bradford assay15, SDS sida16 eller aktivitet analyser) och cell densiteten mätningar.

6. kultur skörd

  1. Efter 60-90 h av odling, Fyll kulturerna i 50 mL centrifugrör för skörd genom centrifugering vid 4000 x g, 4 ° C i 10 min.
    Obs: Supernatanten (för utsöndrade proteiner) eller cellerna (för intracellulära proteinuttryck) kan skördas genom centrifugering vid 4000 x g, 4 ° C i 10 min och ytterligare analyser kan göras.
  2. Exportera mätdata online som en kalkylbladsfil från programvaran för vidare analys.
  3. Fyll 5-10 mL destillerat vatten till alla kolvar och autoklav att inaktivera återstående cellerna.

Representative Results

Som beskrivs i avsnittet protokoll, registrerar programvaran parametrarna viktig odling över hela odlingen. Figur 1 visar visualisering av biomassa utveckling och syrekoncentration under en odling som började med 0,5% (figur 1A) eller 0,3% (figur 1B) kolkälla i batchen följt genom tillsats av glycerol mata skivor. Online övervakningssystemet är speciellt användbar för de de bortträngda odlingarna som tidpunkt för kol källa utarmning efter batch kan bestämmas exakt. Som det kan ses i figur 1, syrekoncentrationen i medium minskar snabbt och närmar sig noll, speciellt för 0,5% glycerol i parti (figur 1A) medan biomassa ökar exponentiellt på denna punkt. Här cellerna är i exponentiella tillväxtfasen och för att optimalt utnyttja kol källa lanseringen, strax innan kulturen når den stationära fasen, foder skivorna bör läggas som det beskrivs i protokollet. Tillägg av foder skivorna innan syrehalten når noll är viktigt för de undertryckta proteinuttryck att förhindra celler från syre begränsning. Lägre glycerol koncentrationer minska effekten av kortsiktiga syre begränsningar eftersom det kan ses i figur 1B och rekommenderas därför för de undertryckta proteinuttryck.

I följande resultaten av två olika odling experiment – anställa beskrivna protokollet och övervakningssystemet visas i figur 1 – beskrivs. I det första experimentet, en P. pastoris stam producerar glukosoxidas från Aspergillus niger (A. niger) under kontroll av PDC och i andra en P. pastoris stam producera humant tillväxthormon under kontroll av PDF visas.

I detta experiment undersöktes glukos oxidas produktion under kontroll av PDC . Därför olika odling strategier jämfördes: glycerol pulserande, konstant glycerol foder genom tillägg av foder skivor och odling utan något foder eller pulserande. Odling skedde i 50 mL buffrad minimal media med 0,5% glukos som enda kolkälla i 250 mL skaka kolvar (tabell 1).

Vid 160 h odling, de högsta koncentrationerna som biomassa erhölls, när en utfodring strategi med en glukos batch för produktion av biomassa (38 h) och glycerol pulserande (0,25% w/v glycerol efter 38 h, 61 h och 86 h odling) var anställd (0.21 HB totalt sekretoriska protein, 8,4 U/mL). Även om en 2-faldig minskning av biomassa koncentration och den totala mängden utsöndrade proteinet erhölls, när foder diskarna har lagts till efter 38 h glukos batch, var volymetrisk aktiviteten även 1 U/mL högre jämfört med odling använder glycerol pulserande . Detta indikerar att en betydande mängd utsöndrade proteinet bidrar inte till volymetrisk aktivitet i supernatanten och kan utsöndras i en inaktiv form. Därför gynnar högre glycerol koncentrationer från glycerol pulser till synes bildandet av biomassa istället för målet proteinproduktion och konstant låg glycerol release ledde till mer än två gånger högre specifika produktivitet.

Ett annat experiment sysselsätter de bortträngda uttryck metoden gjordes av uttrycker humant tillväxthormon (hGH) under kontroll av PDF. Konstruktionen var stabilt integrerat i genomet hos P. pastoris stam BSYBG11. Här, 50 mL BYPG, buffrat rikt medium, i 250 mL förbryllad skaka kolvarna användes med 0,3% (w/v) glycerol som kolkälla i batchen. Vid avskrivning av glycerol säkerställdes i proteinuttryck med konstant glycerol foder genom tillägg av 4 Mata skivor per kolv och jämfört med ingen glycerol som foder (figur 2).

Figur 2 visar en jämförelse mellan hGH uttryck och biomassa utveckling av samma stam odlas med och utan konstant glycerol foder. Som assay smörgås ELISA användes med sekundära antikroppen smält till HRP och upptäckt genomfördes med 3,3′, 5, 5 '-tetrametylbensidin (TMB) som substrat. Speciellt för detta protein, det verkade vara fallet att utan någon utfodring, cellerna börjar försämra producerade proteinet efter ca 30 h (ljus blå fyrkanter), medan utfodring, denna nedbrytning kan vara förhindrade (mörk blå trianglar) och även den proteinkoncentration per biomassa ökade fortfarande efter 150 h av odling. Såsom redan angetts för Hansenula polymorpha14visar detta resultat Hur byter från batch, som det används vanligtvis i skaka kolven skala, att fed-batch-läge kan optimera P. pastoris odlingar.

Figure 1
Figur 1: visualisering av online spelades in parametrar under två odlingar med olika glycerol koncentrationer i batchen. Odlingarna var igång med 0,5% w/v (A) och 0,3% w/v (B) glycerol i batchen följt av fasen avinstallation förtryck där cellerna matades genom att tillämpa 4 foder skivor per kolv (release av 0,5 mg/h/skiva enligt tillverkaren). De streckade linjerna visar syrekoncentrationen i medium, medan de kontinuerliga linjerna visar cell densiteten (OD600). Felstaplar visar standardavvikelsen för sex replikerar (2 biologiska, tre tekniska varje). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: jämförelse av humant tillväxthormon (hGH) uttryck i batch och fed-batch-läge. hGH innehåll indikeras av absorbering värderar vid 405 nm av ELISA där 2nd antikroppen var en HRP fusion och TMB användes som substrat för upptäckt. Visas resultaten för två olika kulturer: ljus blå linje och torg display cell densiteten och hGH koncentration normaliserade av cell tätheterna av en kultur utan någon foder efter batchen, jämfört med en kultur, där glycerol mata skivor var tillämpas (mörka blå linjer och trianglar). Felstaplar visar standardavvikelsen för sex replikerar (2 biologiska, tre tekniska varje). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

PDC- GOX på 160 h odling tid OD600 Vol. aktivitet [U/mL] totala mängden utsöndrade proteinet [mg/mL] volymetrisk aktivitet per cell densiteten
Menar SD Menar SD Menar SD Menar
BMD1% batch + glycerol pulserande 74,6 2 8,4 2.4 0,21 0,01 0,11
BMD1% batch + konstant glycerol foder 32,5 0,3 9,4 0,7 0,09 0,01 0,29
BMD1% batch 18,8 0,6 3.7 0,7 0,01 0 0,2

Tabell 1: resultat av metanol oberoende GOX uttryck under kontroll av de bortträngda arrangören PDC .

Discussion

Denna metod presenterar ett pålitligt protokoll för effektiv metanol oberoende inducerbara uttryck av P. pastoris som ett alternativ till klassisk metanol inducerad proteinuttryck drivs av PAOX112. De repressible initiativtagare, som PDC, PDF eller tidigare beskrivna muterade PAOX1 varianter17, bygga den molekylära basen för detta nya koncept för produktion av protein. Visas representativa resultat understryker nyttan och genomförbarheten av rekombinant proteinuttryck i P. pastoris av de bortträngda initiativtagare och småskaliga screening med enkla online-övervakning. Dels, kan skadliga och giftiga metanol som oftast används för induktion av AOX1 arrangören elimineras från odlingen. Däremot, tillväxten och protein produktionsfasen är okopplade9 i motsats till konstituerande proteinuttryck, t.ex., med vanliga PGAP. Detta är speciellt fördelaktigt när cellerna bör uttrycka giftiga eller skadliga proteiner som visar en börda för dem.

Möjligheten att starta odlingarna med olika kol källa koncentrationer kan beslutet av hur mycket biomassa som man skulle vilja få före produktionsfasen protein börjar. När du väljer en lägre kolhalten för källa i partiet, kan syre överföring begränsningar på grund av för hög cell tätheter minskas medan å andra sidan högre cell tätheter kan också resultera i högre protein-titrar. Genom att övervaka kultur utvecklingen när det gäller biomassa generation och syrehalter, kan den optimal tidpunkten för fed-batch inledande enkelt bestämmas som det visas i figur 1.

För online-övervakning av dessa parametrar för odling, bör ett lämpligt mätsystem tillämpas. Biomassan mätanordning (t.ex., SFR Vario) är en enkel och ekonomisk online mätsystem för övervakning av kultur i skaka kolvarna. Optoelektroniska läsaren bestämmer celltillväxt i kolven via spridda ljus upptäckt och läser ut signalen från lambdasensorn integrerade i kolven. Optik för biomassa mätningen består av en LED som avger en ljussignal, som är spridda av partiklar (celler) i kultur buljong och identifieras med en fotodiod. De optiska sensorerna avger fluorescens när glada med ljus av en viss våglängd. Beroende på mängden analyt molekyler som finns ändras denna fluorescens signal, vilket upptäcks av läsaren optiken och översatt till koncentrationsvärdena. En cell densiteten mätning kalibrering har emellertid fastställas i förväg, eftersom mätsystemet inte mäter faktiska OD600 värden. Den syre upptagshastigheten kan beräknas från lutningen på kurvan syre med programvaran reader, och såväl temperatur som rpm registreras kontinuerligt tillsammans med andra parametrar. Om du vill aktivera övervakning med detta system, har de skaka kolvarna tidigare vara utrustade med lämpliga sensorer för de önskade parametrarna.

Skivor som ger en konstant mängd glycerol till kultur buljong, biomassa ackumulering stoppas nästan genom tillsats av fyra långsam frisättning polymer och rekombinant proteinproduktionen fortsättas. Bestämning av den matning skiva tillägg tidpunkten är inte ett avgörande steg i detta experiment, men det bör beaktas att en förtida foder start innan exponentiell fas kunde hämmande arrangören aktiveringen som uttrycket börjar vid Carbon källa utarmning. Dessutom minskas den totala matdags på grund av polymer kapacitetsbegränsningar, medan att senarelägga fodret efter cellerna har nått den stationära fasen kan leda till svältande och försämring av redan producerade protein. Mängden foder skivor används i detta protokoll bestämdes experimentellt för den optimala kol källkod releasen att hålla arrangören de undertryckta medan du håller biomassa generation låg (inga data anges). På detta sätt, odlingarna kan vara utförs enkelt över 160-180 h utan några åtgärder.

Huvudsakliga applikationer i detta nya protokoll blir uttrycket klon screening, enzym evolution upptäckten, karakterisering och konstruktion av nya initiativtagare anställa en metanol-fritt odling protokoll i väl övervakade förhållanden. I princip bör samma protokoll gälla för blandade-flöde strategier anställa metanol och begränsad fermentativa kol källa feeds som beskrivs av Panula-Perälä et al. i 201418.

Disclosures

Även om protokollet presenteras gäller generellt för odling och induktion varaktigt blockeras villkor, förklarar bisy e.U. ha intresse i kommersialisering av de nya derepressed initiativtagare som används i denna studie.

Acknowledgments

ROBOX har fått finansiering från Europeiska unionen (EU) projektet ROBOX (grant avtalet n ° 635734) enligt EU: s Horizon 2020-programmet forskning och Innovation Horisont 2020-LEIT BIO-2014-1. Synpunkter och åsikter som uttrycks här är endast de författarnas eller författarens och återspeglar inte nödvändigtvis de av Europeiska unionens forskning byrå. Europeiska unionen är inte ansvarig för någon användning som kan göras av informationen häri.

Doktorsavhandlingen av J. Fischer medfinansieras av bidrag för ”Industrienahe avhandling” av den österrikiska finansiering byrån FFG.

Vi tackar Gernot John (PreSens GmbH) för bra diskussioner och värdefulla synpunkter för utkastet till manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Yeast Extract BD Biosciences 212720
Baffled Flask 250 mL DWK Life Science 212833655
BBL Phytone Peptone BD Biosciences 298147
BioPhotometer Eppendorf AG 5500-200-10
Certoclav-EL CertoClav GmbH 9.842 014
Difco Yeast nitrogen base w/o amino acids BD Biosciences 291920
Feed discs glycerol Adolf Kuhner AG 315060
Glucose-monohydrate Carl Roth GmbH + Co. KG 6887
Glycerol ≥98 % Carl Roth GmbH + Co. KG 3783
K2HPO4 Carl Roth GmbH + Co. KG 6875
KH2PO4 Carl Roth GmbH + Co. KG 3904
Multitron Standard  Infors AG 444-4226
SFR Vario v2 PreSens GmbH 200001689

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bill, R. M. Playing catch-up with escherichia coli: Using yeast to increase success rates in recombinant protein production experiments. Frontiers in Microbiology. 5, (MAR), 1-5 (2005).
  2. Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. Recombinant Protein Expression in Pichia pastoris). Molecular Biotechnology. 16, 23-52 (2000).
  3. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
  4. Vogl, T., Kickenweiz, T., Sturmberger, L., Glieder, A. Bidirectional Promoter. US patent. 20150011407 (2005).
  5. Vogl, T., Glieder, A. Regulation of Pichia pastoris promoters and its consequences for protein production. New Biotechnology. 30, (4), 385-404 (2013).
  6. Rußmayer, H., et al. Systems-level organization of yeast methylotrophic lifestyle. BMC Biology. 13, (1), 80 (2015).
  7. Sakai, Y., Yurimoto, H., Matsuo, H., Kato, N. Regulation of peroxisomal proteins and organelle proliferation by multiple carbon sources in the methylotrophic yeast, Candida boidinii. Yeast. 14, (13), 1175-1187 (1998).
  8. Hartner, F. S., Glieder, A. Regulation of methanol utilisation pathway genes in yeasts. Microbial Cell Factories. 5, 39 (2006).
  9. Vogl, T., et al. A Toolbox of Diverse Promoters Related to Methanol Utilization: Functionally Verified Parts for Heterologous Pathway Expression in Pichia pastoris. ACS Synthetic Biology. 5, (2), 172-186 (2016).
  10. Mellitzer, A., Weis, R., Glieder, A., Flicker, K. Expression of lignocellulolytic enzymes in Pichia pastoris. Microbial Cell Factories. 11, (1), 61 (2012).
  11. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22, (4), 249-270 (2005).
  12. Weis, R., Luiten, R., Skranc, W., Schwab, H., Wubbolts, M., Glieder, A. Reliable high-throughput screening with Pichia pastoris by limiting yeast cell death phenomena. FEMS Yeast Research. 5, (2), 179-189 (2004).
  13. Ukkonen, K. Improvement of Recombinant Protein Production in Shaken Cultures. Acta University Oulu C 480 (2014).
  14. Jeude, M., et al. Fed-batch mode in shake flasks by slow-release technique. Biotechnology and Bioengineering. 95, 433-445 (2006).
  15. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  16. Smith, B. J. SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Methods in molecular biology. 1, 41-55 (1984).
  17. Hartner, F. S., et al. Promoter Library Designed for Fine-Tuned Gene Expression in Pichia Pastoris. Nucleic Acids Research. 36, (12), e76 (2008).
  18. Panula-Perälä, J., Vasala, A., Karhunen, J., Ojamo, H., Neubauer, P., Mursula, A. Small-scale slow glucose feed cultivation of Pichia pastoris without repression of AOX1 promoter: towards high throughput cultivations. Bioprocess and Biosystems Engineering. 37, (7), 1261-1269 (2014).
Metanol oberoende uttryck av <em>Pichia Pastoris</em> sysselsätter de förtryck teknik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fischer, J. E., Hatzl, A. M., Weninger, A., Schmid, C., Glieder, A. Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies. J. Vis. Exp. (143), e58589, doi:10.3791/58589 (2019).More

Fischer, J. E., Hatzl, A. M., Weninger, A., Schmid, C., Glieder, A. Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies. J. Vis. Exp. (143), e58589, doi:10.3791/58589 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter