Denna metod för första gången beskriver tillförlitlig experimentella rutiner för effektiv inducerbara metanol-fri rekombinant proteinproduktion i Pichia pastoris (Komagataella phaffii), sysselsätter kol källa reglerade initiativtagarna P DCoch PDF i liten skala experiment samtidigt odling kan parametrar övervakas online, och ett konstant glycerol foder används.
Metanol är en väletablerad kolkälla och inducerare för effektiv proteinproduktion sysselsätter Pichia pastoris (P. pastoris) som värd på mikro-, lab och industriell skala. Dock på grund av dess toxicitet och brännbarhet finns det en önskan att undvika metanol bibehållen P. pastorishöga produktivitet. Liten skala bioreaktor odlingar (0,5-5 L arbetar volym) är vanligen används för att utvärdera en stam och dess protein produktion egenskaper eftersom hur provtagningsutrustningen skall odling i djupt plattor knappast kan styras eller förlitar sig på dyr utrustning. Dessutom fastställdes traditionella protokoll för odling och induktion av P. pastoris för konstitutiva uttryck eller metanol induktion och hittills inga tillförlitliga protokoll beskrevs att skärmen P. pastoris uttryck stammar med derepressible initiativtagare i (kontrollerade och övervakade) parallella odlingar. För att förenkla sådana inledande odlingar för att karakterisera och jämföra nya protein produktion stammar, etablerat vi ett enkla skaka kolven odling system för metanol yttrandefrihet som simulerar bioreaktor villkor inklusive en konstant långsam glycerol foder och online-övervakning, därmed kommer närmare till de verkliga förhållandena i bioreaktorer jämfört med mestadels tillämpad småskaliga batch odlingar. För att driva rekombinant proteinuttryck i P. pastoris, kolkälla förträngde initiativtagare PDC och PDF tillämpades. Polymer skivor med inbäddade kolkälla, släppa en konstant mängd glycerol, försäkrade en matningshastighet leverera nödvändig energi för att upprätthålla initiativtagarna aktiva samtidigt hålla den biomassa generationen låg.
Förbättring av avkastning och pålitlig odling villkor i stor skala för rekombinant proteinproduktion av mikroorganismer såsom bakterier eller jäst är en av stora dagens bioteknik1 och kommersiell framgång för industriella behov applikationer. Dueto enkel odling förfaranden och medier, hög avkastning och väl karakteriserade verktyg2 Pichia pastoris (Komagataella phaffii) är en allmänt Använd icke-konventionell jäst för produktion av rekombinanta proteiner. Ytterligare innovativa verktyg utvecklas ständigt för denna art, liksom nya uttryck vektorer inklusive nya initiativtagare som alternativ till den utbredda PAOX1, promotor regionen av alkohol oxidas 1 gen3, 4,5. En 500 bp lång DNA-sekvens uppströms av CAT1 (CTA1) genen identifierades som promotor regionen, vilket gör att en ny strategi för metanol-fri och mångsidig uttryck i P. pastoris. CAT1 genen är den enda katalas-gen av P. pastoris och proteinet är beläget i peroxisomes. Katalas spelar en viktig roll i avgiftning av reaktiva syreradikaler, som uppstår, t.ex., från metanol oxidation i peroxisomal MUT väg eller under beta oxidation av fettsyror6,7. Uttrycket av genen CAT1 är förtryckta i prescence i glukos eller glycerol i odling medium och varaktigt blockeras vid utarmning av dessa kol källor8. Dessutom kan uttrycket av genen katalas induceras med metanol och remarkebly också med oljesyra, till synes vara den enda gen av P. pastoris MUT-vägen som kan induceras med oljesyra som även når liknande uttryck nivåer som med metanol induktion9.
Den 500 bp fragmentet av detta P. pastoris CAT1 arrangören, som kallas PDC (ibland även förkortat PCAT1-500), har redan testats för produktion av intracellulärt uttryckt och utsöndrade proteiner och det visade sig vara en attraktivt alternativ till två klassiska P. pastoris initiativtagare – stark konstituerande PGAP och metanol inducerbara PAOX1, som framkallades mer än 20 år sedan. PDC kunde nå 21% (CalB) och 35% (HRP) volymetrisk verksamhet jämfört med PGAP i socker rik medium. Vid metanol induktion, PDC svarade inte bara snabbare än de P-AOX1, men kunde också tydligt överträffa det med en 2,8 gånger högre slutliga titer för CalB9.
Förutom PDC, hade en orthologous arrangören (PDF) identifierats uppvisar en liknande förordning profil. Det är dock betydligt starkare än PDC under varaktigt blockeras samt under metanol-inducerad villkorar (manuskript i förberedelse)3.
I fall där stark konstituerande PGAP misslyckades på grund av fysiologiskt problematiska eller cytotoxiska proteiner10,11, utgör PDC och PDF ett perfekt alternativ. I mikroskala experiment, ett uttryck som drivs av dessa initiativtagare startar efter utarmning av den inledande kolkälla (t.ex., glukos eller glycerol), vilket underlättar produktionen av biomassa utan att belasta cellerna med överuttryck av rekombinanta proteinet rätt från början. Medan båda dessa initiativtagare är fortfarande inducerbara av metanol, aktivering av derepression gör ytterligare användning av den preinduction fasen jämfört med de uttryck som sysselsätter PAOX1. Dessutom kan den PDC och PDF användas för produktion av metanol-fri proteiner, som är ett önskvärt mål för stora industriella processer12.
För utvecklingen av tillämpliga produktion stammar och uttryck konstruktioner har flera steg i utvecklingen som ska skickas för att begränsa från ett stort antal transformants att de föredrog kandidaten för skala upp. Filmvisningar är vanligtvis utförs i hög genomströmning i plattor med flera (mikroskala: mindre än 0,5 mL) för att fånga en rad kloner så stor som möjligt. Efterföljande nytt screening och re-re-screening är nästa steg, följt av skaka kolven (liten skala: 50-250 mL) eller (mikro-) bioreaktor filmvisningar12. Det är dock önskvärt att ha en metod, som är mest likt mellan de olika skalorna från hundratals mikroliter i djupa brunnar upp till flera milliliter i skaka kolvarna upp till senare skala upp metanol-fri produktion i välkontrollerade bioreaktorer. Även om skaka kolvarna kan ge redan liknande volymer som små bioreaktorer, det finns flera begränsningar, som är mycket relevanta för storskalig produktion av proteiner som konstant utfodring, luftning och online-övervakning13 i tillväxt och syretillförsel. Optisk övervakning anställa anpassat skaka kolvarna och skakningar enheter ger ett kostnadseffektivt alternativ till mer sofistikerade utrustning för parallell odling samtidigt som konstant online information om större kultur parametrar såsom biomassa och koncentrationen upplöst syrgas. Långsam frisättning av kolkälla från polymer bärare kan användas för att säkra en konstant och kontrollerad matning utan förlitar sig på komplexa tekniska lösningar och enheter, simulera mer liknande användningsvillkor i bioreaktorer än det tidigare tillämpade enkel fullt utarmning av kol källa9,10, begränsande där energi för pågående proteinuttryck blir.
Följande metod beskriver en liten till medelstor skala metanol-fritt controllable proteinuttryck systemet i P. pastoris baserat på nya initiativtagarna PDC och PDF. Induktion av derepression omfattar två faser. En första kort stavelse arrangerar gradvis av biomassa ackumulering utan produktionen av proteinet av intresse, använda en kolkälla som förtrycker initiativtagarna och en andra fas av mål proteinproduktion, där en kolkälla levereras i liten men konstant koncentrationer att upprätthålla arrangören varaktigt blockeras. Online-övervakning av mest kritiska odling parametrar tillämpas under hela odlingen. Målet var att ge en metanol gratis, tillförlitlig och skalbar odling system för P. pastoris.
Denna metod presenterar ett pålitligt protokoll för effektiv metanol oberoende inducerbara uttryck av P. pastoris som ett alternativ till klassisk metanol inducerad proteinuttryck drivs av PAOX112. De repressible initiativtagare, som PDC, PDF eller tidigare beskrivna muterade PAOX1 varianter17, bygga den molekylära basen för detta nya koncept för produktion av protein. Visas representativa resultat understryker nyttan och genomförbarheten av rekombinant proteinuttryck i P. pastoris av de bortträngda initiativtagare och småskaliga screening med enkla online-övervakning. Dels, kan skadliga och giftiga metanol som oftast används för induktion av AOX1 arrangören elimineras från odlingen. Däremot, tillväxten och protein produktionsfasen är okopplade9 i motsats till konstituerande proteinuttryck, t.ex., med vanliga PGAP. Detta är speciellt fördelaktigt när cellerna bör uttrycka giftiga eller skadliga proteiner som visar en börda för dem.
Möjligheten att starta odlingarna med olika kol källa koncentrationer kan beslutet av hur mycket biomassa som man skulle vilja få före produktionsfasen protein börjar. När du väljer en lägre kolhalten för källa i partiet, kan syre överföring begränsningar på grund av för hög cell tätheter minskas medan å andra sidan högre cell tätheter kan också resultera i högre protein-titrar. Genom att övervaka kultur utvecklingen när det gäller biomassa generation och syrehalter, kan den optimal tidpunkten för fed-batch inledande enkelt bestämmas som det visas i figur 1.
För online-övervakning av dessa parametrar för odling, bör ett lämpligt mätsystem tillämpas. Biomassan mätanordning (t.ex., SFR Vario) är en enkel och ekonomisk online mätsystem för övervakning av kultur i skaka kolvarna. Optoelektroniska läsaren bestämmer celltillväxt i kolven via spridda ljus upptäckt och läser ut signalen från lambdasensorn integrerade i kolven. Optik för biomassa mätningen består av en LED som avger en ljussignal, som är spridda av partiklar (celler) i kultur buljong och identifieras med en fotodiod. De optiska sensorerna avger fluorescens när glada med ljus av en viss våglängd. Beroende på mängden analyt molekyler som finns ändras denna fluorescens signal, vilket upptäcks av läsaren optiken och översatt till koncentrationsvärdena. En cell densiteten mätning kalibrering har emellertid fastställas i förväg, eftersom mätsystemet inte mäter faktiska OD600 värden. Den syre upptagshastigheten kan beräknas från lutningen på kurvan syre med programvaran reader, och såväl temperatur som rpm registreras kontinuerligt tillsammans med andra parametrar. Om du vill aktivera övervakning med detta system, har de skaka kolvarna tidigare vara utrustade med lämpliga sensorer för de önskade parametrarna.
Skivor som ger en konstant mängd glycerol till kultur buljong, biomassa ackumulering stoppas nästan genom tillsats av fyra långsam frisättning polymer och rekombinant proteinproduktionen fortsättas. Bestämning av den matning skiva tillägg tidpunkten är inte ett avgörande steg i detta experiment, men det bör beaktas att en förtida foder start innan exponentiell fas kunde hämmande arrangören aktiveringen som uttrycket börjar vid Carbon källa utarmning. Dessutom minskas den totala matdags på grund av polymer kapacitetsbegränsningar, medan att senarelägga fodret efter cellerna har nått den stationära fasen kan leda till svältande och försämring av redan producerade protein. Mängden foder skivor används i detta protokoll bestämdes experimentellt för den optimala kol källkod releasen att hålla arrangören de undertryckta medan du håller biomassa generation låg (inga data anges). På detta sätt, odlingarna kan vara utförs enkelt över 160-180 h utan några åtgärder.
Huvudsakliga applikationer i detta nya protokoll blir uttrycket klon screening, enzym evolution upptäckten, karakterisering och konstruktion av nya initiativtagare anställa en metanol-fritt odling protokoll i väl övervakade förhållanden. I princip bör samma protokoll gälla för blandade-flöde strategier anställa metanol och begränsad fermentativa kol källa feeds som beskrivs av Panula-Perälä et al. i 201418.
The authors have nothing to disclose.
ROBOX har fått finansiering från Europeiska unionen (EU) projektet ROBOX (grant avtalet n ° 635734) enligt EU: s Horizon 2020-programmet forskning och Innovation Horisont 2020-LEIT BIO-2014-1. Synpunkter och åsikter som uttrycks här är endast de författarnas eller författarens och återspeglar inte nödvändigtvis de av Europeiska unionens forskning byrå. Europeiska unionen är inte ansvarig för någon användning som kan göras av informationen häri.
Doktorsavhandlingen av J. Fischer medfinansieras av bidrag för ”Industrienahe avhandling” av den österrikiska finansiering byrån FFG.
Vi tackar Gernot John (PreSens GmbH) för bra diskussioner och värdefulla synpunkter för utkastet till manuskriptet.
Bacto Yeast Extract | BD Biosciences | 212720 | |
Baffled Flask 250 mL | DWK Life Science | 212833655 | |
BBL Phytone Peptone | BD Biosciences | 298147 | |
BioPhotometer | Eppendorf AG | 5500-200-10 | |
Certoclav-EL | CertoClav GmbH | 9.842 014 | |
Difco Yeast nitrogen base w/o amino acids | BD Biosciences | 291920 | |
Feed discs glycerol | Adolf Kuhner AG | 315060 | |
Glucose-monohydrate | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6887 | |
Glycerol ≥98 % | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3783 | |
K2HPO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6875 | |
KH2PO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904 | |
Multitron Standard | Infors AG | 444-4226 | |
SFR Vario v2 | PreSens GmbH | 200001689 |