测量代谢率的变化是了解各种疾病和衰老进展的关键。在这里, 我们提出了一个新的技术来测量整个头部的耗氧量, 更接近的生理状态, 并可能有助于揭示新的药物, 改变线粒体的活性。
调节代谢活动对于活细胞的正常运作至关重要。事实上, 代谢活动的改变与癌症、糖尿病、神经退行性变和衰老的进展有因果关系。例如, 线粒体活性的变化–细胞的代谢动力–在许多此类疾病中都有其特征。一般来说, 线粒体的耗氧率被认为是线粒体活性的可靠读数, 其中一些研究的测量是基于分离的线粒体或细胞。然而, 这样的情况可能并不代表整个组织的复杂性。最近, 我们开发了一种新的方法, 可以动态测量整个孤立飞头的耗氧率。利用这种方法, 我们记录了年轻苍蝇与老年苍蝇整个头部段的耗氧率较低。其次, 我们发现赖氨酸去乙酰化酶抑制剂迅速改变了整个头部的耗氧量。因此, 我们的新技术可能有助于发现各种药物的新特性, 这可能会影响代谢率。此外, 我们的方法可以让更好地了解代谢行为的实验设置, 更接近生理状态。
调节代谢活动对于细胞的存活和组织的健康功能至关重要。放松管制的代谢活动已被广泛证明与各种疾病的发生和进展1有关.例如, 较低的代谢活动以前被描述在神经退行性疾病, 如阿尔茨海默氏症和年龄相关的记忆障碍2,3。此外, 线粒体功能障碍被认为是因果关系的老化过程4,5。另一方面, 在癌细胞6中描述了较高的线粒体和代谢率, 其中使用线粒体抑制剂降低了肿瘤的发生.
代谢活动的一个读数是线粒体的耗氧率 (ocr)。有趣的是, 这种类型的读数主要是从孤立的线粒体或细胞获得的, 因此文献中描述的大部分内容主要是基于与生理状态不相似的读数。但是, 此技术有几个缺点。首先, 线粒体分离的协议可能会损害其完整性8, 这可能是比较从年轻组织和老年组织9中分离的线粒体时的一个相关的人工制品.此外, 分离过程很长, 可能会导致相关蛋白质翻译后修饰的损失, 调节线粒体功能9,10,11。此外, 它已经表明, 孤立的线粒体并不一致地代表整个组织代谢率 12,13.这种细胞生物学复杂性可以被看作是, “整体大于其各部分的总和”,即线粒体可能显示不同的代谢率在一个复杂的细胞内相比, 他们的代谢率, 当孤立。
虽然细胞可能比分离的线粒体提供更好的 ocr 读数, 但在整个组织的背景下, 细胞与细胞之间的通信可能会丢失。例如, 在大脑中, 神经元的代谢活动在很大程度上取决于邻近胶质细胞的代谢活动14。因此, 建立新的技术来调查整个组织或整个生物体中的 ocr 可能会被证明是更有见地的发病和进展的各种疾病。
最近, 出现了新的技术来解决这些问题, 并能够测量整个组织, 段, 或活生物体的 ocr。例如, 最近的一项研究报告了使用带有呼吸计15的渗透纤维方法从甲虫飞行肌肉中测量氧气的情况.新的微呼吸测量机可以测量胰岛的 ocr16,17。因此, 据报道, 该技术能够测量全蠕虫18和斑马鱼19的 ocr。然而, 消化道屏障的存在可能会对在 ocr 改变的情况下检测各种药物构成挑战。有趣的是, 内维尔和他的同事最近的报告显示了一种用井板20,21测量单果蝇幼虫大脑的新技术。
在这项研究中, 我们使用了类似的设置, 以实现整个 ocr 的测量从整个活的和非移动的五合器22。这项技术还提供了一个次要优势, 可以测量各种药物对整个部分代谢活动的影响, 而不必通过消化系统屏障13,22.例如, 此前已经证明, 直接注射赖氨酸去乙酰化酶抑制剂 (kdaci), 一种被认为改变大脑表观遗传机制的药物, 导致了记忆形成23的改善。然而, 通过使用我们的新技术, 我们发现 kdac 的抑制导致 ocr 的迅速增加, 这本身可能是一个因素本身在神经元活动。我们的协议提供了一种简单而新颖的方法来评估各种药物、基因操纵或生理状态 (疾病、衰老) 在整个头部的背景下对 ocr 的影响。
我们的新技术提供了一种新的方法来研究代谢变化的老化和疾病的背景下, 整个飞头段22。该方法也适用于研究 kdac 丁酸钠对耗氧量的影响。正如我们所证明的, 赖氨酸去乙酰化酶抑制剂 (hdacs/kdac) 会导致 ocr 的变化。从本质上讲, 由于这类抑制剂的靶点通常不局域在线粒体中 (这些抑制剂不会影响 iii 类去乙酰化酶, sirtuins)24, 这类药物只能在至少组织水平上进行检测。事实上, 各种药物直接注射到大脑, 从而绕过可能的过程修改/由消化系统失活。因此, 我们的技术为这些药物如何直接影响头部部分提供了新的洞察。
有几个关键步骤。首先, 正如协议中所说, 我们强烈建议在一小时内准备一个盘子, 两双手准备盘子。根据我们的经验, 及时准备 ocr 测量的质量和稳定性会更好。当使用时间过长时, 低 ocr 消耗井的发生率不断增加, 稳定 ocr 的持续时间也较短。其次, 重要的是要进行质量检查, 并确保不同样品之间的实验条件相似 (ph 值、氧气水平)。最后, 关键的一步是选择正确的算法来分析样本。正如我们所证明的, 默认的 akos 算法在以高速度消耗氧气的样本中产生了误导, 有时甚至是相反的计算。因此, 我们强调检查原始数据的氧气水平和比较由此产生的 ocr 的重要性。
目前, 此技术有几个限制。在室温下, 机器加热温度高达 31°c (这是机器在室温下的最小测量温度), 这可能代表飞头25的应力状态.然而, 这可以通过将机器放在一个寒冷的房间来克服, 这将使测量在 25°c, 因此没有可能的热压力飞头。最近的报告表明, 将机器放置在 11°c, 从而能够在 25°c21 记录苍蝇的 ocr。然而, 飞头分离应在室温下进行。此外, 温度波动使控制 ph 值变化具有挑战性, 因此强烈建议使用类似的实验装置来测试生理条件/药物对 ocr 的影响。此外, 非线粒体无关机制对耗氧量的贡献尚未确定 26.通过使用各种有效的呼吸抑制剂在飞头, 将有可能建立这样的非线粒体耗氧率。
值得注意的是, 各种哺乳动物疾病的特点是能量代谢的改变。其中包括以代谢减少为特征的疾病, 如阿尔茨海默氏症或代谢重新布线, 如癌症。有趣的是, kdac 抑制剂既用于阿尔茨海默氏症, 也用于癌症治疗27。虽然 kdac 抑制剂实现治疗方面的确切机制仍不清楚, 但我们技术的数据支持了这样的抑制剂可能调节新陈代谢的新概念。
总之, 该方法对于测量体内总耗氧率具有重要价值, 更准确地显示药物对一般代谢的影响, 这在孤立的线粒体协议12 中可能被忽略。例如, 从这种方法而不是以前的技术中获得的结果, 涉及到对 kdac 治疗中年龄相关的代谢不灵活的新见解。虽然需要做更多的工作来优化飞头的实验条件, 但我们的技术和适当的分析结合起来, 可能会进一步阐明整个活组织中的线粒体活性。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢安德烈亚斯·拉杜纳、卡拉·马尔古利斯和他们的团队提供的广泛实验支持。我们感谢凯特琳·翁德拉切克对手稿的评论。我们要感谢索菲亚·维克斯特罗姆协助我们建立了这一技术的早期阶段。我们还感谢梅·桑德霍夫的技术帮助。lb 由德国联邦教育和研究部资助 (基础设施赠款 01kx1012)。sp 由 axa 研究基金博士后研究金和国家自然科学基金 (赠款 81870900) 供资。avv 由 qbm 提供资金。
Glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered |
XF assay Medium | Agilent | 103575-100 | Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4 |
Sodium butyrate | Merck | 817500 | Dissolved in XF assay buffer |
Seahorse XF24/e24 analyzer | Agilent | ||
XF24/e24 Extracellular Assay Kit | Agilent | 100850-001 | Cartridge |
XF24/e24 Islet Capture Microplates | Agilent | 101122-100 | Plate |
Seahorse Capture Screen Insert Tool | Agilent | 101135-10 | Insertor |
Petri dish | Sarstedt | 821,472 | Petri dish 92 x 16 mm |