Måling af ændringer i stofskifte er centrale for forståelse progression af forskellige sygdomme og aldring. Vi præsenterer her, en ny teknik til at måle hele hovedet iltforbrug, der nærmere ligner det fysiologiske tilstand og kan støtte i afslører nye lægemidler, der ændrer mitokondrie-aktivitet.
Regulerede metaboliske aktivitet er afgørende for den normale funktion af levende celler. Ændret metabolisk aktivitet hænger faktisk aarsagsforbundet med progression af kræft, diabetes, neurodegeneration og aldring at nævne nogle få. For eksempel, er ændringer i mitokondrie-aktivitet, cellens stofskifte kraftcenter, blevet karakteriseret i mange sådanne sygdomme. Generelt, ilt forbrug satser af mitochondrier blev betragtet som en pålidelig udlæsning af mitokondrie-aktivitet og målinger i nogle af disse undersøgelser var baseret på isolerede mitochondrier eller celler. Sådanne forhold kan ikke repræsentere kompleksitet en hel væv. For nylig, har vi udviklet en ny metode, der muliggør dynamisk måling af ilt forbrug satser fra hele isolerede flyve hoveder. Ved at benytte denne metode, har vi indspillet lavere ilt forbrug satser hele hovedet-segmentet i unge versus alderen fluer. For det andet har vi opdaget at lysin deacetylase hæmmere hurtigt ændre iltforbrug i hele hovedet. Vores nye teknik kan derfor støtte i afdække nye egenskaber af forskellige stoffer, som kan påvirke stofskifte. Vores metode kan desuden give en bedre forståelse af metaboliske adfærd i en eksperimentel opsætning, der mere ligner fysiologiske stater.
Regulerede metaboliske aktivitet er afgørende for overlevelsen af celler og sunde funktion af en væv. Dereguleret metaboliske aktivitet har udstrakt grad vist sig at være knyttet til debut og progression af forskellige maladies1. For eksempel, lavere metaboliske aktivitet var tidligere beskrevet i neurodegenerative sygdomme som Alzheimers og alder-associerede hukommelse nedskrivninger2,3. Derudover menes mitokondriel dysfunktion at være kausalt involveret i den aldrende proces4,5. På den anden side var højere mitokondrie og metaboliske priser beskrevet i kræft celler6, hvor brugen af mitokondrie hæmmere reduceret tumordannelse7.
En udlæsning af metaboliske aktivitet er ilt forbrugssats (OCR) af mitokondrier. Interessant, denne type af udlæsning er primært fremstillet af isolerede mitochondrier eller celler, således at størstedelen af hvad er beskrevet i litteraturen er hovedsagelig baseret på en udlæsning, der ikke ligner den fysiologiske tilstand. Der er dog flere ulemper til denne teknik. Først kan protokollen af mitokondrie isolation potentielt skade dens integritet8, som kan være en relevant artefakt, når man sammenligner mitokondrier isoleret fra unge versus ældre væv9. Derudover isolation processen er lang og kan resultere i tab af relevante protein posttranslationelle modifikationer, der regulerer mitokondrie funktion9,10,11. Desuden har det vist at isolerede mitochondrier ikke konsekvent repræsenterer hele væv stofskifte12,13. Sådanne cellulære biologisk kompleksitet kan ses som, “hele er større end summen af dens dele”, dvs, mitokondrier kan vise forskellige stofskifte inde i en kompleks celle sammenlignet med deres stofskifte når isoleret.
Mens celler kan tilbyde en bedre OCR udlæsning end isolerede mitochondrier, kan celle til celle kommunikation inden for rammerne af en hel væv gå tabt. F.eks. den metaboliske aktivitet af neuroner i hjernen er stærkt afhængige af den metaboliske aktivitet af omkringliggende gliaceller14. Som sådan, kan om oprettelse af nye teknikker til at undersøge OCR i hele væv eller hele organismer bevise mere indsigtsfulde for debut og progression af forskellige lidelser.
For nylig, er der opstået nye teknikker for at løse disse problemer og aktiverer måling af OCR fra hele væv, segment eller levende organismer. For eksempel, rapporteret værk ilt måling fra en Bille flyvningen muskler ved hjælp af en permeabilized fiber tilgang med en respirometer15. Nye maskiner til mikro-respirometri tillader måling af OCR pancreas Holme16,17. Derfor, det er blevet rapporteret, at denne teknologi muliggør måling af OCR fra hele orme18 og Zebra fisk19. Men tilstedeværelsen af fordøjelsessystemet barrieren kan udgøre en udfordring til at teste forskellige stoffer i forbindelse med OCR ændringer. Interessant, har de seneste rapporter fra Neville og kolleger vist en ny teknik til måling af enkelt drosophila larve hjernen med godt plade20,21.
I denne undersøgelse, har vi brugt en lignende setup hen til muliggøre måling af hele OCR fra hele levende og ikke-mobile Drosophila22. Denne teknik tilbyder også en sekundær fordel i at måle virkningerne af forskellige narkotika på metaboliske aktivitet i en hel segment, uden at skulle passere gennem fordøjelsessystemet barriere13,22. Eksempelvis blev det tidligere påvist, at direkte indsprøjtning af lysin deacetylase hæmmer (KDACi), en medicin menes for at ændre epigenetiske mekanisme i hjernen, resulterede i en forbedret erindringer dannelse23. Men ved hjælp af vores nye teknik, vi opdagede, at KDAC hæmning resulterede i en hurtig stigning af OCR, som kan være en medvirkende faktor i sig selv i den neuronal aktivitet. Vores protokol giver en enkel og roman metode til at vurdere virkningerne af forskellige stoffer, genetisk manipulation eller fysiologiske stater (sygdom, aldring) på OCR i forbindelse med en hele hovedet.
Vores nye teknik tilbyder en ny tilgang for at studere metaboliske ændringer i aldring og sygdom i forbindelse med hele flyve hoved segmenter22. Metoden kan også være egnet til at undersøge virkningen af KDAC natrium butyrat på iltforbrug. Som vi har påvist, resultere lysin deacetlyase hæmmere (HDAC’er/KDACs) i OCR ændringer. Det væsentlige mål af disse inhibitorer er normalt ikke lokaliseret i mitokondrierne (disse hæmmere ikke indflydelse klasse III deacetyltransferase, sirtuiner)24, sådanne lægemidler kan kun testes på et mindst væv niveau. Faktisk, forskellige narkotika er injiceres direkte til hjernen, derved omgåelse mulig behandling/ændring/inaktivering af fordøjelsessystemet. Som sådan, tilbyder vores teknik roman indsigt i hvordan sådan narkotika direkte indvirkning hoved-segmentet.
Der er flere kritiske trin. Først, som anført i protokollen, vi varmt anbefale forbereder en plade under en time, med to par hænder forbereder pladen. Fra vores erfaring er kvalitet og stabilitet af OCR målinger bedre, når forberedt i tide. Når man tager alt for lang, stiger forekomsten af lav OCR tidskrævende brønde og kortere varighed af stabil OCR. For det andet er det vigtigt at foretage en kvalitetskontrol af og sikre, at de eksperimentelle betingelser mellem forskellige prøver er lignende (pH, ilt niveauer). Endelig, en kritisk trin er at vælge den korrekte algoritme til at analysere prøverne. Som vi har påvist, givet standard AKOS algoritme en vildledende og sommetider modstridende beregning i prøver, der forbruges ilt ved høje priser13. Vi understreger derfor betydningen af at kontrollere de rå data for iltindholdet og sammenligne den deraf følgende OCR.
I øjeblikket, er der flere begrænsninger med denne teknik. Ved stuetemperatur, maskinen varmer op til 31 ° C (dette er den minimale måle temperatur mens maskinen er ved stuetemperatur), som kan repræsentere en stress tilstand for flyve hoveder25. Dette kan dog løses ved at placere maskinen i et koldt rum, hvorved målingerne ved 25 ° C og dermed uden en mulig varmestress at flyve hoveder. Seneste rapport har vist placere maskinen på 11 ° C, således at OCR-optagelse af fluer på 25 ° C21. Ikke desto mindre bør flyve hoved adskillelse udføres ved stuetemperatur. Derudover temperatursvingninger gør det udfordrende at kontrollere pH-ændringer og derfor er det stærkt anbefales at teste virkningen af fysiologiske betingelser/narkotika på OCR ved hjælp af lignende eksperimentelle opsætninger. Derudover er bidrag af iltforbrug af ikke-mitokondrie-uafhængige mekanismer endnu ikke etableret26. Ved hjælp af forskellige respiratorisk hæmmere, der er effektiv i flyve hoveder, ville det være muligt at etablere sådanne ikke-mitokondrie ilt forbrug satser.
Det er bemærkelsesværdigt, at forskellige pattedyr maladies er karakteriseret ved ændringer i energimetabolisme. Blandt dem sygdomme, der er karakteriseret ved enten metaboliske reduktion såsom Alzheimers sygdom eller metaboliske rewiring som kræft. Det er interessant, anvendes KDAC hæmmere for både Alzheimers sygdom og kræft behandling27. De præcise mekanismer, af hvilke KDAC hæmmere er at opnå den terapeutiske aspekt er stadig uklart, understøtter data fra vores teknik roman forestillingen om, at sådanne hæmmere kan modulere stofskifte.
I Resumé er denne metode værdifuld for måling samlede iltforbrug satser i vivo og mere præcist viser narkotika effekter på generelle stofskifte, som kan blive overset i isolerede mitochondrier protokoller12. For eksempel, har resultaterne fra denne metode, snarere end tidligere teknikker, impliceret roman indsigter for alder-associerede metaboliske ufleksibilitet på KDAC behandling. Mens yderligere arbejde er nødvendigt at optimere de eksperimentelle betingelser for flyve hoveder, kombinationen af vores teknik og egner sig analysen kan føre til yderligere udredning af mitokondrie-aktivitet i forbindelse med hele levende væv.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Andreas Ladurner, Carla Margulis og deres hold for omfattende eksperimentel understøttelse. Vi takker Caitlin Ondracek for hendes kommentarer til manuskriptet. Vi vil gerne takke Sofia Vikstrom for at hjælpe os med at etablere de tidlige faser af denne teknik. Vi takker også kan Sanderhoff for hendes teknisk hjælp. LB er finansieret af den tyske føderale ministerium for uddannelse og forskning (Infrafrontier grant 01KX1012). SP blev finansieret af et AXA forskningsfond postdoc stipendium og NSFC (Grant nummer 81870900). AVV er finansieret af QBM.
Glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered |
XF assay Medium | Agilent | 103575-100 | Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4 |
Sodium butyrate | Merck | 817500 | Dissolved in XF assay buffer |
Seahorse XF24/e24 analyzer | Agilent | ||
XF24/e24 Extracellular Assay Kit | Agilent | 100850-001 | Cartridge |
XF24/e24 Islet Capture Microplates | Agilent | 101122-100 | Plate |
Seahorse Capture Screen Insert Tool | Agilent | 101135-10 | Insertor |
Petri dish | Sarstedt | 821,472 | Petri dish 92 x 16 mm |