Måle endringer i metabolske priser er sentrale å forstå utviklingen av ulike sykdommer og aldring. Her presenterer vi en ny teknikk for å måle hele hodet oksygenforbruk nærmere ligner fysiologisk tilstand og kan hjelpe i avslørende romanen narkotika endre mitokondrie aktivitet.
Regulert metabolsk aktivitet er viktig for normal funksjon av levende celler. Faktisk er endret metabolsk aktivitet causally forbundet med progresjon av kreft, diabetes, neurodegeneration og aldring å nevne noen. For eksempel har endringer i mitokondrie aktivitet, cellens metabolske drivkraft, vært preget i mange slike sykdommer. Vanligvis oksygen forbruk utbredelsen av mitokondrier ble betraktet som en pålitelig avlesning mitokondrie aktivitet og målinger i noen av disse studiene var basert på isolerte mitokondrier eller celler. Men kan slike forhold ikke representere kompleksiteten i en hel vev. Vi har nylig utviklet en ny metode som gjør dynamisk måling av oksygen inntak priser fra helt isolert fly hoder. Ved å benytte denne metoden, har vi registrert lavere oksygen forbruk priser av hele hodet segmentet i unge versus alderen fluer. For det andre, vi har oppdaget at lysin deacetylase hemmere raskt endre oksygenforbruk i hele hodet. Våre teknikken kan derfor hjelpe avdekke nye egenskaper av ulike stoffer som kan påvirke metabolske priser. Videre kan våre metoden gi en bedre forståelse av metabolske atferd i en eksperimentelle oppsett som mer ligner fysiologiske stater.
Regulert metabolsk aktivitet er avgjørende for overlevelse av celler og sunn funksjon av en vev. Deregulert metabolsk aktivitet har vist mye kobles til utbruddet og progresjon av ulike sykdommer1. For eksempel lavere metabolsk aktivitet ble tidligere beskrevet i nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers og alder-assosiert minne verdifall2,3. Videre antas mitokondrie dysfunksjon å være causally involvert i aldring prosessen4,5. På den annen side, ble høyere mitokondrie og metabolske priser beskrevet i kreft celler6, hvor bruken av mitokondrie hemmere redusert tumorigenesis7.
En presentasjon av metabolsk aktivitet er oksygen forbruksraten (OCR) for mitokondrier. Interessant, denne typen avlesning er primært Hentet fra isolert mitokondrier eller celler, derfor fleste av det er beskrevet i litteraturen er hovedsakelig basert på en presentasjon som ikke ligner fysiologisk tilstand. Det er imidlertid flere ulemper til denne teknikken. Først kan protokollen mitokondrie isolasjon potensielt skade sin integritet8, som kan være et relevant produkt sammenlignet mitokondrier isolert fra unge mot eldre vev9. Videre isolasjon prosessen er lang og kan resultere i tap av relevante protein posttranslational modifikasjoner som regulerer mitokondrie funksjon9,10,11. Videre har det vært vist at isolert mitokondrier ikke konsekvent representerer hele vev metabolsk priser12,13. Slik mobilnettet biologiske kompleksitet kan sees på som, “hele er større enn summen av delene”, dvs. mitokondrier kan vise ulike metabolske priser i en kompleks celle sammenlignet med sine metabolske når isolert.
Cellene kan tilbyr en bedre OCR avlesning enn isolerte mitokondrier, gå celle til celle kommunikasjon i konteksten av en hel vev tapt. For eksempel i hjernen er metabolske aktiviteten av neurons svært avhengig av metabolske aktiviteten til nærliggende gliacellene14. Som sådan, kan etablere nye teknikker for å undersøke OCR i hele vev eller hele organismer være mer innsiktsfulle for utbruddet og progresjon av ulike lidelser.
Nye teknikker har nylig dukket opp for å løse disse problemene og aktivere måling av OCR fra hele vev, segmentet eller levende organismer. For eksempel rapporterte et siste arbeid oksygen målenheten fra en bille flight muskel ved hjelp av en permeabilized fiber tilnærming med en respirometer15. Nye maskiner for mikro-respirometry tillate måling av OCR bukspyttkjertelen holmer16,17. Derfor har det blitt rapportert at denne teknologien gjør at måling av OCR fra hele ormer18 og Zebra fisk19. Tilstedeværelsen av fordøyelseskanal barrieren kan imidlertid utgjøre en utfordring for å teste ulike stoffer i sammenheng med OCR endringer. Interessant, har nye rapporter av Neville og kolleger vist en ny teknikk for å måle enkelt drosophila Larven hjernen med godt plate20,21.
I denne studien har vi brukt en lignende oppsett aktiverer måling av hele OCR fra hele levende og ikke-mobile Drosophila22. Denne teknikken tilbyr også en sekundær nytte i å måle effekten av ulike rusmidler på metabolsk aktivitet i en hele segmentet, uten å måtte gå gjennom fordøyelsessystemet barriere13,22. For eksempel var det tidligere vist som direkte injeksjon av lysin deacetylase hemmer (KDACi), et stoff antas for å endre epigenetic mekanisme i hjernen, resultert i et forbedret minner formasjon23. Men ved å bruke våre teknikken, oppdaget vi at KDAC hemming resulterte i en rask økning av OCR, som kan være en medvirkende faktor i seg selv i neuronal aktiviteten. Våre protokollen gir en enkel og romanen metode for å vurdere effekten av ulike medikamenter, genetisk manipulasjon eller fysiologiske stater (sykdom, aldring) på OCR i sammenheng med en hele hodet.
Våre ny teknikk tilbyr en ny tilnærming for å studere metabolske forandringer i aldring og sykdom i sammenheng med hele fly hodet segmenter22. Metoden kan også være egnet til å studere virkningen av KDAC natrium butyrate på oksygenforbruk. Som vi har vist, resultere lysin deacetlyase hemmere (HDACs/KDACs) i endringer av OCR. I hovedsak, som mål for slike hemmere normalt ikke er lokalisert i mitokondrier (disse hemmere ikke påvirker klasse III deacetylases, Sirtuins)24, slike medikamenter kan bare bli testet på en minst vev nivå. Faktisk er ulike rusmidler injisert direkte til hjernen, således omgåelsen mulig behandling/modifikasjon/inaktivering av fordøyelsessystemet. Som sådan, tilbyr våre teknikken romanen innsikt i hvordan slike medisiner direkte innvirkning hodet segmentet.
Det er flere viktige trinn. Først som nevnt i protokollen, anbefaler vi forbereder en plate under en time, med to par hender forbereder platen. Fra vår erfaring er kvalitet og stabilitet av OCR målinger bedre når forberedt i tide. Når du tar for lang, er forekomsten av lav OCR forbruker brønner økende, og kortere varighet av stabil OCR. Det andre, er det viktig å utføre kvalitetskontroll og sikre at eksperimentelle forhold mellom forskjellige prøver er lignende (pH, oksygen). Til slutt, et viktig skritt er å velge riktig algoritmen å analysere prøvene. Som vi har vist, gitt standard AKOS algoritmen en misvisende og noen ganger motstridende beregning i prøver som forbrukes oksygen høye13. Vi har derfor understreke viktigheten av avmerker rådata til oksygen og sammenligne det resulterende OCR.
I dag er det flere begrensninger med denne teknikken. I romtemperatur, maskinen varmer opp til 31 ° C (dette er minimal måler temperaturen mens maskinen er i romtemperatur), som kan representere en stress tilstand for fly hoder25. Dette men kan overvinnes ved å plassere maskinen på et kaldt rom, som vil gjøre målinger ved 25 ° C og derfor uten en mulig varmestress på fly hodet. Fersk rapport har vist å plassere maskinen på 11 ° C, dermed aktivere OCR innspillingen av fluer på 25 ° C-21. Likevel skal fly hodet separasjon utføres ved romtemperatur. Videre temperatursvingninger gjør det utfordrende å kontrollere pH endringer og derfor er det sterkt anbefalt å teste effekten av fysiologiske forhold/narkotika på OCR ved hjelp av lignende eksperimentelle oppsett. I tillegg er bidrag av oksygenforbruk av ikke-mitokondrie-uavhengig mekanismer ennå ikke etablert26. Ved å bruke ulike åndedretts hemmere som er effektive i fly hoder, ville det være mulig å etablere slike ikke-Mitokondrielt oksygen forbruk priser.
Det er bemerkelsesverdig at ulike pattedyr sykdommer er karakterisert av endringer i energi metabolisme. Blant dem er sykdommer som er preget av enten metabolske reduksjon som Alzheimers sykdom eller metabolske rewiring som kreft. Interessant, brukes KDAC hemmere for både Alzheimers sykdom og kreft behandling27. Mens nøyaktig mekanismer av som KDAC hemmere oppnår den terapeutiske aspektet forblir uklart, støtter dataene fra våre teknikk romanen oppfatningen at slike hemmere modulere metabolisme.
I sammendraget er denne metoden verdifulle for måle samlede oksygenforbruk priser i vivo og mer nøyaktig viser narkotika effekter på generelle metabolisme, som kan bli oversett i isolerte mitokondrier protokoller12. Resultatene fra denne metoden, snarere enn tidligere teknikker, har for eksempel medvirkende romanen innsikt for alder-assosiert metabolske manglende fleksibilitet ved KDAC behandling. Mens kodeoppgraderingen å optimalisere eksperimentelle forhold for fly hoder, kombinasjonen av våre teknikk og egnet analyse kan føre til ytterligere forklaring av mitokondrie aktivitet i forbindelse med hele levende vev.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Andreas Ladurner, Carla Margulis og deres team for omfattende eksperimentell støtte. Vi takker Caitlin Ondracek for hennes kommentarer på manuskriptet. Vi vil gjerne takke Sofia Vikstrom for å hjelpe oss i å etablere de tidlige fasene av denne teknikken. Vi takker også kan Sanderhoff for hennes teknisk hjelp. LB er finansiert av tysk Federal Utdannings- og forskning (Infrafrontier grant 01KX1012). SP ble finansiert av en AXA Research Fund postdoktorstipend og NSFC (bevilgning nummer 81870900). AVV er finansiert av QBM.
Glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered |
XF assay Medium | Agilent | 103575-100 | Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4 |
Sodium butyrate | Merck | 817500 | Dissolved in XF assay buffer |
Seahorse XF24/e24 analyzer | Agilent | ||
XF24/e24 Extracellular Assay Kit | Agilent | 100850-001 | Cartridge |
XF24/e24 Islet Capture Microplates | Agilent | 101122-100 | Plate |
Seahorse Capture Screen Insert Tool | Agilent | 101135-10 | Insertor |
Petri dish | Sarstedt | 821,472 | Petri dish 92 x 16 mm |