Alterações nas taxas metabólicas de medição é fundamental para compreender a progressão de várias doenças e envelhecimento. Aqui, apresentamos uma nova técnica para medir o consumo de oxigênio de toda a cabeça que mais de perto se assemelha o estado fisiológico e pode ajudar a revelar novos medicamentos que modificam a atividade mitocondrial.
Regulamentada a atividade metabólica é essencial para o funcionamento normal das células vivas. Na verdade, a atividade metabólica alterada causalmente está ligada com a progressão do câncer, diabetes, neurodegeneração e envelhecimento, para citar alguns. Por exemplo, alterações na atividade mitocondrial, potência metabólica da célula, foram caracterizadas em muitas dessas doenças. Geralmente, as taxas de consumo de oxigênio da mitocôndria foram consideradas uma leitura confiável de atividade mitocondrial e medições em alguns desses estudos foram baseadas em mitocôndrias isoladas ou células. No entanto, tais condições não podem representar a complexidade de um tecido inteiro. Recentemente, temos desenvolvido um novo método que permite a medição dinâmica de taxas de consumo de oxigênio de chefes de voar toda isolada. Utilizando este método, gravamos menores taxas de consumo de oxigênio do segmento toda cabeça em jovens contra envelhecido moscas. Em segundo lugar, descobrimos que os inibidores de lisina deacetilase alteram rapidamente o consumo de oxigênio em toda a cabeça. Nossa nova técnica, portanto, pode ajudar na descobrindo novas propriedades de diversas drogas, que podem afetar o ritmo metabólico. Além disso, nosso método pode dar uma melhor compreensão do comportamento metabólico em uma instalação experimental que se assemelha mais a Estados fisiológicos.
Regulamentada a atividade metabólica é essencial para a sobrevivência das células e função saudável de um tecido. Atividade metabólica desregulamentada extensivamente demonstrou estar ligada ao aparecimento e progressão de várias doenças1. Por exemplo, a baixa atividade metabólica anteriormente foi descrita em doenças neurodegenerativas, como Alzheimer e deficiência de memória associada a idade2,3. Além disso, a disfunção mitocondrial é acreditada para ser causalmente envolvidos no envelhecimento processo4,5. Por outro lado, maiores taxas metabólicas e mitocondriais foram descritas no câncer células6, onde o uso de inibidores mitocondriais reduzido tumorigênese7.
Uma leitura de atividade metabólica é a taxa de consumo de oxigênio (OCR) da mitocôndria. Curiosamente, este tipo de leitura é obtido principalmente mitocôndrias isoladas ou células, assim, a maioria do que é descrito na literatura baseia-se principalmente uma leitura que não se assemelham o estado fisiológico. No entanto, existem várias desvantagens para esta técnica. Em primeiro lugar, o protocolo de isolamento mitocondrial pode potencialmente prejudicar sua integridade8, que pode ser um artefato relevante quando se comparam as mitocôndrias isoladas de jovens contra os tecidos mais velhos9. Além disso, o processo de isolamento é longo e pode resultar em perda de modificações posttranslational proteína pertinente, que regulam a função mitocondrial9,10,11. Além disso, verificou-se que mitocôndrias isoladas não representam consistentemente todo tecido taxas metabólicas12,13. Tal complexidade biológica celular poderia ser vista como, ‘o todo é maior que a soma das suas partes’, ou seja, as mitocôndrias podem exibir diferentes taxas metabólicas dentro de uma célula complexa, em comparação com sua taxa metabólica quando isolado.
Enquanto as células podem oferecer uma melhor leitura de OCR que mitocôndrias isoladas, célula a célula comunicação no contexto de um tecido inteiro pode ser perdida. Por exemplo, no cérebro, a atividade metabólica dos neurônios é altamente dependente da atividade metabólica dos vizinhos células gliais14. Como tal, estabelecer novas técnicas para investigar o OCR no tecido inteiro ou todo organismos pode provar mais perspicaz para o início e a progressão de várias doenças.
Recentemente, novas técnicas surgiram para solucionar esses problemas e permitir a medição de OCR de todo tecido, segmento ou organismos vivos. Por exemplo, um trabalho recente relatou a medição de oxigênio de um músculo de voo do besouro, usando uma abordagem de fibra permeabilized com respirometer15. Novas máquinas para microrespirometria permitem a medição de OCR de ilhotas pancreáticas16,17. Consequentemente, foi relatado que esta tecnologia permite a medição de OCR de toda vermes18 e peixe-Zebra19. No entanto, a presença da barreira digestiva pode representar um desafio para testar várias drogas no contexto de alterações de OCR. Curiosamente, relatórios recentes por Neville e colegas mostraram uma nova técnica para medir o cérebro de larva drosófila único com o prato bem20,21.
Neste estudo, usamos uma instalação similar para permitir a medição de OCR toda por toda vida e não-móveis da drosófila22. Esta técnica também oferece uma vantagem secundária em medir o impacto das diversas drogas na atividade metabólica em um segmento inteiro, sem ter que atravessar a barreira de sistema digestivo13,22. Por exemplo, foi previamente demonstrado que injeção direta de inibidor de deacetilase de lisina (KDACi), acreditava que uma droga para alterar o mecanismo epigenético no cérebro, que resultou em uma melhoria memórias formação23. No entanto, usando a nossa nova técnica, descobrimos que a inibição KDAC resultou em um aumento rápido de OCR, que pode ser um fator contribuinte por si só na atividade neuronal. Nosso protocolo fornece um método simples e inovador para avaliar o impacto de várias drogas, manipulação genética ou Estados fisiológicos (doença, envelhecimento) em OCR no contexto de uma cabeça inteira.
Nossa nova técnica oferece uma nova abordagem para estudar alterações metabólicas no envelhecimento e doença no contexto de toda mosca segmentos cabeça22. O método também pode ser adequado para estudar o impacto do butirato de sódio KDAC sobre o consumo de oxigênio. Como temos demonstrado, inibidores de deacetlyase de lisina (HDACs/KDACs) resultam em alterações de OCR. Essencialmente, como alvos de tais inibidores normalmente não são localizados na mitocôndria (estes inibidores não impactam a deacetilases de classe III, o Sirtuins)24, tais drogas apenas poderiam ser testadas em pelo menos nível de tecido. De fato, várias drogas são injetadas diretamente para o cérebro, ignorando assim possível processamento/modificação/inactivação pelo sistema digestivo. Como tal, nossa técnica oferece novos insights sobre como tais drogas diretamente impacto o segmento da cabeça.
Existem várias etapas críticas. Primeiro, tal como consta do protocolo, é altamente recomendável preparar um prato menos de uma hora, com dois pares de mãos preparando o prato. De nossa experiência, a qualidade e a estabilidade das medições OCR são melhores quando preparados em tempo hábil. Quando se toma muito tempo, a ocorrência de poços de consumo baixos OCR está a aumentar, além de mais curta duração de OCR estável. Em segundo lugar, é importante realizar uma verificação de qualidade e garantir que as condições experimentais entre várias amostras são semelhante (pH, os níveis de oxigênio). Finalmente, um passo fundamental é escolher o algoritmo correto para analisar as amostras. Como temos demonstrado, o algoritmo padrão de AKOS rendeu um cálculo enganoso e por vezes oposto em amostras que consumiu o oxigênio em altas taxas de13. Portanto, salientamos a importância de verificar os dados brutos para os níveis de oxigénio e comparar o OCR resultante.
Atualmente, existem várias limitações com esta técnica. À temperatura ambiente, a máquina aquece até 31 ° C (esta é a temperatura mínima de medição enquanto a máquina está à temperatura ambiente), que pode representar um estado de estresse para a mosca cabeças25. Isso no entanto pode ser superado, colocando a máquina em uma sala fria, o que permitirá medições a 25 ° C e, portanto, sem um stress de calor possível para as cabeças de voar. Relatório recente demonstrou a colocação da máquina a 11 ° C, possibilitando assim a gravação OCR de moscas em 25 ° C21. No entanto, a separação de cabeça voar deve ser realizada à temperatura ambiente. Além disso, as flutuações de temperatura torná-lo difícil de controlar alterações de pH e, portanto, é altamente recomendável para testar o impacto das condições fisiológicas/drogas na OCR usando configurações experimentais semelhantes. Além disso, a contribuição do consumo de oxigênio, por mecanismos não mitocondriais-independente ainda não foi estabelecida,26. Usando vários inibidores respiratórios que são eficientes na cabeça de mosca, seria possível estabelecer tais taxas de consumo de oxigênio não-mitocondrial.
Vale ressaltar que várias doenças de mamíferos são caracterizadas por alterações no metabolismo energético. Entre eles estão doenças que caracterizam-se por qualquer redução metabólica, tais como a doença de Alzheimer ou metabólica religação como o câncer. Curiosamente, os inibidores KDAC são utilizados para tanto a doença de Alzheimer e câncer tratamento27. Enquanto os mecanismos precisos pelos qual KDAC inibidores estão conseguindo o aspecto terapêutico permanecem pouco claras, os dados de nossa técnica oferece suporte a noção de romance que tais inibidores podem modular o metabolismo.
Em resumo, este método é valioso para medição do consumo global de oxigênio taxas na vivo e mais precisão exibe efeitos de drogas sobre o metabolismo geral, que podem ser ignorados em mitocôndrias isoladas de protocolos12. Por exemplo, resultados obtidos com este método, ao invés de técnicas anteriores, têm implicado novas insights para associada a idade metabólica inflexibilidade tratamento de KDAC. Enquanto trabalho adicional é necessário para otimizar as condições experimentais para voam de cabeças, a combinação de nossa técnica e a análise adequada pode levar a elucidação adicional da atividade mitocondrial no contexto dos tecidos vivos de todo.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Andreas Ladurner, Carla Margulis e suas equipes para amplo suporte experimental. Agradecemos a Caitlin Ondracek por seus comentários sobre o manuscrito. Gostaríamos de agradecer a Sofia Vikstrom para ajudar-nos em estabelecer as fases iniciais desta técnica. Agradecemos também o seco pode para sua ajuda técnica. LB é financiado pelo Ministério Federal alemão de educação e pesquisa (concessão de Infrafrontier 01KX1012). SP foi financiado por uma bolsa pós-doutorado AXA Research Fund e o NSFC (número de concessão 81870900). AVV é financiada pela QBM.
Glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered |
XF assay Medium | Agilent | 103575-100 | Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4 |
Sodium butyrate | Merck | 817500 | Dissolved in XF assay buffer |
Seahorse XF24/e24 analyzer | Agilent | ||
XF24/e24 Extracellular Assay Kit | Agilent | 100850-001 | Cartridge |
XF24/e24 Islet Capture Microplates | Agilent | 101122-100 | Plate |
Seahorse Capture Screen Insert Tool | Agilent | 101135-10 | Insertor |
Petri dish | Sarstedt | 821,472 | Petri dish 92 x 16 mm |